معلومة

هل يؤدي استخدام شعاع الأشعة فوق البنفسجية إلى تباين أضعف في الفحص المجهري الضوئي للخلايا مقارنة بالأطوال الموجية العالية للضوء المرئي؟

هل يؤدي استخدام شعاع الأشعة فوق البنفسجية إلى تباين أضعف في الفحص المجهري الضوئي للخلايا مقارنة بالأطوال الموجية العالية للضوء المرئي؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقرأ عن "نظام محدود الانعراج" على ويكيبيديا ، والذي ورد ذكره

"لزيادة الدقة ، يمكن استخدام أطوال موجية أقصر ، مثل مجاهر الأشعة فوق البنفسجية والأشعة السينية. توفر هذه التقنيات دقة أفضل ولكنها باهظة الثمن ، وتعاني من نقص التباين في العينات البيولوجية وقد تتلف العينة ".

دون إعطاء شرح أكثر تفصيلاً لماذا قد تؤدي الموجات الكهرومغناطيسية ذات الطاقة العالية إلى تباين ضعيف. لقد حاولت البحث على Google ، لكن ما زلت لا أجد إجابة مرضية. هل يمكن لأي شخص هنا أن يحيلني إلى مناقشة أكثر تفصيلاً حول هذا السؤال؟ شكرا لك.


يعتمد التباين في الفحص المجهري البصري عادةً على مواد مختلفة لها أطياف امتصاص مختلفة. عمليا كل شيء يمتص ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، لذلك يكون هناك تباين أقل في هذا النطاق مقارنة بالطيف المرئي حيث يوجد قدر أكبر من الانتقائية. كل هذا يتغير عند إضافة مواد تعزيز التباين. على سبيل المثال ، يمكن للجزيئات التي تمتص بطول موجي واحد وتصدر بطول موجة مختلف عبر التألق ، المرتبطة بالأجسام المضادة التي ترتبط بشكل انتقائي بمكونات خلية معينة ، أن توفر تباينًا عاليًا للغاية. على سبيل المثال ، راجع [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2156041/].

أسلوب الفحص المجهري البصري البديل هو الفحص المجهري على النقيض من الطور والذي لا يستخدم الامتصاص على الإطلاق. بدلاً من ذلك ، يقيس طول المسار البصري الفعال عبر العينة ، والذي يعتمد على معامل الانكسار المحلي للعينة.

بديل آخر هو الفحص المجهري للأشعة السينية ، والذي يمكنه تحديد عناصر معينة في تكوين العينة. راجع ، على سبيل المثال ، [https://www.americanlaboratory.com/913-Technical-Articles/18833-Three-Dimensional-Elemental-Imaging-Using-a-Confocal-X-Ray-Fluorescence-Microscope/].


التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية هو نوع من مطيافية الامتصاص حيث يمتص الجزيء ضوء المنطقة فوق البنفسجية (200-400 نانومتر). يؤدي امتصاص الأشعة فوق البنفسجية إلى إثارة الإلكترونات من الحالة الأرضية إلى حالة طاقة أعلى. طاقة الأشعة فوق البنفسجية التي يتم امتصاصها تساوي فرق الطاقة بين الحالة الأرضية وحالات الطاقة الأعلى (دلتا E = hf).
بشكل عام ، يكون الانتقال الأكثر تفضيلاً من المدار الجزيئي الأعلى المشغول (HOMO) إلى المدار الجزيئي الأدنى غير المشغول (LUMO). بالنسبة لمعظم الجزيئات ، فإن أقل المدارات الجزيئية المشغولة للطاقة هي المدارات s ، والتي تتوافق مع روابط سيجما. المدارات p عند مستويات طاقة أعلى إلى حد ما ، المدارات (المدارات غير المترابطة) مع أزواج الإلكترونات غير المشتركة تقع عند مستويات طاقة أعلى. المدارات غير المشغولة أو المضادة للترابط (فطيرة * وسيغما *) هي المدارات المشغولة ذات الطاقة الأعلى.
في جميع المركبات (باستثناء الألكانات) ، تخضع الإلكترونات لتحولات مختلفة. بعض التحولات المهمة ذات الطاقات المتزايدة هي: عدم الارتباط بالفطيرة * ، وعدم الارتباط بـ سيجما * ، ومن الفطيرة إلى الفطيرة * ، ومن سيجما إلى الفطيرة * ، ومن سيجما إلى سيجما *.

يخضع التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية لقانون بير لامبرت ، الذي ينص على ما يلي: عندما يتم تمرير شعاع من ضوء أحادي اللون عبر محلول مادة ماصة ، فإن معدل انخفاض شدة الإشعاع بسمك محلول الامتصاص يتناسب مع الإشعاع الساقط بالإضافة إلى تركيز المحلول.
التعبير عن قانون بير لامبرت هو-
أ = سجل (أنا0 / I) = Ecl
حيث ، A = الامتصاصية
أنا0 = شدة الضوء الساقط على خلية العينة
أنا = شدة الضوء الذي يغادر خلية العينة
C = التركيز المولي للمذاب
L = طول خلية العينة (سم).
E = الامتصاصية المولية

يتضح من قانون بير لامبرت أنه كلما زاد عدد الجزيئات القادرة على امتصاص الضوء بطول موجة معين ، زاد مدى امتصاص الضوء. هذا هو المبدأ الأساسي للتحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية.


1 المقدمة

تعتبر مؤشرات الانكسار للجزيئات الحيوية من الخصائص الأساسية التي تلعب أدوارًا رئيسية في عدد من تقنيات التصوير البصري والفحص المجهري ، والتي تشمل التصوير المقطعي البصري ، والفحص المجهري للانعكاس متحد البؤر ، والتحليل الطيفي لتشتت الضوء ، والفحص المجهري للطور الكمي [1]. يوفر تباين معامل الانكسار داخل الخلايا والأنسجة مصدر التباين لطرائق التصوير الضوئي المختلفة هذه ، والتي يمكن أن تكون مرتبطة بشكل أكبر بالسمات الهيكلية أو المورفولوجية للعينة. يعتمد معامل الانكسار للمادة على الطول الموجي ، وهو ما يُعرف بخاصية تشتت المادة. يتم التعرف على أهمية التشتت على نطاق واسع في الفحص المجهري متعدد الفوتونات والتصوير المقطعي للتماسك البصري بسبب عرض النطاق الترددي الكبير لمصدر الضوء المستخدم [2،3]. ومع ذلك ، غالبًا ما يُنظر إلى التشتت على أنه تأثير ضار يتطلب تعويضًا ، إما عن طريق البصريات أو المعالجة الرقمية اللاحقة. ومع ذلك ، كانت هناك بعض الدراسات المثيرة للاهتمام التي تستخدم تشتت معامل الانكسار للجزيئات الحيوية لتحديد التركيز الجزيئي. على سبيل المثال ، تم استخدام تشتت الهيموجلوبين لاستخراج تركيز الهيموجلوبين في خلايا الدم الحمراء السليمة [4]. في دراسة أخرى ، تم استخدام تشتت الصبغة الخارجية لفصل قياس معامل الانكسار عن قياس ارتفاع الخلايا في المجهر الرقمي المجسم [5]. ومع ذلك ، فإن معظم الجزيئات الحيوية ليس لها تشتت كبير في منطقة الطول الموجي المرئي بسبب امتصاصها المنخفض بطبيعتها [6]. سيكون من الأهمية بمكان قياس تشتت المواد الحيوية مباشرة ، بما في ذلك الخلايا ، لدراسة تركيباتها الكيميائية الحيوية.

غالبية مكونات الخلية حقيقية النواة هي البروتينات والأحماض النووية والدهون والسكريات. تتمتع كل من البروتينات والأحماض النووية بامتصاص قوي في منطقة الأشعة فوق البنفسجية الوسطى. سبق استخدام هذه الخاصية بنجاح لرسم خريطة لكميات البروتينات والأحماض النووية في الخلايا الحية [7]. ومع ذلك ، فإن التصوير مباشرة في ذروة الامتصاص يشكل تحديات كبيرة لأن الضرر الفيزيائي والكيميائي للخلية أمر لا مفر منه [8] ، وبالتالي فإن مراقبة الخلية على المدى الطويل أمر صعب للغاية. يضع هذا القيد أيضًا متطلبات صارمة على انتقال الأشعة فوق البنفسجية للنظام وحساسية الكشف للجهاز المزدوج الشحنة (CCD). علاوة على ذلك ، يمكن أن تتداخل مساهمة التشتت للمكونات الخلوية مع امتصاص الجزيئات الحيوية وتؤدي إلى تحليل خاطئ. وفقًا لعلاقة كرامرز كرونيغ ، فإن طيف معامل الانكسار أوسع بكثير من نطاق الامتصاص. لذلك ، من الممكن تصوير تشتت معامل الانكسار للخلايا البيولوجية في الأشعة فوق البنفسجية القريبة (NUV ، 300-400 نانومتر) مع تقليل الضرر الناجم عن امتصاص البروتين القوي والحمض النووي. مع وضع هذا الهدف في الاعتبار ، قمنا بتصميم مجهر طور كمي مزدوج الموجة لدراسة تشتت معامل الانكسار للخلايا الحية.

