معلومة

معادلة للتنبؤ الدقيق بعائد PCR

معادلة للتنبؤ الدقيق بعائد PCR



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إنها عبارة مبتذلة لمختبرات البيولوجيا الجديدة للإشارة إلى أن "كل دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل تضاعف الحمض النووي ، وبالتالي فإن العائد سيكون $ 2 ^ {cycles} $ ضعف مبلغ النموذج". ومع ذلك ، إذا كان هذا صحيحًا ، فإن 1 نانوغرام من القالب سيولد حوالي 35 مليار نانوغرام بعد 35 دورة ، أو 35 جرامات من الحمض النووي. من الواضح أن هذا أمر سخيف وليس هذا هو الحال.

بالطبع ، فإن ادعاء قوة 2 هو تبسيط إجمالي مفرط (إذا كان هناك أي شيء ، فهو الحد الاعلى - ولكن مع ذلك ، غير مفيد للغاية) ، وفي الممارسة العملية ، ستكون الغلة أقل بكثير من ذلك للأسباب التالية:

  • كل مزدوج من الحمض النووي لا يفسد في كل دورة
  • لا ترتبط المواد الأولية بكل جزيء من الحمض النووي في كل دورة
  • لا يتم ربط كل خيط DNA بالبوليميراز في كل دورة
  • ليس كل بوليميراز يرتبط بإكمال المنتج بأكمله في الوقت المناسب في كل دورة
  • يثبط التفاعل نفسه عن طريق استنفاد dNTPs
  • تبطل الحرارة التفاعل عن طريق تحلل الإنزيم

في الواقع ، غالبًا ما يتبع الفحص السريع لمخرجات qPCR حركية التشبع:

من الواضح أن الطرق الرياضية لنمذجة qPCR متطورة بشكل جيد.

سؤالي حول PCR العادي: هل من الممكن الحصول على توقع معقول لعائد النانوجرام لـ PCR عادي يتم إجراؤه في دورة منضدية ، مع كواشف PCR نموذجية؟

على سبيل المثال ، عند التضخيم من البلازميد ، أود حساب عدد الدورات التي يجب القيام بها ، ومقدار القالب الذي يجب استخدامه ، ومقدار المنتج المراد تحميله على هلام الاغاروز للتأكد من أنني سأكون قادرًا على التمييز بوضوح بين التضخيم الأسي (كلاهما تصلب المواد الأولية) ، والتضخيم الخطي (تلدين تمهيدي واحد فقط) ، ولا يوجد تضخيم (لا يمكن أن يصلب أي من البادئات أو أن التفاعل لم ينجح).


تبلغ الكفاءة المتوقعة لـ PCR النموذجي 80 ٪ ، مما يعني أن كل دورة تضاعف رقم نسخة تسلسل الحمض النووي المستهدف 1.58 مرة.

أولاً ، من المنطقي الإشارة إلى كمية الحمض النووي في تفاعل البلمرة المتسلسل من حيث رقم النسخ أو من حيث حيوانات الخلد؛ ال عدد جزيئات الحمض النووي المهم هو ما يعمل به التفاعل ، وكتلة المنتج المتولدة هي دالة على طول المنتج (وبدرجة أقل ، على تكوين المنتج).

المناقشة التالية مأخوذة من عنوان URL هذا: https://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec3/pcr/p.htm

وفقًا لبيركن إلمير ، رقم النسخ تضخيم 100000 ضعف من التسلسل المستهدف للحمض النووي يمكن توقعه من تفاعل البوليميراز المتسلسل مع 0.1 نانوغرام من DNA Lambda (عزل الحمض النووي المعياري والمميز جيدًا) في تفاعل 100 ميكرولتر مع> 25 دورة من التمسخ والتليين والتمديد.

في مثال التضخيم الذي يزيد عن 100000 ضعف ، إذا كان طول الأمبليكون المستهدف 500 نقطة أساس ، فإن الوزن الجزيئي المقدر للحمض النووي المزدوج البالغ 500 نقطة أساس هو 325000 جم / مول (استنادًا إلى متوسط ​​زوج قاعدي له كتلة جزيئية تبلغ 650 جم / مول).

يبلغ طول جينوم Lamdba Phage 42502 زوجًا أساسيًا. 42502 زوج قاعدي × 650 جرام / مول / برميل = 2.762 × 10 ^ 7 جرام / مول.

0.1 نانوغرام Lambda DNA -> 0.1 × 10 ^ -9 جرام. 0.1 × 10 ^ -9 جم ÷ 2.762 × 10 ^ 7 جم / مول = 3.619 × 10 ^ -18 مول. 3.619 × 10 ^ -18 مول × NA (رقم Avogradro) = 2.179 × 10 ^ 6 نسخ ، أو 2179000 نسخة.

2.179 × 10 ^ 6 نسخ × 100،000 = 2.179 × 10 ^ 11 نسخة. 2.179 × 10 ^ 11 نسخة ÷ NA × 325000 جم / مول = 1.176 × 10 ^ -7 جرام من التسلسل. 1.176 × 10 ^ -7 جرام تساوي 0.117 ميكرو جرام أو 117 نانوجرام.

إن عائد التضخيم البالغ 100000 مرة بعد 25 دورة يعني أن القالب 1 في كل دورة سيعطي 1.58 نموذجًا للجولة التالية من التوليف.

