مع تجزئة جزيئات الحمض النووي التي تستخدم إنزيمات التقييد والتعرف عليها عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ، فإن الخطوة التالية هي ضرب (استنساخ) الشظية التي تم الحصول عليها وإخضاعها لتكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف.
وتسمى تقنية الضرب حبلا الحمض النووي PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل).
في ثمانينيات القرن العشرين ، استخدمت تقنية PCR في إنتاج آلاف النسخ من قطعة واحدة من الحمض النووي. تستخدم هذه التقنية في أنابيب الاختبار التي تحتوي على الحمض النووي وبعض المركبات الأخرى الضرورية ، مثل الاشعال (التمهيدي الحمض النووي) و إنزيم بوليميريز الحمض النووي (الانزيم الذي يجعل تكرار الحمض النووي).
ال الاشعال هم فروع الحمض النووي ، مع حوالي 20 قاعدة (A ، T ، C ، G) مكملة ، أي أنها ترتبط بالتكامل مع بداية تسلسل الحمض النووي المضروب. عندما يتم مضاعفة جزيء الحمض النووي ، يجب الفصل بين الشرائط المزدوجة ، وبالتالي تشكيل خيطين مختلفين ولكن متكاملين. سيكون كل شريط بمثابة قالب للازدواجية ، لذلك نحن بحاجة إلى نوعين مختلفين من الاشعال (انظر الشكل)
تقنية PCR ، خطوة بخطوة
يتم الحصول على الحد الأدنى من عينة الحمض النووي من خلية بشرية.
- توضع عينة الحمض النووي ، إنزيم النسخ المتماثل (بوليميريز الحمض النووي) ، نيوكليوتيدات الحمض النووي ، والاشعال التكميلي للحمض النووي في أنبوب اختبار.
- يتم وضع أنبوب الاختبار في جهاز PCR (جهاز يرفع ويخفض درجة الحرارة وفقًا للبرنامج). تتم خطوات التدفئة والتبريد التالية داخل الماكينة التي يتحكم فيها البرنامج.
- يتم تسخين الأنبوب إلى 94 درجة مئوية لإسقاط (فصل الفصل المزدوج) الحمض النووي.
4. كل حبلا واحد من الحمض النووي المشوه يعمل كقالب لتوليف فروع جديدة مكملة. لهذا ، يتم تبريده إلى درجة حرارة 54 درجة مئوية حيث تدق البادئات إلى بداية الشريطين البسيطين ، وتكون بمثابة بادئات لإنزيم البلمرة.
5. يتم إعادة تسخين الأنبوب إلى 72 درجة مئوية (درجة حرارة تشغيل بوليميريز الحمض النووي المثالية) لتكرار الشريط. يبدأ بوليميريز الحمض النووي ، بعد نهاية التمهيدي ، في وضع النيوكليوتيدات الحرة على شرائط الحمض النووي عن طريق ربطها معًا ، وبالتالي تكوين حبلا مزدوج جديد.