لقد أظهرنا سابقًا أن البروتينات تظهر تشتتًا كبيرًا بالقرب من ذروة الامتصاص عند 280 نانومتر [9]. هنا نُبلغ عن تصوير التشتت لخلايا حقيقية النواة الحية ، لأول مرة على حد علمنا ، في نطاق NUV باستخدام الفحص المجهري الكمي مزدوج الطول الموجي. يتم تعريف معلمة التشتت عادةً على أنها dن& # x003bb. ومع ذلك ، نظرًا لأننا نقيس فقط طولين موجيين ، من أجل البساطة ، استخدمنا معلمة بديلة لوصف التشتت: & # x003b12/& # x003b11، أين & # x003b12 و & # x003b11 هي زيادة معامل الانكسار للجزيئات الحيوية (ستتم مناقشتها بالتفصيل في قسم النتائج التجريبية) عند الأطوال الموجية المقاسة. سيتم استخدام هذا التعريف في جميع أنحاء المخطوطة. يتم أيضًا معايرة تشتت جزيئات البروتين والحمض النووي بشكل مستقل باستخدام طريقة الانعكاس الداخلي الكلي (TIR) ​​[10]. نظهر أن تشتت خلايا هيلا الحية يتوافق جيدًا مع تشتت محاليل البروتينات النقية باستخدام طريقة TIR.


الفحص المجهري البصري في التمثيل الضوئي

تتم مراجعة تقنيات الفحص المجهري الضوئي الناشئة والأكثر استخدامًا ويتم تقديم طرق توليد تباين الصور في المجهر ، مع التركيز على التباينات غير الخطية مثل التوليد التوافقي وإشعاع الإثارة متعدد الفوتونات. يقدم الفحص المجهري غير الخطي العديد من المزايا على تقنيات الفحص المجهري الخطي بما في ذلك التصوير المحسن للأنسجة العميقة والتجزئة البصرية وتصوير العينات الحية غير الملوثة. ومع ذلك ، باستثناء مضان الإثارة متعدد الفوتونات ، فإن الفحص المجهري غير الخطي في مهده ، ويفتقر إلى البروتوكولات والمستخدمين والتطبيقات ، وبالتالي تركز هذه المراجعة على إمكانات الفحص المجهري غير الخطي لدراسة الكائنات الحية الضوئية. يتم تقديم أمثلة على التصوير المجهري غير الخطي بما في ذلك مجمعات هوائيات حصاد الضوء المعزولة من النباتات العليا ، وحبيبات النشا ، والبلاستيدات الخضراء ، والطحالب أحادية الخلية كلاميدوموناس رينهاردتي، والبكتيريا الزرقاء Leptolyngbya ص. و أنابينا ص. أثناء التركيز على تقنيات الفحص المجهري غير الخطي ، والتوليد التوافقي الثاني والثالث والمجهر المجهري متعدد الفوتونات ، يتم وصف طرائق التصوير غير الخطية الأخرى الناشئة ومراجعة العديد من تقنيات الفحص المجهري البصري الخطي من أجل وصف قدراتها بوضوح وتسليط الضوء على مزايا الفحص المجهري غير الخطي.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


الآفاق المستقبلية

لقد أتاح الاستخدام المكثف لتقنيات الفحص المجهري أحادي الجزيء إمكانية تصور مجموعة هائلة من العمليات البيولوجية المختلفة التي كانت مقيدة سابقًا بواسطة طرق متوسط ​​المجموعات السكانية التقليدية. العديد من العمليات البيولوجية التي تمت دراستها هي مكونات لأنظمة أساسية وأساسية في الخلية. ومع ذلك ، فقد كانت غير مرئية بشكل أساسي حتى الآن: مشاكل "قديمة" طويلة الأمد كانت ببساطة مستعصية على الحل حتى ظهور طرق الفحص المجهري الحديثة أحادية الجزيء. قدمت الأدوات الجديدة رؤى جديدة حول الآليات الأساسية للخلايا الحية بالإضافة إلى تحديد الوظائف غير المعروفة سابقًا للجزيئات والتي تعتبر ضرورية للحياة كما نعرفها. على الرغم من الإنجازات الأخيرة في جعل غير المرئي مرئيًا ، إلا أن القيود التجريبية لا تزال قائمة. على سبيل المثال ، لا يزال من الممكن تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، خاصة عندما يكون التصوير السريع للغاية مطلوبًا لمعالجة الأسئلة البيولوجية في النطاق الزمني دون ملي ثانية. لا تزال هناك حاجة لبروتينات فلورية جديدة ذات سطوع واستقرار ضوئي محسنين مما يزيد من أوقات الإضاءة الممكنة وبالتالي يتيح مراقبة أطول للجزيئات والعمليات التي تشارك فيها. وبالمثل ، تزيد البروتينات الفلورية بشكل كبير من الحجم الكلي لبناء البروتين الموسوم ، نظرًا لأن البروتين الفلوري غالبًا ما يكون له وزن جزيئي مماثل للبروتين الأصلي نفسه ، مما قد يؤثر على توافقه الجزيئي الطبيعي وبالتالي سلوكه ووظيفته الفسيولوجية. لذلك ، الجيل القادم من الجزيئات الفلورية التي نأمل أن يصبح حجمها أصغر بكثير أو حتى يختفي تمامًا.

على سبيل المثال ، تم بالفعل إجراء محاولات لاستخدام التصوير المجسم الرقمي كتقنية مجهرية فائقة الدقة [187،188] ، مع تقديم تصوير خالٍ من الملصقات ، على سبيل المثال تفاصيل هيكلية واعدة للتشكيل الديناميكي للخيوط التي تمكّن خلايا السباحة المفردة من الحركة [ 189]. مثال آخر على تقنية خالية من الملصقات هو الفحص المجهري للتشتت المتداخل (iSCAT) بدقة جزيء واحد ، والذي تم تطبيقه مؤخرًا على مجموعة من الأسئلة البيولوجية من قبل مجموعة Kukura et al. [190191]. تم استخدام iSCAT الآن في دراسات ديناميات البروتينات الحركية [192] والتي مكنت من تصور تفكيك الأنابيب الدقيقة [193] ، وكشفت تفاصيل غير معروفة لآلية خطوة الميوسين -5 [194] ، وقدمت رؤى جديدة حول دورة خطوة كينيسين -1 [195] .

في الوقت الحالي ، لا توجد تقنية فريدة من نوعها يمكنها تمكين التصور المتزامن للبروتينات وتعديلاتها اللاحقة للترجمة ، على سبيل المثال كما يحدث أثناء نقل الإشارة. سيكون ، من حيث المبدأ ، مفيدًا أيضًا إذا تمكنا من الحصول على بيانات تتعلق بالحالات التوافقية الجزيئية للمناطق المضطربة جوهريًا أثناء تفاعلات البروتين - البروتين أو البروتين - الحمض النووي. ومع ذلك ، فقد تم بالفعل إجراء محاولات لدراسة التغييرات التوافقية الجزيئية على اضطرابات التمدد الميكانيكية من خلال الجمع بين تقنيات الفحص المجهري أحادي الجزيء مع مناهج عدم التألق. على سبيل المثال ، فرنانديز وآخرون. لقد استخدموا TIRF و AFM في وقت واحد لدراسة ديناميكيات التمدد والتكشف لمجالات بروتين يوبيكويتين [196]. تم تطبيق توليفات AFM و FRET أيضًا في دراسات تشكيل HPPK (6-hydroxymethyl-7،8-dihydropterin pyrophosphokinase) [197]. تم استخدام التحليل الطيفي لقوة الخلية المفردة المستند إلى TIRF و AFM أيضًا في الدراسات غير الميكانيكية وكشف عن تكوين كتلة بروتينية للإنتجرينات وتوظيفها للبروتين اللاصق [198].

ليس هناك شك في أن التميز العلمي في تطوير أدوات وتقنيات فيزيائية حيوية جديدة سيستمر في دفع حدود فهمنا لعمليات الحياة المعقدة إلى الوراء أكثر مما هو عليه الآن. تعد مناهج العلوم متعددة التخصصات ، عند تمويلها بشكل مناسب ، أفضل طريقة للمضي قدمًا لتحقيق هذه التطورات الجديدة.


يستخدم LSCM مصدر ضوء نقطي (ليزر) وثقب صغير لرفض ضوء التركيز. إنه يتيح التقسيم البصري للعينات الملطخة بالفلوريسنت لتوفير رؤية ثلاثية الأبعاد للهيكل. لمزيد من المعلومات حول الفحص المجهري متحد البؤر ، يرجى الانتقال إلى قسم الموارد.

التطبيقات

  1. لفحص العينات ذات العلامات الفلورية لتوطين لون واحد أو متعدد للجزيئات داخل الخلية / الأنسجة.
  2. لإجراء دراسات فسيولوجية مثل التصوير النسبي وتسجيل الفاصل الزمني للخلية / الأنسجة الحية.
  3. التلاعب بالصور لإشارة التألق (على سبيل المثال FRAP (تبييض الصورة بعد استعادة التألق) FLIP (تصوير فقدان الإسفار بعد التبييض الضوئي) ، التنشيط الضوئي / التبديل ، إلخ) لدراسة حركية الجزيئات في الخلايا الحية.