كيف تم حساب هذا؟ إذا كان c هو عدد النسخ التي تم إجراؤها في كل جولة من التوليف ، فعندئذٍ:

c ^ 25 = 100000 = 10 ^ 5 لذا c ^ 5 = 10 وهكذا 5 (log c) = log 10 = 1 ، لذا سجل c = 0.2 و c = 1.58 (تقريبًا) (أو يمكنك حساب الجذر الخامس والعشرين لـ 100،000 في آلة حاسبة ، إذا كنت تفضل ذلك.)

إذا حصلنا على 1.58 نسخة بدلاً من الحد الأقصى النظري لنسختين ، فيمكن القول أن كفاءة التفاعل تبلغ 79٪ (لأن 1.58 / 2.00 = 0.79).

أحد أسباب أهمية هذا الحساب هو أن فقدان الكفاءة الطفيف يتم تضخيمه من خلال التضخيم. قد يبدو أن التفاعل لم ينجح إذا انخفضت الكفاءة (في كل دورة) بنسبة قليلة فقط. التحسين مهم للغاية في تفاعل البلمرة المتسلسل.


المعادلة صحيحة ، ولكن هناك حد إضافي مقارب للحد الأقصى لتركيز المنتج اعتمادًا على تركيز البداية لـ NTPs ، وأزواج القوالب والتمهيدي في المحلول أيضًا.


معادلة التنفس الخلوي

تساعد معادلة التنفس الخلوي في حساب إطلاق الطاقة عن طريق تكسير الجلوكوز في وجود الأكسجين في الخلية. إذا كنت تبحث عن معلومات حول صيغة معادلة التنفس الخلوي ، فستثبت مقالة BiologyWise التالية أنها مفيدة.

تساعد معادلة التنفس الخلوي في حساب إطلاق الطاقة عن طريق تكسير الجلوكوز في وجود الأكسجين في الخلية. إذا كنت تبحث عن معلومات حول صيغة معادلة التنفس الخلوي ، فستثبت مقالة BiologyWise التالية أنها مفيدة.

التنفس الخلوي هو عملية شائعة تقوم بها العديد من الكائنات الحية لإنتاج الطاقة وإطلاقها. إنها في الأساس عملية تقوم من خلالها الخلايا بإخفاء الجلوكوز والأكسجين إلى ثاني أكسيد الكربون والماء ، وبالتالي إطلاق الطاقة لـ ATP. يرمز ATP إلى ثلاثي فوسفات الأدينوزين وهو الطاقة الحرة التي تستخدمها الخلايا. إنه في الأساس جزيء عضوي يحتوي على روابط فوسفات عالية الطاقة. عندما يتم تمرير الفوسفات من ATP إلى جزيء آخر ، يميل هذا الجزيء إلى اكتساب الطاقة. يُعرف هذا التفاعل الذي يكتسب فيه الجزيء الطاقة باسم رد فعل مائي. يميل الجزيء الذي تتم إزالة الفوسفات منه إلى فقد الطاقة وإطلاق الحرارة. يُعرف رد الفعل هذا باسم رد فعل مفرط وينخفض ​​مستوى طاقة الجزيء.

هل تود الكتابة لنا؟ حسنًا ، نحن نبحث عن كتاب جيدين يريدون نشر الكلمة. تواصل معنا وسنتحدث.

يختلف التنفس الخلوي عن عملية التمثيل الضوئي وعادة ما يكون رد فعل هوائي يحدث في وجود الأكسجين. هناك أربع عمليات متميزة تقسم عملية التنفس الخلوي الكلي. دعونا نرى الخطوات الأربع المتضمنة بإيجاز ، قبل أن ننتقل إلى تفاصيل ما هي معادلة التنفس الخلوي.

الخطوات المتضمنة

  • تتضمن الخطوة الأولى تحلل السكر. يحدث تحلل السكر في السيتوبلازم الخلوي وهو عملية لاهوائية لا تتطلب الأكسجين. ينقسم الجلوكوز إلى جزيئين من البيروفات في عملية من 10 خطوات ينتج عنها 2 ATPs.
  • تتضمن الخطوة التالية دخول البيروفات إلى الميتوكوندريا مما يؤدي إلى إنتاج جزيئين من أسيتيل الإنزيم المساعد A وجزيئين من ثاني أكسيد الكربون.2.
  • تتضمن الخطوة الثالثة دورة حامض الستريك (CAC). هذا رد فعل من 9 خطوات يحدث داخل الميتوكوندريا. تنتج التفاعلات 2 ATPs و 4 CO2 الجزيئات.
  • تتضمن الخطوة الأخيرة نظام نقل الإلكترون أو نظام السيتوكروم الذي يحدث بمساعدة الإنزيمات الموجودة في غشاء الميتوكوندريا الداخلي. ينتج عن هذه الخطوة الحد الأقصى لعدد جزيئات ATP ، أي 32 جزيء ATP ، مما يجعل إجمالي الطاقة المنتجة يصل إلى 36 ATPs.

تؤدي هذه التفاعلات المعقدة إلى إنتاج 36 ATPs عن طريق استخدام جزيء جلوكوز واحد وستة جزيئات أكسجين.

معادلة

تنتج معادلة التنفس الخلوي المتوازنة 36 أو 38 جزيء ATP التي تعتمد على مكافئات تقليل NADH خارج الخلية ، والتي يتم إعادة تدويرها من أجل تحلل السكر مثل الجلسرين 3- الفوسفات الذي يعطي 36 جزيء ATP ومكوك مالات أو الأسبارتات ينتج 38 ATPs.