يستخدم هذا النظام بشكل أساسي للكشف عن العلامات الفلورية في العينات الثابتة. ومع ذلك ، فهي مجهزة أيضًا بالملحقات الضرورية (درجة الحرارة ، ثاني أكسيد الكربون2 & # 160 الضوابط ، O2) لتصوير الخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تجهيز النظام بوحدة FCS التي تسمح أيضًا بالتصوير باستخدام كاشف Avalance Photodiode الحساس (APD ، Zeiss Confocor 3 ، انظر قسم FCS أدناه).

تم تجهيز الجهاز بكاشف طيفي يستخدم مصفوفة PMT (أنبوب مضاعف الفوتون) وعناصر صريف ضوئية لجمع المعلومات الطيفية للفلور. يمكن اكتشاف المعلومات الطيفية من 405 نانومتر إلى 720 نانومتر بحجم 10.7 نانومتر مع الإعداد. ثم ، باستخدام أداة عدم الخلط المضمنة وغير الخطية ، يمكن فصل الإشارات من الفلوروفورات المختلفة رياضياً. يلغي النظام الحاجة إلى مرشح الانبعاث ويوفر ميزة القدرة على فصل الفلوروفور بتداخل أطياف انبعاث واسعة النطاق. على سبيل المثال ، يمكن فصل GFP و YFP باستخدام هذا الإعداد (وهو أمر مستحيل مع نظام التصوير التقليدي القائم على المرشح). النظام مفيد أيضًا بشكل خاص لتصوير عينة الفلورة التلقائية للغاية مع التصوير الفلوري حيث أن التألق التلقائي له توقيع طيفي مختلف تمامًا عن الفلوروفور.

مواصفات Zeiss LSM 710

زايس AxioObserver (مقلوب)

3 PMTs مضان
1 انتقال PMT
2 APDs

هذا نظام معقد ذو إمكانيات متعددة:

  1. مجهر فائق الدقة مزود بتقنية STED (استنفاد الانبعاث المحفز) القادر على الحصول على صور مضان بدقة تصل إلى & lt50nm.
  2. مجهر Multiphoton مع ليزر قابل للضبط من 680-1064nm.
  3. نظام التصوير مدى الحياة الإسفار على أساس المجال الزمني لقياسات FLIM.
  4. نظام التحليل الطيفي المترابط الفلوريسنت للكشف عن الارتباطات الجزيئية.
  5. مزيج من البصريات ووحدة البرامج قادرة على الحصول على صور مضان وصولاً إلى & # 126120nm.

يستخدم STED ليزر استنفاد على شكل دونات لتعديل وظيفة انتشار نقطة الشعاع وصولاً إلى مستوى حد الانعراج الفرعي لتحقيق الفحص المجهري فائق الدقة بدقة أقل من 50 نانومتر (مبدأ STED). تم تجهيز النظام بأجهزة ليزر استنفاذ 594 نانومتر و 660 نانومتر و 775 نانومتر لمجموعة متنوعة من الأصباغ. للحصول على معلومات مفصلة عن النظام ، يرجى زيارة موقع Leica

يستخدم مجهر متعدد الفوتونات ليزر نابض فائق السرعة لإثارة جزيئات الفلورسنت. باختصار ، يعتمد الفحص المجهري 2 (متعدد) الفوتون على المبدأ القائل بأن جزيئات الفلورسنت المعينة التي عادة ما تكون متحمسًا فقط بامتصاص طاقة فوتون واحد بطول موجي معين يمكن أيضًا تحفيزها من خلال توليفة من الطاقات الناتجة عن الامتصاص المتزامن لـ 2 (أو متعدد) فوتونات منخفضة الطاقة ذات أطوال موجية مزدوجة (متعددة). انبعاث التألق يعتمد من الدرجة الثانية على شدة الإثارة. هذا الاعتماد الحاد لمعدل الامتصاص على تركيز الفوتون يعطي مجهر المسح بالليزر متعدد الفوتون الدقة الجوهرية ثلاثية الأبعاد مع عمق المجال المحدد من خلال:

  1. شدة ضوء الإثارة
  2. الفتحة العددية للعدسة المستخدمة
  3. الأطوال الموجية للأضواء.

هذه الدقة z قابلة للمقارنة مع المجهر المتحد البؤر المسح بالليزر التقليدي.

مزايا على المجهر متحد البؤر

  1. يسمح الطول الموجي الأطول المستخدم للإثارة بالتصوير بشكل أعمق في العينات السميكة بسبب تشتت الضوء ذي الطول الموجي الأطول (IR).
  2. يقتصر تبييض الصور وإتلافها على نقاط التركيز فقط.
  3. من الممكن تصوير صبغات الأشعة فوق البنفسجية بالأشعة تحت الحمراء. هذا مفيد بشكل خاص لتصوير الخلايا الحية حيث يكون ضوء الأشعة فوق البنفسجية ضارًا للغاية بالخلايا

لذلك ، يعد الفحص المجهري متعدد الفوتونات مناسبًا جدًا لتصوير العينات الحية السميكة.
النظام قادر أيضًا على قياس عمر التألق باستخدام الليزر النبضي المجهز. النظام مجهز بليزر أبيض نابض ويمكن ضبطه بشكل مستمر من 470-690 نانومتر بالإضافة إلى ليزر الأشعة تحت الحمراء بمدى ضبط من 680-1024 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النظام قادر على إجراء التحليل الطيفي المترابط الفلوري ، والتفكيك والتصوير عالي السرعة.

في الصورة أدناه ، تم تلوين & # 160 خلية COS ببروتين مسامي مضاد للنووي مقترن بصبغة Star635P وتم تصويره باستخدام متحد البؤر (أعلى) و STED (أسفل) في نفس المستوى البصري لإثبات التحسن في الدقة باستخدام STED (المقياس) شريط 2um).

نظام لايكا فالكون SP8 STED مع مواصفات ليزر فيمتو ثانية فيزياء الأطياف

نظام PerkinElmer UltraVIEW (PerkinElmer Life Sciences Inc. ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) هو نظام متحد البؤر لقرص الغزل Yokogawa (Yokogawa Corp. Japan) Nipkow. يستخدم قرصًا دوارًا به ثقوب متعددة لتحقيق البؤرة (على سبيل المثال ، رفض الأضواء خارج التركيز). يشير قرص Nipkow إلى قرص مسح ضوئي به حلزونات متناظرة من الثقوب التي يمر من خلالها ضوء الإضاءة. تقسم هذه الثقوب أضواء الإضاءة إلى "عوارض صغيرة" متعددة. عندما يدور القرص ، يقوم الضوء بمسح العينة بنمط نقطي. يتم الكشف عن مصابيح الانبعاث من العينة من خلال الثقب لتوليد صورة متحد البؤر للعينة التي يمكن اكتشافها (باستخدام كاميرا EMCCD (جهاز اقتران شحن متعدد الإلكترون)). نظرًا لأنه يجب وضع الثقوب الموجودة على قرص Nipkow على مسافة تصل إلى 10 أقطار من أجل تجنب مشكلة التحدث المتقاطع ، فإن معدل نقل الضوء لأقراص Nipkow التقليدية هو فقط & # 1261 ٪ من الضوء الساطع على القرص. لقد تغلب رأس الماسح الضوئي Yokogawa على هذه المشكلة باستخدام قرص جامع مبتكر يحتوي على عدسات دقيقة موضوعة أمام قرص Nipkow. تضمن العدسات الدقيقة أن معظم الضوء الذي يضيء القرص يركز على الثقوب. وبالتالي يتم زيادة كفاءة النقل من & # 1261٪ إلى 70٪ من الضوء الساقط على الأقراص مما يسمح بإضاءة العينة بكمية كافية من الضوء.

مزايا نظام UltraVIEW

يتمتع النظام بميزتين أساسيتين مقارنة بالمجهر المتحد البؤر التقليدي للمسح بالليزر:

الفحص المجهري المتحد البؤر بالمسح بالليزر (LSCM) هو نظام مسح متسلسل حيث تضاء نقطة واحدة من العينة في كل مرة ويستخدم LSCM كاشف نقطة (أنبوب مضاعف الفوتون (PMT)). لذلك ، بالنسبة لـ LSCM ، هناك حاجة إلى ماسح ضوئي باهظ الثمن والمعالجة الإلكترونية ضرورية لتشكيل الصورة. وبالتالي فإن نظام LSCM بطيء نسبيًا (عادةً 0.5-10 ثانية / إطار ، يمكن أن يستغرق المسح البطيء ما يصل إلى دقيقة / إطار). في حين أن نظام قرص Nipkow يستخدم قرص مسح متعدد النقاط وكاميرا CCD مبردة وهي عبارة عن كاشف صفيف متوازي. يتيح ذلك لنظام Nipkow الحصول على صور بسرعة أعلى (تصل إلى 360 إطارًا في الثانية) مقارنةً بـ LSCM (عادةً 0.5-1 إطار / ثانية). سيسمح ذلك بمراقبة العديد من العمليات الخلوية السريعة (مثل تصوير الكالسيوم والاتجار الحويصلي) في الوقت الفعلي. الأهم من ذلك ، لقد ثبت أن نظام قرص الغزل المتحد البؤر يقلل من السمية الضوئية والتبييض الضوئي بما يصل إلى 5 أضعاف مقارنة بـ LSCM. من المتوقع أن يكون الانخفاض في السمية الضوئية وتبييض الضوء يرجع إلى حقيقة أن النظام يقسم ضوء الليزر إلى آلاف الحزم الصغيرة.