هذه هي المعادلة المتوازنة التي تنتج الطاقة. يساعد التنفس الخلوي الخلايا على تكسير السكر مما يساعد في إنتاج الطاقة. إنها عملية تقليل الأكسدة أو تفاعل الأكسدة والاختزال. أكسدة الجلوكوز في صورة CO2 + ح2O مع إزالة الإلكترون من C6ح12ا6. اختزال الأكسجين إلى الماء مع مرور الإلكترون إلى الأكسجين هو تفاعل الاختزال. NAD + (nictotinadenine dinucleotide) هو إنزيم مساعد يتم تقليله إلى NADH ، عندما يلتقط إلكترونين وأيون هيدروجين واحد ، مما يجعله جزيء حامل للطاقة. يتم تقليل فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FAD +) إلى FADH2، مما يجعله إنزيمًا مشاركًا آخر وهو حامل الإلكترون.

معادلة التنفس الخلوي هي جزء من المسار الأيضي الذي يكسر الكربوهيدرات المعقدة. إنه تفاعل طارد للطاقة حيث يتم تكسير جزيئات الجلوكوز عالية الطاقة إلى ثاني أكسيد الكربون والماء. يُعرف أيضًا باسم تفاعل تقويضي حيث يتم تقسيم جزيء كبير مثل الكربوهيدرات إلى جزيئات أصغر.

المنشورات ذات الصلة

ترتبط عمليات التمثيل الضوئي والتنفس الخلوي ببعضهما البعض. من المهم فهم الاختلافات بين الاثنين.

التنفس الخلوي هو تقنية تنتج بها نباتات وكائنات معينة الطاقة. في مقالة BiologyWise هذه ، سنطرح شرحًا تفصيليًا حول كيفية لجوء النباتات إلى هذا & hellip

هل تريد أن تعرف كيف تقوم خلايا الجسم بتحويل الطعام إلى طاقة بمساعدة الأكسجين؟ فيما يلي نظرة عامة على الخطوات المتبعة في التنفس الهوائي. انتقل و hellip


تقييم قالب تمسخ الحمض النووي

يتم تنفيذ خطوة التمسخ الأولي في بداية PCR لفصل الحمض النووي للقالب مزدوج الشريطة إلى خيوط مفردة بحيث يمكن للبادئات الارتباط بالمنطقة المستهدفة وبدء التمديد. يساعد التمسخ الكامل للحمض النووي المدخل على ضمان التضخيم الفعال للتسلسل المستهدف خلال دورة التضخيم الأولى. علاوة على ذلك ، تساعد درجة الحرارة المرتفعة في هذه الخطوة على تعطيل البروتياز أو النيوكليزات القابلة للحرارة التي قد تكون موجودة في العينة ، مع تأثير ضئيل على بوليميرات الحمض النووي القابلة للحرارة. عند استخدام بوليميراز DNA للبدأ الساخن ، تعمل هذه الخطوة أيضًا على تنشيط الإنزيم ، على الرغم من أنه قد يوصي مورد الإنزيم بخطوة تنشيط منفصلة.

عادة ما يتم تنفيذ خطوة التمسخ الأولي عند 94-98 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق. يمكن أن يختلف وقت ودرجة حرارة هذه الخطوة اعتمادًا على طبيعة قالب الحمض النووي وتركيزات الملح في المخزن المؤقت. على سبيل المثال ، قد يتطلب الحمض النووي الجيني للثدييات فترات حضانة أطول من البلازميدات ومنتجات PCR ، بناءً على تعقيد الحمض النووي وحجمه. وبالمثل ، فإن الحمض النووي الذي يحتوي على نسبة عالية من GC (على سبيل المثال ، gt65٪) غالبًا ما يتطلب فترة حضانة أطول أو درجة حرارة أعلى للتمسخ (الشكل 2). تحتاج المحاليل الوقائية ذات الأملاح العالية (كما هو مطلوب من قبل بعض بوليميراز الحمض النووي) عمومًا إلى درجات حرارة أعلى للتمسخ (على سبيل المثال ، 98 درجة مئوية) لفصل الحمض النووي مزدوج الشريطة (الشكل 3).

الشكل 2. زيادة وقت التمسخ الأولي يحسن العائد PCR لجزء 0.7 كيلو بايت غني بال GC تضخيم من عينة جدنا بشرية. تم ضبط خطوات التمسخ الأولي على 0 و 0.5 و 1 و 3 و 5 دقائق على التوالي.

بعض بوليميرات الحمض النووي مثل طق يمكن تغيير طبيعة بوليميراز الحمض النووي بسهولة من الحضانة المطولة فوق 95 درجة مئوية. للتعويض عن النشاط المنخفض في هذا السيناريو ، يمكن إضافة المزيد من الإنزيمات بعد خطوة التمسخ الأولي ، أو يمكن إضافة كمية أعلى من الموصى بها من بوليميريز الحمض النووي في البداية. الإنزيمات عالية الحرارة مثل تلك المشتقة من العتيقة قادرة على تحمل درجات الحرارة المرتفعة لفترات طويلة وتظل نشطة طوال فترة تفاعل البوليميراز المتسلسل (تعرف على المزيد حول خصائص بوليميريز الحمض النووي).


نتائج

تحليل SMs أ. nidulans على الوسط الصلب المركب يحدد 42 مركبًا.

في البداية ، قمنا بتقييم إنتاج SMs على أربعة وسائط صلبة مختلفة (أجار دقيق الشوفان (OTA) ، وخلاصة سكروز الخميرة (YES) ، والتحلل التلقائي لخميرة Czapek (CYA) ، و CYA مع 50 جم / لتر من السكروز كلوريد الصوديوم (CYAS) المواد والأساليب] في 4 و 8 و 10 د. كان الهدف من هذا هو تحديد مجموعة مختارة من الوسائط التي (أنا) قدم أكبر عدد ممكن من الرسائل القصيرة المُنتجة ، (ثانيا) أظهر واحدًا أو أكثر من الرسائل القصيرة الفريدة لكل وسيط ، و (ثالثا) لديها SMs تم إنتاجها فقط على اثنين من الوسائط المختارة.

يجب أن تسمح لنا هذه الخصائص بالحصول على أكبر عدد ممكن من مجموعات الجينات النشطة ، بالإضافة إلى ضمان ملفات تعريف إنتاج فريدة لأكبر عدد ممكن من مجموعات الجينات SM.

من هذا التحليل الأولي ، اخترنا وسائط YES و CYA و CYAS لتنميط النسخ. على هذه الوسائط ، تمكنا من فصل واكتشاف 59 SMS فريدًا ، يمكننا تسمية 42 منها بالمقارنة مع مكتبتنا الداخلية الواسعة من المستقلبات الميكروبية (31) وقاعدة بيانات المنتجات الطبيعية AntiBase 2010. استوفى ملف إنتاج المركبات المعايير الثلاثة المذكورة أعلاه (الشكل 1 والشكل S1 ومجموعة البيانات S1).

تم العثور على مخطط Venn لـ SMs على ثلاث وسائط صلبة مختلفة. يتم فرز عدد المستقلبات المختلفة وفقًا للوسائط التي تم تحديد المستقلبات عليها. يتم ملاحظة عدد المستقلبات التي لا يمكن تحديدها بثقة بين قوسين. يمكن العثور على التفاصيل في Dataset S1 ، والتركيبات الكيميائية موضحة في الشكل S1.

توليد خلاصة وافية متنوعة للتعبير الجيني لـ أ. nidulans.

تم أخذ عينات للتنميط النسخي من اللوحات المزروعة بالتوازي مع تلك الخاصة بملف SM أعلاه. تم تنقية الحمض النووي الريبي ، وتحضيره لوضع العلامات عليه ، وتهجينه إلى مصفوفات Agilent Technologies المصممة خصيصًا بناءً على الإصدار 5 من أ. nidulans شرح (32).

تم دمج البيانات المنتجة مع بيانات ميكروأري المنشورة مسبقًا من أ. nidulans زراعة المفاعلات الحيوية (33 ، 34) لتشكيل خلاصة ميكروأري تغطي مجموعة متنوعة من الظروف ، تضم 44 عينة في المجموع. تتضمن المجموعة أربع سلالات من أ. nidulans. يتم تضمين أربع وسائط نمو مختلفة: ثلاث وسائط معقدة (انظر أعلاه) وواحد أدنى متوسط. تشمل الاختلافات المتوسطة خمسة مصادر مختلفة للكربون (الإيثانول ، الجلسرين ، الزيلوز ، الجلوكوز ، والسكروز) ، بالإضافة إلى مستخلص الخميرة. الخلاصة المدمجة لبيانات التعبير متاحة في Dataset S2.

التعريف القائم على الارتباط لمجموعات الجينات.

لتحديد مجموعات الجينات بكفاءة حول تركيبات SM ، قمنا بتطوير درجة تجميع الجينات (CS) بناءً على معامل الارتباط اللحظي للمنتج بيرسون. يعطي CS الخاص بنا قيمة عددية لربط ملف تعريف التعبير لجين معين بملفات تعريف التعبير للجينات الثلاثة المجاورة مباشرة على كلا الجانبين. يعتبر الارتباط الإيجابي فقط. تتوفر قيم CS في Dataset S2.

أظهرت المحاكاة الإحصائية لتوزيع CS على مجموعة البيانات المعطاة أن قيم CS ≥2.13 تقابل معدل إيجابي كاذب قدره 0.05 (الشكل S2). لذلك ، تم استخدام CS 2.13 كمبدأ توجيهي لتحديد مدى تكتلات الجينات.

التنبؤ بمدى انتشار 51 مجموعة جينية.

تم إجراء تقييم لحجم المجموعات حول جينات SM باستخدام قائمة محسوبة مسبقًا من 66 PKSs و NRPSs و DMATS المفترضة من خوارزمية مكتشف المناطق الفريدة للمستقلب الثانوي (SMURF) (3) استنادًا إلى أ. nidulans مجموعة الجينات FGSC A4 (35). بالإضافة إلى هذه الجينات الـ 66 ، أضفنا جينًا واحدًا من الجينات prenyltransferase الموجود في الأدبيات الأولية (30) وثلاثة جينات diterpene synthase (DTS) التي تنبأ بها Bromann et al. (25) ، مما أدى إلى 70 جينًا مفترضًا للتخليق الحيوي. تم العثور على جميع الـ 25 PKSs و NRPSs و DTSs و prenyltransferases التي تم التحقق منها تجريبياً في هذه القائمة (الجداول 1-3).


معادلة للتنبؤ الدقيق بإنتاجية تفاعل البوليميراز المتسلسل - علم الأحياء

لإنشاء والتحقق من صحة توقيع النمط الجيني التنبؤي للاستجابة المرضية الكاملة (pCR) في سرطان المستقيم المتقدم محليًا (PGS-LARC) بعد العلاج الكيميائي المساعد الجديد.