في حين أن آلية هذا التخفيض في السمية الضوئية والتبييض الضوئي لا تزال موضوعًا للدراسة ، فإن القرص المتحد البؤر الدوار أصبح بشكل متزايد الأداة المفضلة لتصوير الخلايا الحية. النظام قوي بشكل خاص لتطبيقات مثل الفحص المجهري متحد البؤر في الوقت الحقيقي (4-D) ، وإشارات الكالسيوم ، ودراسات البروتينات الفلورية الخضراء المهرب الحويصلي.

وصف النظام

يعتمد النظام على مجهر مقلوب Zeiss Axiovert 200M مع خطوط الليزر التالية لإثارة الفلوروفور: 404 نانومتر ، 440 نانومتر ، 488 ، 514 نانومتر ، 561 نانومتر و 633 نانومتر. مزود بمحرك تركيز بيزو وجميع الملحقات الضرورية (درجة الحرارة ، أول أكسيد الكربون2) لتصوير الخلايا الحية عالية السرعة. النطاق مُثبَّت بمرحلة آلية عالية الدقة لرصد مواضع متعددة في حامل عينة واحد. تمت ترقية هذا النظام باستخدام وحدة FRAP (الاسترداد الفلوري بعد التبييض الضوئي) في عام 2009.

التطبيقات

النظام مناسب تمامًا للتصوير عالي السرعة للخلايا الحية مع انخفاض السمية الضوئية. النظام مفيد بشكل خاص للفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد لمراقبة الأحداث الخلوية السريعة بسبب سرعة التركيز / الاكتساب العالية مقارنة بالأنظمة الأخرى في المنشأة. مع وحدة FRAP ، يمكن إجراء FLIP و FRAP والتنشيط الضوئي على النظام أيضًا.

مواصفات Perkin Elmer Ultraview ERS FRAP

10x 0.3NA EC Plan-Neofluar
20x 0.8NA خطة فلوار
40x 1.3NA oil Plan-Neofluar
63x 1.2NA ماء C- أحادي اللون
63x 1.4NA Oil DIC Plan-Apochromat
100X 1.4NA ، مخطط زيت DIC-Apochromat

الصمام الثنائي: 405 نانومتر
الصمام الثنائي: 440 نانومتر
الأرجون: 458 ، 488 ، 514 نانومتر
الحالة الصلبة: 561 نانومتر
الحالة الصلبة 633 نانومتر

تقدم DIMs طرقًا بديلة لتصوير العينات البيولوجية مع مزايا التبييض المنخفض للصور ، وكفاءة الفوتون العالية والتكلفة المنخفضة نسبيًا. بالاشتراك مع deconvolution ، يمكن إجراء تصوير عالي الدقة على هذه الأنظمة.

هناك 6 إعدادات DIM في المرفق. يختلف كل منها عن الآخرين من خلال تكوين البرامج والأجهزة لأغراضها الرئيسية:

محطة خافت 1-4 & # 160 يحتوي على Metamorph (Universal Imaging Corp، Molecular Devices) ، وكاميرا CCD حساسة ومبردة (Sensicam من Optikon أو Cascade II EMCCD أو CoolSnapHQ (قياسات ضوئية)) ومجهر Zeiss (AxioImagerZ أو Axioplan IIM أو Axiovert 200M). كل منهم مجهز ببصريات DIC (تباين التداخل التفاضلي) وبصريات التألق. تم إعداد الإعدادات بشكل أساسي من أجل الفحص المجهري للفيديو الفلوريسنت منخفض المستوى. يمكن لجميع هذه المجاهر الرقمية إجراء الكشف عن الطول الموجي المتعدد ، والحصول على الصور ثلاثية الأبعاد وتجارب الفاصل الزمني ثلاثية الأبعاد. إعداد واحد هو المعدات مع عجلات التصفية اللازمة لتصوير نسبة الكالسيوم / الأس الهيدروجيني ولتحليل FRET مع أزواج صبغة CFP و YFP. وهي مجهزة أيضًا بالتحكم في بيئة الخلية الحية التي يمكن إجراء الفاصل الزمني طويل المدى (أيام) عليها.

محطة DIM 5 & # 160 يتكون من Axioscope 2 من Zeiss لفحص الفلورسنت الروتيني وكاميرا رقمية ملونة عالية الدقة (Axiocam HR، Zeiss) للتصوير الرقمي الملون.

محطة خافت 6 & # 160 يتكون من Zeiss Axiovert 100M وكاميرا CCD مبردة (Sensicam HE) وبرنامج Metamorph. يتمثل الاختلاف الرئيسي بين هذا الإعداد وغيره في أن هذا الجهاز مزود بنظام الحقن المجهري إبندورف الذي يسمح بحقن كمية صغيرة من الجزيئات في الخلايا الملتصقة. النظام متاح أيضًا للتصوير الروتيني الفلوري.

خصائص النظام

تحتوي كل هذه النطاقات (باستثناء 7) على بصريات قابلة للتبديل وتستند إلى التكوينات المستقيمة أو المقلوبة. يرجى الاتصال بالموظفين لاحتياجات التطبيق الخاصة بك.

هذا نظام PALM CombiSystem مركب على مجهر Zeiss Axiovert 200M. يستخدم الإعداد بشكل أساسي لمعالجة الخلايا بالليزر أو التقاط الخلايا أو الهياكل الخلوية الفرعية بشكل انتقائي للتحليل الكيميائي الحيوي (على سبيل المثال PCR أحادي الخلية). تتكون محطة العمل من ليزر نيتروجين نابض ، والذي يسمح بقطع دقيق أو تشريح دقيق. كما أنه مزود بليزر الأشعة تحت الحمراء لمحاصرة الخلايا وتحديد موضعها. & # 160 يمكن العثور على مزيد من المعلومات حول النظام على موقع & # 160 Zeiss & # 160.

التطبيقات

حدد الخلايا المحددة شكليًا / جزء من الخلايا في العينة المرضية لدراسة العينة كيميائيًا حيويًا.

استخدام ملاقط الليزر لوضع خليتين فعليًا معًا لدراسة تفاعلات الخلايا الخلوية.

الاستئصال الانتقائي للخلايا في الأنسجة الحية أو زراعة الخلايا.

المرفق مجهز بميكروسكوب إلكتروني ناقل الحركة JEOL 2100 (TEM) بقدرة 200 كيلو فولت. يستخدم TEM شعاع الإلكترون كمصدر للضوء (بلورة Lab6 في هذه الحالة) ويمر الشعاع (الإرسال) للعينة ويتم عرض الصورة على جهاز تصوير (على سبيل المثال شاشة مضان أو فيلم أو كاميرا CCD). يمكن أن يحصل TEM على دقة أعلى بكثير مما يمكن أن يقدمه الفحص المجهري للضوء (دقة فرعية نانومتر مقابل & # 126200 نانومتر) نظرًا لطول موجة الإلكترون الأقصر بكثير من الضوء المرئي.

تثبيت العينة & # 160 التي تحافظ على العينة في أقرب وقت ممكن من الحالة الأصلية قبل عرضها ضمن TEM. يتم تحقيق ذلك عادةً من خلال إحدى الطرق التالية: 1) التثبيت الكيميائي الذي يستخدم عادةً جزيئات الروابط المتقاطعة مثل الجلوتارالدهيد لإصلاح المكونات الخلوية الرئيسية. 2) التثبيت بالتبريد الذي ينطوي على تجميد العينة بسرعة بحيث يتم تجميد العينات في الحالة الزجاجية. تعمل بعض كاشف التثبيت أيضًا على تعزيز تباين العينة تحت TEM (على سبيل المثال OsO4).

تحسين التباين: نظرًا لأن معظم المواد البيولوجية تنتج تباينًا منخفضًا تحت شعاع الإلكترون ، فمن الضروري استخدام بعض الكواشف المعدنية الثقيلة لزيادة تباين العينة. بعض من الأكثر استخدامًا هي & # 160 أوسو4 & # 160 (لتلوين الدهون) ، & # 160 خلات اليورانيل & # 160 (للنواة والتلوين السلبي) & # 160 سترات الرصاص & # 160 لتحسين التباين العام للإلكترون المعتم.

تسلل الراتنج ودمج البلاستيك: نظرًا لأن البنية الخلوية النموذجية سميكة جدًا بحيث لا يمكن ملاحظتها تحت TEM ، فيجب تقسيمها إلى أقسام رقيقة (عادةً 70 نانومتر) قبل المشاهدة تحت TEM. هذا يتطلب أن تكون العينة جزءا لا يتجزأ من الراتنج البلاستيكي. عادةً ما تمر العينة بخطوات مثل الجفاف وتسلل الراتينج وبلمرة الراتينج (إما في الفرن أو تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية).

تقطيع رقيق (ميكروتومي فائق). يحتوي TEM البيولوجي النموذجي على جهد تسارع يبلغ 200 كيلو فولت أو أقل وفي جهد التسارع هذا ، يمكن للإلكترونات اختراق عينة بسمك أقل من & # 126200 نانومتر. يتم استخدام أداة خاصة بسكين ماسي لقطع العينة إلى & # 12670-100nm لمراقبة TEM ويتم وضع الأقسام على شبكة عينة.

تلطيخ آخر & # 160 إذا لزم الأمر. تحسين التباين الإضافي ممكن في هذه المرحلة.

تتشكل صور TEM من خلال تفاعلات الإلكترونات والعينة ويمكن أن تعمل TEM في أوضاع مختلفة لاستخراج معلومات مختلفة من العينة:

برايتفيلد & # 160 هو وضع التشغيل الأكثر شيوعًا حيث تتشكل معظم التباينات عن طريق امتصاص الإلكترونات بواسطة العينة مما ينتج عنه صورة لمستويات مختلفة من الظل والتي تعكس درجة امتصاص الإلكترون للعينة.

وضع Darkfield & # 160 يستكشف الإلكترونات المبعثرة. تعني النقطة المضيئة في الصورة أن الهيكل مبعثر للغاية (على سبيل المثال ، جسيم ذهبي).

مطيافية فقدان الطاقة الإلكترونية (EELS) & # 160 يكتشف الإلكترونات التي في ظل تفاعلات غير مرنة مع العينة (وبالتالي تفقد بعض الطاقة) وبوابات إلكترونات ذات مستوى طاقة مختلف للكاشف. باستخدام هذه المعلومات ، يمكن تعيين تكوين عنصر العينة. يعد هذا الوضع أيضًا طريقة فعالة جدًا لتحسين التباين عن طريق تصفية الإلكترونات المبعثرة من الصورة النهائية.

التطبيقات

يمكن استخدام TEM للحصول على عرض التفاصيل لعينة على مستوى الدقة الذرية. بالنسبة للعينات البيولوجية ، يمكن أن يعطي TEM تحديدًا لا لبس فيه للمقصورات الخلوية والعضيات. بالاقتران مع الواسم الجزيئي المحدد (مثل الجسم المضاد) والملصقات الكثيفة الإلكترون (جسيمات الذهب المناعي أو الجسيمات النانوية) ، من الممكن تحديد ارتباط جزيئات معينة بعضية معينة أو مع نوع آخر من الجزيئات. باستخدام التصوير المقطعي ، يمكن الحصول على معلومات ثلاثية الأبعاد. باستخدام EELS ، يمكن تعيين تركيبة أولية للعينة. بالنسبة للعينات البيولوجية ، على سبيل المثال ، يمكن تعيين المجالات الغنية بالفوسفور والغنية بالنيتروجين. تم تجهيز TEM أيضًا بحامل عينة التبريد لمراقبة العينة تحت ظروف التبريد.

خصائص النظام

  • حامل عينة التبريد لفحص العينة عند درجة حرارة النيتروجين السائل.
  • حامل عينة مزدوج الإمالة للتصوير المقطعي.
  • مرشح Gatan GIF Tridieum لـ EELS لتعيين العناصر.
  • كاشف مجال مظلم حلقي عالي الزاوية لتصوير المجال المظلم.
  • إعداد عينة TEM اللازمة للعينات البيولوجية. هذا يشمل:
    • فريزر عالي الضغط للتثبيط بالتبريد.
    • وحدة استبدال التجميد لاستبدال الماء من العينة البيولوجية تحت ظروف التبريد.
    • جهاز Ultramicrotome مع ملحق Cryo لإجراء شق فائق الصغر إما في درجة حرارة الغرفة منخفضة الحرارة
    • أداة وضع العلامات المناعية لأداء وضع العلامات المناعية.
    • معالج الأنسجة الأوتوماتيكي بالميكروويف لمعالجة الأنسجة السريعة لـ TEM.
    • طلاء الكربون مع تفريغ متوهج وقدرة التظليل المعدني.
    • النطاق مجهز ببرنامج Gatan DigitalMicrograph بوظيفة جرعة منخفضة لعينة حساسة للإشعاع (عينة cryo) ، مونتاج لإعادة بناء مجال رؤية كبير. بالنسبة للتصوير المقطعي ، فإنه يستخدم & # 160 SerialEM.

    الإسفار هو عملية دورية حيث عمر الفلوروفور ليس فقط خاصية للجزيء نفسه ولكن أيضًا وظيفة من بيئته. في حالة مثل نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ، سيتم تقصير عمر الجزيء المانح. لذلك ، يمكن استخدام FLIM كطريقة لقياس التفاعلات الجزيئية. على عكس تحليل FRET التقليدي ، لا يخضع قياس FLIM لتبييض ضوئي مضان أو تغيرات تركيز يصعب التحكم فيها في الخلايا الحية.

    The FLIM module is an attachment to the Zeiss NLO 510 system which uses time-correlated single photon counting technique to construct the decay curves of fluorophore in every pixel of the image. The system is equipped with a Hamamatsu RS-39 Multi-channel plate detector, a filter wheel and a SPC730 photon-counting board from   Becker Hickl for photon counting. The system uses a photodiode to obtain synchronization information from the laser pulses to construct the fluorescence decay curve.

    التطبيقات

    The main application for the setup in biology is for FRET analysis where donor life time can be measured both in presence and absence of acceptor molecules. Then the FRET transfer efficiency can be calculated according to the following formula: - Et =1-   ر   D,A/   رد

    Where   ر   D,A   is the life time of donor molecule in presence of acceptor and   ر   د   is the life time of the donor molecules in absence of acceptor.

    The system is integrated part of multi-photon microscope. There is no special need for specimen preparation other than that the specimen must be suitable for confocal observation. As all FRET analysis, all control samples are needed (e.g. donor alone, acceptor alone, donor acceptor combined and specimen without any staining for auto-fluorescence).

    The system does not have an overly user friendly interface, therfore it is only available by assisted use. Please contact staff for more details.

    FCS is a spectroscopic technique for the study of molecular interactions in solution. FCS monitors the random motion of fluorescently labelled molecules inside a  defined volume element irradiated by a focused laser beam. These fluctuations provide information on the rate of diffusion (diffusion time) of a particle and this, in turn, is directly dependent on the particle's mass. As a consequence, any increase in the mass of biomolecules, e.g. as a result of an interaction with a second molecule, is readily detected as an increase in the particle's diffusion time.

    التطبيقات

    Because FCS measurement is made through diffraction limited volume, FCS can be used to study molecule-molecule interactions in living cell. The system can be used to study:

    Transcription factor-DNA interactions

    Lipid-protein interactions, etc.

    The FCS system at the Facility is an integrated part of the Multi-photon and the LSM710/Zeiss LSM NLO systems with all the laser lines for common fluorophores and 2 detectors which enable cross correlation analysis.

    Micro-injection is one of the techniques to introduce minute amount of substance into live cell/tissue. The Facility is equipped with an Eppondorff micro-injection system mounted on a Zeiss Axiovert 100M fluorescent microscope. It is suitable to inject small amount of substance (e.g., antibody, dye, drug, etc.) into adherent cultured cells. The system is also equipped with a cooled CCD camera (Sensicam) and Metamorph for fluorescence imaging.

    The Facility is equipped with various up-to-date computer workstations for image processing. These include several high end workstations with powerful graphics and large amount of RAM and hard drive space dedicated for image processing and analysis. Here is a list of software tools available for the Facility users:

    Deconvolution   البرمجيات

    More information regarding Deconvolution can be found   here.

    3-D image processing and analysis software

    2-D image processing and analysis and image acquisition software

    Some of the computers are equipped with   Zeiss LSM software (ZEN)   for offline processing of confocal/FCS data.


    أساليب

    Experimental set-up

    The asynchronous optical sampling (ASOPS 27 ) pump probe system (see Fig. 2) controls two 150 femtosecond pulsed lasers with repetition rates of

    100 MHz and allows the delay between the lasers to be set and swept electronically without the need for a mechanical delay line 21,22 . In our system, the delay repetition rate between the probe and the pump is 10 kHz which means that a measurement (of the complete 10 ns delay sweep) is taken every 100 ميكرومترس.

    As seen in Fig. 2, both beams (λمسبار = 780 nm, λمضخة = 390 نانومتر) are combined and focused together through a 50x (NA = 0.55) long working distance objective. Adjustable mirrors allows coaligning of the pump spot to the probe spot. The probe beam is detected after being collected by an objective lens (20x, NA = 0.42) and focused to a photodiode. The sample is scanned by moving electromechanical stages with a minimum step motion of 100 nm. Typically 10000 averages are taken per point which takes

    2 s to acquire limited by data acquisition element. The system uses typical average powers of 1 mW (0.3 mW at cell) in the probe and 0.5 mW (0.05 mW at cell) in the pump corresponding to pulse energies of 10 pJ and 5 pJ and peak powers of

    Optical imaging is performed with two cameras: one CCD is used for brightfield imaging (using the 50x objective lens) and the other (emCCD) for fluorescence (using the 20x objective lens). A spectrally-distinct LED source (530+/−25 nm) provides brightfield illumination of the sample as well as excitation for red-emitting fluorescence dyes. Epifluorescence was detected via a TRITC cube (Ex: 535/15, DCX: 565, Em: 615/35 nm).