الطرق والمواد

تم إجراء تسلسل كامل للإكسوم في 15 من أنسجة LARC. تم اختيار مواقع الطفرات وفقًا لبيانات تسلسل الإكسوم بالكامل والأدب. تم إجراء التسلسل المستهدف في مجموعة تدريب (ن = 202) لبناء نموذج PGS-LARC باستخدام تحليل الانحدار ، واستخدمت مجموعات التحقق الداخلية (ن = 76) وأتراب التحقق الخارجي (ن = 69) للتحقق من صحة النتائج. تمت مقارنة الأداء التنبئي لنموذج PGS-LARC مع العوامل السريرية وبين المجموعات الفرعية. يتكون نموذج PGS-LARC من 15 جينًا.

نتائج

كانت المنطقة الواقعة تحت المنحنى (AUC) لنموذج PGS في مجموعات التحقق من الصحة التدريبية والداخلية والخارجية 0.776 (0.697-0.849) و 0.760 (0.644-0.867) و 0.812 (0.690-0.915) ، على التوالي ، وأظهرت أعلى AUC والدقة والحساسية والنوعية من مرحلة cT ومرحلة cN ومستوى مستضد سرطاني مضغي ومستوى CA19-9 لتنبؤ pCR. كان الأداء التنبئي للنموذج متفوقًا على العوامل السريرية في جميع المجموعات الفرعية. بالنسبة للمرضى الذين يعانون من استجابة إكلينيكية كاملة ، كانت قيمة التنبؤ الإيجابي 94.7٪.

الاستنتاجات

تعد PGS-LARC أداة تنبؤية موثوقة لـ PCR في المرضى الذين يعانون من LARC وقد تكون مفيدة لتمكين استراتيجية الإدارة غير الجراحية في المرضى الذين يرفضون الجراحة. لديه القدرة على توجيه قرارات العلاج للمرضى الذين يعانون من احتمالية مختلفة لتراجع الورم بعد العلاج المساعد الجديد ، خاصة عند الجمع بين معايير CCR و PGS-LARC.

ساهم كل من Wei-Wei Xiao و Min Li و Zhi-Wei Guo و Rong Zhang و Shao-Yan Xi و Xiang-Guo Zhang و Yong Li بالتساوي في هذا العمل.

Ming Li و Yuan-Hong Gao من كبار المؤلفين الذين ساهموا على قدم المساواة في هذا العمل.

تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81071891 ، 81672987) مؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة قوانغدونغ (رقم 2014A030312015) برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغدونغ (رقم 2015B020232008) ، برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (لا 201508020250 ، 201604020003).

الإفصاحات: يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.


الحجم والقيود الأخرى

يعمل PCR بسهولة مع قالب DNA يصل طوله إلى 2000 زوج قاعدي. ومع ذلك ، فوق هذا الحجم ، غالبًا ما تنخفض إنتاجية المنتج ، كما هو الحال مع زيادة طول التأثيرات العشوائية مثل الإنهاء المبكر للبوليميراز ، والتي تبدأ في التأثير على كفاءة PCR. من الممكن تضخيم قطع أكبر تصل إلى 50000 زوج قاعدي مع دورة تسخين أبطأ وبوليمرات خاصة. هذه هي بوليميرات مدمجة في بروتين مرتبط بالحمض النووي المعزز للمعالجة ، مما يعزز التزام البوليميراز بالحمض النووي. [5] [6]

تشمل الخصائص القيمة الأخرى للبوليميرات الخيمرية TopoTaq و PfuC2 تعزيز الثبات الحراري والخصوصية والمقاومة للملوثات والمثبطات. [7] [8] تم تصميمها باستخدام نطاقات ربط الحمض النووي الحلزوني - اللولبي - الحلزون الفريد (HhH) من توأيزوميراز V [9] من محبي الحرارة Methanopyrus kandleri. تتغلب البوليمرات الكيميرية على العديد من قيود الإنزيمات الأصلية وتستخدم في تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر من مزارع الخلايا وحتى عينات الطعام ، وبالتالي تجاوز خطوات عزل الحمض النووي الشاقة. يساعد النشاط القوي لإزاحة حبلا للبوليميراز الهجين TopoTaq في حل مشاكل تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يمكن أن تسببها دبابيس الشعر واللوالب المزدوجة المحملة بـ G. تتميز الحلزونات ذات المحتوى العالي من G-C بدرجة حرارة انصهار أعلى ، مما يؤدي غالبًا إلى إعاقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اعتمادًا على الظروف. [10]


4. مناقشة

يتم استخدام العلاج الكيميائي المساعد الجديد أكثر فأكثر لعلاج مرضى سرطان الثدي. ويرجع ذلك إلى مزاياها في تقليل حجم الورم ، وتحسين الخيارات الجراحية ، وزيادة البقاء على قيد الحياة بشكل ملحوظ في المستجيبين. ومع ذلك ، يظل التطبيق السريري الواسع موضع تساؤل بسبب معدل الاستجابة المنخفض واحتمال حدوث آثار جانبية كبيرة. الحالة الأكثر تطرفًا هي TNBC ، وهو النوع الفرعي الأكثر عدوانية من سرطان الثدي ولديه أسوأ نتائج تنبؤية. نظرًا لعدم تجانسه ، يستجيب المرضى المصابون بـ TNBC بشكل مختلف لـ NCT. تم بذل العديد من الجهود لتطوير التواقيع التنبؤية لـ TNBC ، ولكن في الوقت الحالي ، لا يوجد توقيع تنبؤي مطبق سريريًا. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتطوير مؤشرات حيوية تنبؤية قوية لمرضى TNBC. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد ركزت على الاختلاف في برنامج تنظيم العلاج الكيميائي بين pCR و RD ، 61-63 فإن الآليات الكامنة وراء بقاء الخلايا السرطانية المقاومة لا تزال غير مفهومة جيدًا.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير إطار عمل جديد لتحديد التوقيعات الجينية التنبؤية لمرضى سرطان الثدي. لقد تحققنا من فعالية هذا الإطار من خلال إظهار أن RPS تنبأت باستجابة NCT في مرضى سرطان الثدي ، لا سيما في المرضى إيجابيين ER (الشكل 2A-C والجدول S6). بالإضافة إلى ذلك ، مقارنة بالتوقيعات التجارية ، كان لدى RPS قدرة تنبؤ قابلة للمقارنة عبر كل مجموعة بيانات فردية (الشكل 2D-E والجدول S6). ثم طبقنا إطار العمل على مرضى TNBC وقمنا بحساب TNBC-RPS. كان TNBC-RPS تنبئيًا للاستجابة في مرضى TNBC (الشكل 3A-C والجدول S7). مقارنةً بتوقيعات التنبؤ السالبة وغير المحددة الخاصة بـ ER التي تم تطويرها مسبقًا ، تفوقت TNBC-RPS على 143 توقيعًا جينيًا تنبئيًا وقدمت دقة تنبؤ قوية (الشكل 3D-F والجدول S7). من الأهمية بمكان أن يؤدي TNBC-RPS إلى ارتفاع AUC يصل إلى 0.80 في مرضى TNBC (الشكل 5A-B) وتجاوز أداء 143 توقيعًا جينيًا تنبئيًا عندما يقترن بالتنبؤات السريرية (الشكل 5C). لذلك ، نقدم إطارًا جديدًا لتحديد العلامات التنبؤية لاستجابة NCT. بالإضافة إلى ذلك ، لتسهيل الفائدة السريرية لتوقيعات RPS و TNBC-RPS ، قدمنا ​​أيضًا نسخة منقحة من هذين التوقيعين الجينيين مع عدد أقل من الجينات (الجدول S15).

حسبت الدراسات السابقة درجات التواقيع الجينية المختلفة باستخدام طريقة واحدة فقط. لا تأخذ هذه الاستراتيجية في الاعتبار التباين في الطرق المستخدمة لحساب الدرجات من توقيعات الجينات. بدلاً من استخدام هذه الاستراتيجية ذات الأسلوب الواحد الذي يناسب الجميع ، قمنا بالتحقق من صحة التوقيعات المنشورة مسبقًا من خلال تطبيق نفس الخوارزميات التي تم استخدامها لحساب درجات كل توقيع على نفس مجموعات البيانات وإعادة إنتاج أداء التنبؤ المنشور. بعد ذلك ، قمنا بتطبيق تواقيع الجينات على البيانات الوصفية للتحقق من الصحة من أجل التنبؤ. هذا جعل مقارنة دقة التنبؤ أكثر موضوعية لأننا أخذنا تأثير الطرق المختلفة في الاعتبار (الشكلان 2 و 3). في الجدول S4 ، نقدم نتائج التحقق من صحة التوقيعات السابقة. لقد حصلنا على نتائج متسقة من خلال تكرار توقيعات الجينات السابقة المنشورة في مجموعات بيانات التحقق الخاصة بهم. على الرغم من الاختلافات الطفيفة بين ص-القيمة التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا و AUC المحسوبة لدينا (من المحتمل أن يكون سببها التحديث أو طرق التطبيع المختلفة على بيانات المصفوفة الدقيقة الخام) ، أظهرنا أن نموذجنا تفوق بشكل كبير على معظم التوقيعات المبلغ عنها.

تمت دراسة آليات الاستجابة للأدوية في سرطان الثدي لسنوات عديدة ولكنها لا تزال غير مفهومة جيدًا. لقد بحثنا في العلاقة بين RPS وخصائص البيئة المكروية للورم إيجابية ER ، وكذلك بين TNBC-RPS وخصائص البيئة المكروية لورم TNBC على التوالي (الشكل 6). من الجدير بالملاحظة أن RPS حددت التغيرات في معدل تكاثر الخلايا السرطانية وتسلل الخلايا المناعية في مرضى ER الإيجابي ، وهو ما دعمته الدراسات السابقة التي توضح أن التوقيعات الجينية المرتبطة بدورة الخلية 16 و 64-66 والتسلل المناعي 67-69 ارتبطت بالاستجابة. يمكن التحقق من صحة هذه الملاحظة بشكل أكبر من خلال أداء التنبؤ بـ 143 توقيعًا جينيًا تنبئيًا. على سبيل المثال ، كان Oncotype DX ، وهو توقيع مؤلف من الجينات المرتبطة بدورة الخلية ، ودرجة وحدة الجينات المناعية للتوقيع على حد سواء تنبؤية للاستجابة في مرضى ER الإيجابي (الجدول S6). 16 ، 28 استحوذ TNBC-RPS بشكل أساسي على الوفرة النسبية للخلايا اللحمية في البيئة الدقيقة للورم. مزارع وآخرون ذكرت نتائج مماثلة في مرضى TNBC ، كذلك. 29 وفي الوقت نفسه ، استخدمنا أيضًا وفرة الخلايا اللحمية للتنبؤ بمرضى TNBC وحصلنا على AUC = 0.55 ، مما يشير إلى الدور التنبئي للخلايا اللحمية في استجابة NCT لمرضى TNBC (الشكل S3E-F). 69-72 لذلك ، توفر النتائج التي توصلنا إليها فهمًا لبيولوجيا السرطان في سرطان الثدي من خلال إظهار أي جانب (جوانب) من البيئة الدقيقة للورم قد تؤثر على الاستجابة لـ NCT.