    Cell methods

    3T3 fibroblast cells were cultured on the EtOH-sterilised transducers for 24 hrs in standard culture medium. Living cells were kept in Hanks balanced salt solution (HBSS) buffered with 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, 25 mM) to maintain physiological pH (7.4) under ambient conditions during the experiments. Media was pumped at 0.05 ميكرومترLs −1 using a syringe pump into a chamber (chamilde CF-T25 produced by Live Cell Instruments, Seoul) comprising a transducer substrate and a closing coverslip. Constant flow of media allowed specimens to remain alive for several hours at room temperature (21 °C).

    A fluorescence assay was used to confirm cell viability (Fig. 6). Propidium iodide (PI, abs: 510–560 nm, em: 600–650 nm) binds to DNA in the nuclei of dead cells, and is non-fluorescent when excluded from entering living cells by the intact cell membrane. PI was added as a 1 mM EtOH stock to a concentration of 1 ميكرومترM in bathing medium. A fluorescence picture of the targeted region of cells was obtained before starting the ultrasonic imaging and another following the ultrasound imaging experiment (see supplementary Fig. 1). Finally, all cells were deliberately killed using a detergent (Triton X-100 in phosphate buffered saline (PBS) solution, Sigma-Aldrich). Cells which survived the ultrasound imaging experiments continued to exclude PI from their nuclei throughout and following the experiment, confirming that the cells remained viable (see supplementary information).

    Signal processing

    Raw signals are composed of several parts: coincidence peak, thermal response and signals of interest - which were extracted by established signal processing 24,33 . A fast Fourier transform (FFT) is then performed on the resultant trace to measure the Brillouin frequency. Signal to noise ratio (SNR) was evaluated in the frequency domain by measuring the peak amplitude of the acoustic signal with the standard deviation of the noise background in the absence of signal (pump off) and in the same band.

    Because the acoustic waves are propagating axially through the sample, different moments in time represent different locations in space. Axial sectioning information was therefore obtained by resolving the Brillouin frequency in time. This was possible using the short time Fourier transform method (STFT) where a small time window (length: two acoustic cycles or more) is shifted in time. In this way, it is possible to section the optical volume. The resolution of this process was estimated by modelling and experimental measurements of an edge response revealing the axial resolution is approximately half of one measuring window when the window lasts for two cycles or more.


    مقدمة

    Why do we care about detecting single molecules in cells?

    Experimental investigations in the life sciences have traditionally been performed on a population ‘ensemble average’ level. An example of this is the use of cell cultures, which contain a population of many thousands of cells. A cell population is, in general, intrinsically heterogeneous, even if cells are genetically identical. In other words, different cells exhibit a range of different physical, chemical and biological properties. Such heterogeneity is potentially valuable at a level of the originator species, in that they allow rapid adaptation in a dynamic, fluctuating environment, and so may impart a biological advantage to the ultimate survival of the species [1–3]. Using a population signature as a metric for the physical or chemical status of different cellular parameters is valuable at one level, since it averages out the observations of potential minor and anomalous cells in that population, in effect smoothing out the ‘noise’. However, the main problem with this approach is that there may be valuable information hidden in this ‘noise’ we run the risk of losing potentially useful data concerning biologically relevant heterogeneity. We potentially limit the extent to which we can investigate ‘subpopulations’ [4,5].

    For example, ensemble average analysis will not pinpoint the drug-resistant bacteria or cancer cells in a general cellular population. When subpopulations are identified, the only way to determine which cells contribute to which group, hence, to separate competing signals, is to analyse the whole population cell-by-cell [6,7]. Population heterogeneity can arise due to environmental alterations affecting the soft matter of biological material [8], as well as through genetic variation that affects gene expression and can invoke fluctuations in various cellular components [9]. Differences in transcriptional regulation affect signal transduction pathways and hence responses to various stress factors, such as pH and oxidative stress. Therefore, an ideal single-cell experiment should be performed under precise environmental control. Moreover, the age of a cell and its phase in the cell cycle may also significantly influence the cell response [4].

    Even an apparently simple unicellular organism represents a heterogeneous system on a molecular level [10]. Analysis of the ensemble average of molecular properties results in loss of information concerning any molecular heterogeneity, and may ultimately lead to misinterpretations of the underlying physiological relevance of subpopulations of molecules [11]. Focusing on molecules as the minimal ‘functional’ units in a biological system, single-molecule biophysics research has an important impact on a range of fields of biological investigation. These include fields where biological complexity is rife, such as medical immunology, synthetic and systems biology, but also several others at a more basic mechanistic level, ultimately through an ability to enhance both the effective spatial and temporal resolution of data [11]. Modern techniques [12] enable, for example the probing of the cellular signal transduction dynamics directly [13], which facilitates a deeper and more precise understanding of important biological processes, e.g. the human immune response, gene expression and cellular differentiation. One of the most important techniques used currently in single-molecule biophysics research is, unquestionably, fluorescence microscopy [14,15].

    Identification and investigation of molecular subpopulations within the cell enables us to study not only cellular responses but also the precise underlying molecular mechanisms. Arguably, the first clear demonstration that single-molecule fluorescence microscopy could yield insight which were genuinely unanticipated from bulk ensemble average measurements was reported in 1998. Here, the researchers used the native photoblinking behaviour of the common metabolite FAD inside a binding site of the enzyme cholersterol oxidase to demonstrate that its activity could be affected by a type of ‘molecular memory’ stored in the molecular confirmation [16]. Single-molecule fluorescence microscopy approaches since then have uncovered many fundamental molecular scale biological processes that were previously not studied primarily due to the limitations imposed by population methods, including studies of the bacterial flagellar motor rotation [17–21], protein folding, translocation and movement [11,22–25], signal transduction [26], biopolymer mechanics [27–32], DNA replication and remodelling [33–37], oxidative phosphorylation [38–41], as well as biomedically relevant areas such as the probing of processes relating to infection and general pathology [42–44], cell division mechanisms [45], mitochondrial protein dynamics [46], viral infection processes [47], endocytocis and exocytosis pathways [48], osmolarity receptor dynamics [49], cell wall synthesis [50], and structural dynamics of DNA [51]. This list above should not be taken as exclusive nor exhaustive, but rather we present it here to exemplify the very wide range of biological processes to which single-molecule fluorescence microscopy tools have been applied.

    One of the primary requirements for all the single-cell/single-molecule approaches is the ability to faithfully detect small signals over sometimes relatively large noise levels [52]. Combining improvements in a range of different approaches, such as minimizing the sample volume, engineering better photostability for newer variants of fluorescent proteins, and improving the sensitivity of camera detectors, have resulted in higher detection levels of photon signals for fluorescence emission, though still there are limitations due to poor signal-to-noise ratios when sampling at very high imaging rates. Various analytical tools have been developed to improve the signal-to-noise ratio, such as automated methods of ‘segmentation’ of cellular images [53,54], robust software algorithms for the tracking of fluorescently labelled molecules [55–57], and stoichiometry analysis of molecular complexes which those tracked molecules form. We steer the reader to recent comprehensive reviews that discuss these different approaches on how to increase the fidelity of signal detection over background noise [52,58].

    Fluorescence and fluorescent proteins

    The physical process of fluorescence occurs when a photon of light is absorbed by a ‘fluorophore’, which may be an atom or a molecule, and consequently re-emitted as a photon with a longer wavelength. The loss of energy occurs due to vibrational processes which result from oscillations between the atomic/molecular orbitals due to the perturbation of a different negative electron charge distribution relative to the positively charged nucleus. Upon standard ‘single photon excitation’, light absorption of a single photon (of light) occurs which results in a ground state electron in the fluorophore undergoing an excitation transition to a higher energy state, in a process characterized by a time scale of ∼10 −15 s. Following this relatively transient state, the excited electron loses energy through vibrational losses over a time scale of 10 −14 –10 −11 s. The electron then undergoes an energy transition back to the ground state, characterized by a time scale of 10 −9 –10 −7 s, accompanied by photon emission, whose wavelength is longer than the incident wavelength (i.e. has a smaller associated energy). Jablonski [59] described the different energy states and transitions between them in a useful pictorial form called Jablonski diagram (Figure 1). Although the physical process of fluorescence was properly formulated by the British scientist Stokes et al. [60], it was more than half a century later that the first operational fluorescence microscope was developed, reported in 1911, which obtained the relatively standard design as we know it today only in 1967 [61].

    Jablonski diagram

    An electron of a fluorophore at the ground state (S0) receives energy from the absorption of a single photon of light which results in an excitation transition to a higher energy state (absorption). When the excited electron relaxes to the ground state, following vibrational losses, energy, lower than the incident photon and thus with a higher wavelength, is emitted as a single photon which causes fluorescence.

    An electron of a fluorophore at the ground state (S0) receives energy from the absorption of a single photon of light which results in an excitation transition to a higher energy state (absorption). When the excited electron relaxes to the ground state, following vibrational losses, energy, lower than the incident photon and thus with a higher wavelength, is emitted as a single photon which causes fluorescence.

    In 2008, the Nobel Prize in Chemistry was awarded jointly to Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien for the ‘discovery and development of green fluorescent protein, GFP’ [62]. GFP had been isolated from the jellyfish ايكوريا فيكتوريا, described in an article in 1962 [63]. A step change came when the GFP gene was sequenced in the early 1990s, accompanied by developments in molecular cloning technologies enabling the integration of its DNA directly into DNA in other organisms. Nowadays, it is an invaluable tool which is widely used as a fluorescent tag and can be relatively easily integrated into the genome. GFP is a β-barrel protein consisting of 11 β-sheets and an α-helix, composed of 238 amino acids residues in total. The wild-type GFP chromophore is encoded by the Ser 65 -Tyr 66 -Gly 67 sequence which forms a heterocyclic photoactive state spontaneously through the processes of intramolecular autocatalytic rearrangement and subsequent oxidation [64]. This final oxidation stage is crucial for the protein to function as an active fluorophore.

    Numerous mutations of wild-type GFP have now been generated, with one of the principle aims of improving its biophysical characteristics. Photostability and fluorescence output increases were achieved by using an S65T mutation [65], while the A206K was developed to prevent self-oligomerization [66], and various colour mutations were added, including, for example blue Y66H, cyan Y66W and yellow T203Y [67] variants. Standard fluorescent proteins will undergo irreversible photobleaching after a characteristic time interval when excited to fluorescence, most likely to be due to the accumulation of free radicals in the surrounding water solvent formed from the lysis of water molecules upon absorption of photons of light, and their subsequent chemical damage to the fluorescent protein structure. Standard fluorescent proteins cannot therefore be tracked longer than their photobleaching point, which thus limits their application in long time scale experiments.

    Certain newly engineered fluorescent proteins, e.g. mEos [68], Dendra [69] and KikGR [70] can be photoactivated and undergo irreversible photoconversion from green to red emitting state upon irradiation with UV light [71,72]. Although such approaches potentially can appear to extend the lifetime of a tracking experiment in which proteins can be photoconverted before they bleach, there is no intrinsic improvement as such to photostability in these proteins. Monomeric forms of these proteins [73,74] as well as different variants of photoconvertible proteins with enhanced features have also been designed. For example, mMaple protein exhibits reversible photoconversion under certain conditions [75], with yellow-to-cyan (EYFP-to-CFP) photoconversion upon green light illumination [76], and cyan-to-green photoswitch of PS-CFP2 [18]. The fluorescent protein mOrange undergoes orange-to-red activation upon illumination with blue light (typically using the common laser line with wavelength 488 nm), which is thus less harmful for live cells compared with UV-convertible proteins in regard to photodamage effects [77]. Photoconversion can be used stroboscopically to divide up the finite photon budget prior to photobleaching (i.e. acquiring fluorescence images over extended time intervals instead of continuously illuminating samples), which has been used to monitor complex live samples such as developing embryos for up to several hours [78]. Another type of fluorescent protein, phytochrome-based near IR fluorescent proteins (iRFP), has been developed recently [79]. Compared with conventional fluorescent proteins, such as GFP, iRFP has a higher effective signal-to-noise ratio and allows imaging deeper into tissues due to smaller elastic scattering effects at higher wavelengths of electromagnetic radiation, relevant for applications in live-animal or excised-tissue models.

    Some fluorescent proteins have a characteristic time over which they change their emission wavelength from blue to red based on the chromophore maturation time. Such proteins can be used, therefore, as fluorescent timers, such as to study protein transport. For example, an mCherry-derived monomeric variant with various timing behaviours has been used for probing the kinetics of protein trafficking [80].

    Fluorescent probes may be added to a protein of interest directly or via linkers, such as SNAP- and HALO-tags. Here, the encoding DNA for a protein probe is first genomically fused next to the protein under investigation, technologically similar to the approach used in developing fluorescent protein fusion constructs. In most applications of HALO/SNAP, this probe consists of a DNA repair protein (for SNAP) or a haloalkane dehalogenase enzyme (for HALO) [81,82]. The cell can then be incubated with a secondary probe which is fluorescently labelled with a bright organic dye fluorophore. The secondary probe is designed to bind to the primary protein probe. The use of these tags avoids ‘direct’ fluorescent protein labelling, which might impair their physiological behaviour due to steric hindrance. This methodology enables a far brighter and more photostable fluorophore to be used compared with conventional fluorescent proteins. Since the localization precision improves with the brightness of the fluorophore used (roughly with a reciprocal dependence on the square root of the brightness) the use of a brigher dye facilitates improvements in localization precision for determining the position of individual fluorophores. This method also implies a potential improvement to temporal resolution in ultimately enabling faster sampling for a given spatial localization precision. That being said, the primary probes for SNAP and HALO are themselves reasonably large whose molecular weight is only ∼40% less than that of fluorescent proteins of ∼28 kDa [5], and so a potential steric hindrance effect is still present. Also, the efficiency of labelling during the secondary probe incubation step is sometimes difficult to achieve as the primary protein probe is often not easily accessible, e.g. the primary probe protein is deep inside a cell and thus there are technical issues in how to deliver the secondary probe to these regions. However, this approach has resulted in significant advances in super-resolution imaging of accessible cell surface structures, such as the cell wall architecture of bacteria [83].


    خيارات الوصول

    احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

    جميع الأسعار أسعار صافي.
    سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
    سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

    احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

    جميع الأسعار أسعار صافي.


    المواد والأساليب

    إعداد عينة

    Freshly withdrawn venous blood, anti-coagulated by EDTA (1.8 gL −1 ), was collected from six healthy, non-smoking volunteers (A, B, C, D, E and F) with the vacutainer system from BD (BD, Heidelberg, Germany) and immediately processed. Informed consent was obtained from all donors in written form. The blood samples were withdrawn in accordance with the transfusion law of Germany. The use of donor blood samples for scientific purposes was approved by the ethics committee of the Charité–Universitätsmedizin Berlin (# EA1/137/14). The blood samples were characterised by determining the complete blood counts (CBCs) using a XS 800i hematology analyser (SysmexEurope GmbH), located in the central laboratory. In healthy individuals, free Hb concentrations in blood serum are less than 0.1% 52 and negligible for the analysis of our measurements. A blood gas analyser (ABL 725, Radiometer GmbH, Germany) served to determine the relative metHb and carbomonoxy-Hb (COHb) concentrations, being <1.2% and <2.5%, respectively, for the six samples investigated. Subsequently, for WBC and platelet depletion, 10 mL of whole blood were washed three times (150 g, 5 min) in 50 mL of phosphate buffered saline (PBS sigma, Germany). Washed RBCs were re-suspended in PBS to a final volume of 10 mL. To control the washing cycles the concentrations of RBCs, WBCs and platelets were measured on site before and after each washing step by an ABX Micros 60 analyser (Axon Lab AG, Germany). In this way we ensured that WBC and platelet concentrations are low and extinction spectra of RBCs are not distorted. The sphering reagent is a commercially available substance (CELL-DYN diluents/sheath reagent, Abbott GmbH & Co. KG, Diagnostik, Germany) used for the isovolumetric sphering of RBCs in hematology analysers. For sphering, washed RBCs were diluted 1:100 in the sphering reagent. This pre-diluted suspension was used as stock solution for dilution series.

    Typically, the preparation took 90 minutes. Since during this time the sample was exposed to atmospheric oxygen (i. e., صا2 = 212 hPa = 159 mmHg), saturation is reached and the deoxygenated Hb variant is converted to oxygenated Hb. Time constants for the oxygen uptake amount to about 500 ms for 50% saturation 53 . In Ref. 53 it was also shown the this time reduces with decreasing HCT value, i. e., the reaction is accelerated when RBCs are diluted as in our measurements. Absorption spectra of lysed RBCs were measured with the same experimental setup used for extinction measurements. They were found to agree with literature data for oxyHb 27,29 up to the concentration error from volumetric dilution. Hence we can use the literature values of oxygenated Hb 27 for γ(λ) in our analysis.