على الرغم من أننا أظهرنا فعالية RPS و TNBC-RPS في التنبؤ بالاستجابة لـ NCT ، يمكن تحسين قوة التنبؤ والنطاق القابل للتطبيق للنموذج. بالإضافة إلى تواقيع الجينات ، تم استخدام تواقيع أخرى لتلطيخ المدينة أو نماذج التنبؤ القائمة على التصوير بالرنين المغناطيسي للتنبؤ بالاستجابة لـ NCT. 73-75 ومع ذلك ، فإننا نفتقر إلى البيانات اللازمة لمقارنة أداء توقيعاتنا بهذه الطرق أو لدمجها في النموذج من أجل تنبؤ أفضل. علاوة على ذلك ، كانت توقيعاتنا قابلة للتطبيق على التنبؤ بمزيج من مضادات الأيض- ، أنثراسيكلين ، عامل مؤلكل ، والمرضى المعالجين بالعلاج الكيميائي القائم على التاكسين ولم يتم تمديدها للتحقيق في قدرتها التنبؤية مع عوامل العلاج الكيميائي الأخرى أو عوامل العلاج المستهدفة. مع إصدار المزيد من بيانات التعبير الجيني ، قد يكون من الممكن توسيع النطاق القابل للتطبيق لتوقيعاتنا أو تطوير توقيعات جينية تنبؤية خاصة بالدواء.

باختصار ، قمنا بتطوير إطار عمل لتحديد توقيع الجين التنبئي في سرطان الثدي وحددنا توقيعين جينيين يمكن استخدامهما للتنبؤ باستجابة NCT في مرضى ER الإيجابي ومرضى TNBC على التوالي. لقد أظهرنا أن أداء RPS على مستوى مشابه للتوقيعات التجارية الحالية ، بينما تفوق TNBC-RPS على 143 توقيعًا جينيًا لمرضى TNBC في التنبؤ. والأهم من ذلك ، أن دمج RPS أو TNBC-RPS مع المتنبئين السريريين الحاليين عزز القدرة التنبؤية ، مقارنة باستخدام المتنبئين السريريين فقط. بالإضافة إلى ذلك ، استحوذت RPS و TNBC-RPS على جوانب مختلفة من البيئة الدقيقة للورم ، مما أدى إلى رؤى مثيرة حول الآليات البيولوجية المحتملة التي تؤدي إلى الاختلافات في استجابة العلاج الكيميائي. يمكن أيضًا توسيع هذا الإطار الحسابي بسهولة لتحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية في أنواع السرطان الأخرى.


معادلة التنفس الخلوي

معادلة التنفس الهوائية

تُظهر معادلة التنفس الهوائي أن الجلوكوز يتم دمجه مع الأكسجين و ADP لإنتاج ثاني أكسيد الكربون والماء و ATP:

ج6ح12ا6 (جلوكوز) + 6O2 + 36 ADP (مستنفد من ATP) + 36 صأنا (مجموعات الفوسفات) → 6CO2 + 6 ح2O + 36 ATP

في تخمير حمض اللاكتيك ، يتم تقسيم جزيء الجلوكوز إلى جزيئين من حمض اللاكتيك. يتم نقل الطاقة الكيميائية التي تم تخزينها في روابط الجلوكوز المكسورة إلى روابط بين ADP ومجموعة الفوسفات.

ج6ح12ا6 (الجلوكوز) + 2 ADP (مستنفد ATP) + 2 صأنا (مجموعات الفوسفات) → 2 CH3CHOHCOOH (حمض اللاكتيك) + 2 ATP

معادلة التخمير الكحولي

يشبه تخمر الكحول تخمر حمض اللاكتيك في أن الأكسجين ليس متقبل الإلكترون النهائي. هنا ، بدلاً من الأكسجين ، تستخدم الخلية شكلًا محوّلًا من البيروفات لقبول الإلكترونات النهائية. ينتج عن هذا الكحول الإيثيلي ، وهو ما يوجد في المشروبات الكحولية. تستخدم مصانع البيرة والمقطرات خلايا الخميرة لإنتاج هذا الكحول ، وهي جيدة جدًا في هذا النوع من التخمير.