    الإعداد التجريبية

    The optical setup for spectral transmittance measurements is shown in Fig. 4. A high-power, continuous HPX-2000 Xenon light source is applied to irradiate the sample in the wavelength range between 185 nm to 2000 nm. For spectral analysis between 200 nm and 1100 nm, a Maya2000 Pro spectrometer was used (Ocean Optics, Inc., USA). With the help of 4 mirrors M1–M4 the folded light path features a length of approximately 2.5 m between the light source and the sample cuvette. The lense L1 is used as condenser to obtain an approximately parallel light beam. The apertures A1–A3 serve to reduce the size of the beam to a diameter of about 1 mm corresponding to a divergence of 0.2 mrad or 0.01° (half angle). The samples are filled in a quartz cuvette (Hellma Analytics, Germany) with د = (10 ± 0.01) mm optical path length. Aperture A4 blocks the light scattered in the non-forward direction by the sample to suppress background light. The spectrometer is placed 1.5 m from the sample via mirrors M5–M7 and equipped with an entrance slit of 50 μm width and 1.0 mm height. The slit width results in a spectral resolution of approximately 0.45 nm, the slit height corresponds to an observation angle of 0.3 mrad or 0.02 (half angle). The long distance of 1.5 m between the cuvette and the detector serves to effectively suppress light scattered at small angles into the spectrometer’s aperture. This allows to neglect unwanted contributions to the directed transmittance when analysing the measurements. The experimental setup in Fig. 4 allows to measure the same quantity as the monochromator-based setup previously used by Gienger وآخرون. 42 to validate the method for spectral RI determination of particles. However, the setup in Fig. 4 offers a significant advantage, since due to the parallel detection of the spectrum in contrast to the previously used wavelength scanning, the measurement time is reduced from typically 20 min to about 10 s.

    Optical layout to measure extinction spectra.

    Measurement of transmittance and calculation of extinction cross sections

    For transmission measurements, pre-diluted sphered RBCs were further diluted with the sphering reagent and the spectral intensity (_<< m>,j>(lambda )) was measured for 6 to 8 different dilutions per sample. The number concentrations جي of the cells were selected such that the transmittance (_(lambda )=_<< m>,j>(lambda )/_<0>(lambda )) ranged from roughly 95% down to 30%. أنا0(λ) is the null measurement where the cuvette filled with the sphering reagent only. The offset due to dark counts and read out procedure of the diode array were subtracted from all spectra. This measurement of concentration series enables us to exclude multiple scattering effects and to compute the extinction cross section (>_<< m>,j>(lambda )) according to

    as this formula implies extinction caused by single scattering. Since the (<ar>_<< m>< m>< m>,j>(lambda )) curves thus computed lie on top of each other inside the measurement accuracy, multiple scattering can be excluded.

    The volumetric dilution by adjustable pipettes contributes to the uncertainty of the concentrations جي of an estimated 2–4%, depending on dilution. Accounting for the accuracy of hematology analysers, the RBC concentrations of the undiluted samples have a relative uncertainty of about 4%. It follows that (<ar>_<< m>< m>< m>,j>(lambda )) is only measured up to a prefactor corresponding to the relative error of the number concentration of cells in the diluted sample, which accumulates to approximately 6%. However, even larger concentration errors are easily accounted for in the data analysis as described in section “Mathematical model” (see Eq. (8)). The concentration series were recorded such that the cuvette was not moved between measurements: Increasing volumes of the RBC suspension were added to the fluid-filled 10 mm cuvette (starting with 2.2 mL of sphering reagent) and mixed by pipetting back and forth and using the magnetic stir bar for homogenisation. Care was taken not to touch the cuvette walls in the process, as not to change the angle relative to the incident beam. This minimises errors from light reflected at the cuvette and avoids artefacts due to displacement of the transmitted light when tilting the cuvette.

    Optical properties of materials

    Using an Abbe refractometer (ORT 1RS, Kern Optics, Germany) the real part of the RI of the sphering reagent was measured at λ = 590 nm and found to be higher than that of pure water by Δن = 0.0020(3). Furthermore, the absorption spectrum was recorded with the setup in Fig. 4. An absorption band was found between 220 nm and 290 nm with a peak in the imaginary part if the RI of 1 × 10 −5 . This limits the lowest wavelength in our analysis to 290 nm since the transmittance in a 10 mm cuvette drops down to about 1.2% compared to water at the absorption peak, which results in a very low signal to noise ratio.

    نموذج رياضي

    The measured spectral extinction cross sections (>_<< m>>(lambda )) depend on the quantity to be determined, α(λ), in a complicated nonlinear way. Hence, data analysis requires solving an inverse problem: Find those optical properties of RBCs (and their size and concentration distribution) that explain the data. To solve this problem by nonlinear numerical optimisation a forward model is needed to compute (>_<< m>>(lambda )) for a given parameter set.

    Firstly, we define the ensemble average

    أين ج(λ جخضاب, ص) is the extinction cross section of a single cell of radius ص and intracellular Hb concentration جخضاب. The cell’s refractive index is given by Eq. (1) and the RI of the surrounding medium (sphering reagent) is (_<< m>>(lambda )in > ). The size distribution in the blood sample is given by ص(ص) and the distribution of the intracellular Hb concentration جخضاب اعطي من قبل ف(جخضاب). Measurements on single RBCs suggest that ص و جخضاب are statistically independent 14,41 , thus motivating a separation of ف و ص in our treatment.

    The Mie solution allows for efficient computation of ج(λ جخضاب, ص). The known quantities in Eq. (1) are (<>>_<<< m>>_<< m<2>>>< m>>) and γ for which we use literature values 27,31 . Furthermore we assume (_<< m>>(lambda )=_<<< m>>_<< m<2>>>< m>>(lambda )+0.002) for all λ, as this RI difference was measured for the sphering reagent at 590 nm. As presented in Ref. 42 , we expand the unknown function α, describing the wavelength-dependent increment of the real RI with concentration, into a finite series

    with real coefficients أي، أين ال زي are orthonormal basis functions. Here, we use a set of orthonormalized third-order cardinal splines with a uniform grid spacing of Δλ = 10 nm. The approximation error when fitting literature data for α 28,38 with this basis is well below the measurement uncertainties.

    The distributions ف(جخضاب) و ص(ص) are modelled by a normal distribution and log-normal distribution, respectively, each of which has two parameters ميكرومتر و σ. Hence the parameter vector of the joint probability distribution is

    Note that the parameter (< heta >_<1>=_<_<< m>>>=< m>) is not a free parameter, but fixed to the value obtained from the CBC. This was done because the MCHC and the absolute value of the real RI increment α(λ) have a very similar effect on the model for the spectral extinction measurements leading to ambiguities and inconsistencies of the regression results of the RI increment. Using the MCHC as a free parameter in the least-squares optimisation described below worked well for the majority of datasets. However, for a few of the samples hematological parameters in disagreement with the CBC were found when this approach was applied to analyse measurements. Hence the MCHC was held constant in the analysis of all datasets. This yields consistent regression results for all data sets and made the results also substantially more robust against perturbations in the measurements.

    A secondary model ( < >^<< m>>(<oldsymbol< heta >>)) computes the vector of blood count parameters ض = (MCV, RDW) تي من عند θ. Data analysis consists in minimising the cost function

    أين ذأنا are the measured extinction cross sections and ضي are the CBC measurements. Weights are set to ثأنا = 1/ش(ذأنا) 2 and (_^<< m>>=1/u<(_)>^<2>) , where the standard uncertainties of the extinction spectra ذأنا are estimated from repeated measurements. To find an optimal parameter vector ψ that minimises χ 2 we applied the nonlinear least squares optimisation lsqnonlin in Matlab (Matlab R2018a, The MathWorks Inc.) using the trust-region algorithm.

    Because the objective function χ 2 may have several local minima, initial values of the parameter vector were sampled randomly around a given mean and the local optimisation was repeated several times. The coefficient vector أ was initialised randomly such that the wide range of literature values reported for the real RI increment α was covered. Several percent of random variation were allowed for parameters of size and concentration distributions. For each dataset 25 to 50 random initial conditions were sampled and optimised. The parameter vector with the lowest χ 2 was used as the result (hat<<oldsymbol>>) .

    More specifically, the coefficient vector أ of the real RI increment α(λ) was initialised in a two-step process: (i) α(λ) was set to a constant (< m>< m>< m>< m>< m>in >(0.235,< m>< m>,<< m>>^<-1>,0.04,< m>< m>,<< m>>^<-1>)) and (ii) additional normally distributed independent random numbers were added to the أي, resulting in random dispersion features of 0.004 mLg −1 standard deviation for α(λ). (>(mu ,sigma )) describes normally distributed random numbers of mean ميكرومتر and standard deviation σ. For the size and concentration distribution, the parameters θ were randomly initialised around those values obtained from the CBC with the MCHC fixed to the value of the CBC. Standard deviations of the Gaussian random numbers were set to 120 nm for mean(ص) and 30 nm for std(ص). The width of the Hb concentration distribution and the particle concentration error were sampled from (< m>< m>< m>(_<< m>< m>>)in >(7< m< \% >>< m>< m>< m>< m>,10,< m>,<< m>>^<-1>)) and (eta in >(0,3< m< \% >>)) , respectively.

    25 to 50 random initial conditions were sampled and the optimisation was run for 15 iterations. Afterwards the six parameter vectors with the lowest χ 2 were further optimised for up to 150 iterations or until a given tolerance was met. The parameter vector with the lowest χ 2 was used as the result (hat<<oldsymbol>>) . Typically several initial conditions ended up in the same minimum, but other less deep local minima were found as well.

    Uncertainty propagation

    Using the Jacobi matrix J of the extinction cross section with respect to the parameters with entries


    شاهد الفيديو: ما هي الأشعة فوق البنفسجية ما هو الفرق بين UVAUVBUVC - La différence entre les types dUV (أغسطس 2022).