ج6ح12ا6 (الجلوكوز) + 2 ADP (مستنفد ATP) + 2 صأنا (مجموعات الفوسفات) → 2 ج2ح5OH (الكحول الإيثيلي) + 2 CO2 + 2 ATP


نتائج

للتنبؤ بالأداء الهجين ، متوسط ​​الارتباطات (r (y، hat ) ) بين القيم المرصودة والمتوقعة في التحقق المتقاطع مع النوع 2 الهجينة كانت بين 0.74 و 0.75 لمحصول الحبوب وبين 0.88 و 0.99 لمحتوى المادة الجافة للحبوب (الشكل 2). كانت الاختلافات في متوسط ​​الارتباط بين التنبؤ مع AFLPs ، مع جميع 10k mRNAs (mRNA10k) ، ومع عينات عشوائية من 1k من أصل 10k mRNAs (mRNAr1k) مهملة. كان للتنبؤ باستخدام mRNAs تباين أصغر قليلاً حول المتوسط ​​من التنبؤ مع AFLPs. متوسط ​​أخطاء التنبؤ المطلقة (| y- hat | ) لها نفس الأحجام تقريبًا للتنبؤ باستخدام AFLPs ، وجميع 10k mRNAs وعينات عشوائية من 1k من أصل 10k mRNAs.

دقة التنبؤ للأداء الهجين من النوع 2 الهجينة (على اليسار باللون الرمادي الفاتح) واكتب 0 هجينة (صحيح ، باللون الرمادي الداكن). الارتباطات (r (y، hat ) ) بين محصول الحبوب المرصود والمتوقع ومحتوى المادة الجافة للحبوب ومتوسط ​​خطأ التنبؤ المطلق (| y- hat | ) لمجموعات المتنبئ AFLP (970 علامة AFLP) ، mRNAr1k (1000 نسخة عشوائية من mRNA) ، mRNA10k (10810 نسخة من mRNA). تعرض boxplots التوزيعات لـ 1000 عملية تحقق متقاطعة ، ميكرومتر هي الوسائل الحسابية و ض المتوسطات

بالنسبة للنوع 0 الهجينة ، كانت الارتباطات بين الأداء الهجين المرصود والمتوقع لكلا الصفتين أقل مما كانت عليه في النوع 2 الهجينة. كان متوسط ​​الارتباطات في التحقق التبادلي بين 0.54 و 0.56 لمحصول الحبوب وبين 0.29 و 0.41 لمحتوى المادة الجافة للحبوب. كانت الاختلافات في الوسيط بين مجموعات التوقع AFLP و mRNA10k و mRNAr1k صغيرة. كانت نطاقات الارتباطات كبيرة جدًا ، وفي بعض عمليات التحقق من الصحة المتقاطعة ، لوحظت ارتباطات سلبية كبيرة. كان متوسط ​​أخطاء التنبؤ المطلقة أكبر من متوسط ​​أخطاء الهجينة من النوع 2 وأظهرت قيمًا مماثلة لـ AFLPs و mRNA.

للتنبؤ بالتغاير بين الوالدين الأوسطين ، فإن وسيط (r (y، hat ) ) مع الهجينة من النوع 2 كان بين 0.81 و 0.82 لمحصول الحبوب وبين 0.90 و 0.91 لمحتوى المادة الجافة للحبوب (الشكل 3). كانت الاختلافات بين مجموعات التوقع AFLP و mRNA10k و mRNAr1k ضئيلة. متوسط ​​خطأ التنبؤ المطلق (| y- hat | ) لها نفس الأحجام تقريبًا لمجموعات التوقع الثلاث.

دقة التنبؤ للتغاير بين الوالدين المتوسطين من النوع 2 الهجينة (على اليسار باللون الرمادي الفاتح) واكتب 0 هجينة (صحيح ، باللون الرمادي الداكن). الارتباطات (r (y، hat ) ) بين محصول الحبوب المرصود والمتوقع ومحتوى المادة الجافة للحبوب ومتوسط ​​خطأ التنبؤ المطلق (| y- hat | ) لمجموعات المتنبئ AFLP (970 علامة AFLP) ، mRNAr1k (1000 نسخة عشوائية من mRNA) ، mRNA10k (10810 نسخة من mRNA). تعرض boxplots التوزيعات لـ 1000 عملية تحقق متقاطعة ، ميكرومتر هي الوسائل الحسابية و ض المتوسطات

بالنسبة للنوع 0 الهجينة ، كانت الارتباطات بين التغاير الوسطي المرصود والمتوقع بين 0.26 و 0.4 لمحصول الحبوب. بالنسبة لمحتوى المادة الجافة للحبوب ، لم يلاحظ أي ارتباط بين القيم الملاحظة والمتوقعة في التحقق المتبادل.

في تحليلات إضافية قمنا بالتحقيق في تأثير تقليل عدد متغيرات التوقع أقل من 1000. لوحظ انخفاض في دقة التنبؤ لكلتا السمتين (النتائج غير معروضة) ، وهو ما يتماشى مع نتائج [6].

لقد بحثنا أيضًا في نموذج انحدار التلال الذي قمنا فيه بتضمين 1000 mRNAs عشوائي بالإضافة إلى علامات AFLP كمتنبئات. لم نعثر على أي موقف أدى فيه الجمع بين مجموعات التوقع إلى دقة تنبؤ أكبر من استخدامها بشكل فردي (النتائج غير معروضة).


الانتماءات

قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية ، جامعة ولاية أوهايو ، كولومبوس ، أوهايو ، 43210 ، الولايات المتحدة الأمريكية

سارة إي بين وأمبير ستيفن ليندر

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

S.E.B. و S.L. وضع تصورًا وتصميمًا لمقاربة البحث ، ونمذجة البيانات وحللها ، ونفذ مصطلح التسجيل في رشيد ، وكتب الورقة.

المؤلف المراسل


شاهد الفيديو: التنبؤ باستخدام الإكسل Forecasting Using Excel (أغسطس 2022).