معلومة

هل bFGF و / أو EGF ضروريان في وسط توسع NSC؟

هل bFGF و / أو EGF ضروريان في وسط توسع NSC؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما أفهمه هو أنه ليس ضروريًا لأنه يبدو أن الفكرة وراء طبقة التغذية هي أن الخلايا الجذعية تنتج bFGF و EGF الخاصة بها جنبًا إلى جنب مع عوامل النمو الأخرى. ومع ذلك ، ما زلت أرى بعض الأوراق (على سبيل المثال هذه التي أحاول إعادة إنتاجها) ، استخدمها في الوسائط المستخدمة لصيانة NSC (تحتوي ثقافة السلف العصبية على كليهما). يبدو أن هذه الورقة تشير إلى أن طبقة التغذية الخاصة بـ NSCs غير ضرورية مما قد يكون منطقيًا ولكني أردت أن أعرف ما هي الممارسة الشائعة والطريقة الأكثر قوة وكيف ترتبط بهذه النتائج. لهذا السبب أود أن أسمع من تجربتي الشخصية ولكن من الواضح أن المراجع مفيدة أيضًا.


دور جديد لـ Gab2 في بقاء الخلية بوساطة bFGF أثناء حمض الريتينويك و # x02013 تمايز الخلايا العصبية المستحثة

تضخم بروتينات Gab وتدمج الإشارات التي تحفزها العديد من عوامل النمو. في الثقافة والحيوانات ، يؤدي حمض الريتينويك (RA) إلى تمايز الخلايا العصبية. نظهر أن تعبير Gab2 يتم اكتشافه في الخلايا العصبية في ثلاثة نماذج من تمايز الخلايا العصبية: الخلايا الجذعية السرطانية الجنينية (EC) ، والخلايا الجذعية الجنينية ، والخلايا الجذعية العصبية الأولية (NSCs). يحفز علاج التهاب المفاصل الروماتويدي موت الخلايا المبرمج ، الذي يقابله FGF الأساسي (bFGF). في خلايا EC ، ينتج عن إسكات Gab2 فرط الحساسية لموت الخلايا المبرمج الناجم عن RA ويبطل الحماية بواسطة bFGF. يقلل قمع Gab2 من التنشيط المعتمد على bFGF لـ AKT ولكن ليس ERK ، ويعكس AKT النشط بشكل أساسي ، ولكن ليس نشطًا بشكل أساسي MEK1 ، فرط الحساسية. وبالتالي ، فإن تنشيط AKT بوساطة Gab2 مطلوب لحماية bFGF. علاوة على ذلك ، فإن إسكات Gab2 يضعف تمايز خلايا EC إلى الخلايا العصبية. وبالمثل ، في NSCs ، يقلل كبح Gab2 من الانتشار المعتمد على bFGF وكذلك بقاء الخلايا العصبية وإنتاجها عند التمايز. تقدم النتائج التي توصلنا إليها أول دليل على أن Gab2 هو لاعب مهم في التمايز العصبي ، جزئيًا من خلال العمل في اتجاه مجرى bFGF للتوسط في البقاء على قيد الحياة من خلال كيناز phosphoinositide 3 & # x02013AKT.


مقدمة

تمتلك الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) القدرة على التجديد الذاتي ويمكن أن تتمايز إلى خلايا عصبية وخلايا نجمية وخلايا قليلة التغصن. يلعبون دورًا رئيسيًا في تطوير الجهاز العصبي المركزي الجنيني ويستمرون في العمل طوال فترة البلوغ 1 ، 2 ، 3. يعتمد تكاثر NSCs وتمايزها على إشارات البيئة المكروية 4 ، 5 ، بما في ذلك عدد من عوامل النمو مثل عامل نمو البطانة الوعائية (VEGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) 6.

تم تحديد VEGF في الأصل كوسيط رئيسي لتكوين الأوعية 7 ، 8. يلعب دورًا مهمًا في التوسط في نفاذية الأوعية الدموية وتجديد الأنسجة 9 ، 10. في معظم الحالات ، يمارس VEGF نشاطه عبر مستقبله ، Flk-1 ، في الخلايا البطانية ، والخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم وبعض الخلايا السرطانية 11 ، 12 ، 13 ، 14. في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، على سبيل المثال الحصين ، يحفز VEGF توسع NSCs وتكوين الخلايا العصبية في نماذج حيوانية مختلفة ، مما يؤدي إلى تحسين القدرة على التعلم 15 ، 16 ، 17 ، 18. في البالغين ، توجد NSCs على مقربة من الأوعية الدموية وتحيط بها الخلايا الدبقية في الحُصين والمنطقة تحت البطينية. أشارت الدراسات السابقة التي أجراها آخرون إلى أن الخلايا الوعائية والخلايا الدبقية قد تكون بمثابة مكان مناسب لمراكز الخلايا الجذعية 19 ، 20. نظرًا لأن كلا النوعين من الخلايا يعبران عن VEGF و bFGF 21 ، فإننا نفترض أن عاملي النمو هذين قد يعملان كإشارات متخصصة لـ NSCs.

هناك عدد من الملاحظات التي تشير إلى أن bFGF قد يعدل أيضًا تكوين الخلايا العصبية ، كلاهما في الجسم الحي و في المختبر. أولاً ، يوجد كل من bFGF ومستقبله الرئيسي ، FGFR-1 ، في الجهاز العصبي المركزي للفأر أثناء التكوّن القشري 22. ثانيًا ، يتم إفراز bFGF من الخلايا داخل الدماغ من خلال عملية إفراز خلوي تعتمد على الطاقة 23. ثالثًا ، خلال المرحلة المبكرة من التطور ، تتكاثر الخلايا السلفية العصبية استجابةً لـ bFGF خلال المرحلة العصبية 24 ، 25. تم الإبلاغ عن أن إخراج bFGF خلال الفترات الحرجة من نمو الدماغ أدى إلى انخفاض شامل في تكاثر السلف وما تلاه من تمايز الخلايا العصبية 26 ، 27.

لتقييم أدوار VEGF و bFGF في تنظيم NSCs ، استخدمنا مجموعة متجانسة تقريبًا من NSCs المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (ES) لاختبار الفرضية القائلة بأن bFGF و VEGF ينظمان بشكل منسق انتشار NSC.


أساليب

زراعة الخلايا

تم تقديم مجاميع خلايا البنكرياس المستنفدة للجزيرة من متبرعين بشريين (10 في إجمالي عمر 39 & # x000b119 عامًا من وزن الجسم 72 & # x000b113 كجم) من قبل الدكتور غارث وارنوك والدكتور زيليانج آو في مختبر Ike Barber Human Islet Transplant Laboratory (فانكوفر ، كولومبيا البريطانية ، كندا). تم الحصول على بنكرياتا بموافقة مستنيرة مكتوبة من أفراد الأسرة بموجب موافقة مجلس أخلاقيات البحث السريري بجامعة كولومبيا البريطانية. تم غسل مجموعات الخلايا التي تم تلقيها في اليوم 0 مرتين في وسط CMRL باستخدام 10 & # x00025 مصل بقري جنيني ، و 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 & # x000b5g / mL ستربتومايسين (جميعها من Invitrogen ، Carlsbad ، CA) ، يشار إليها باسم CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS متوسط. تم بعد ذلك تفريق المجموعات أو بذرها بين عشية وضحاها في وسط CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS عند 1 & # x000b5L حجم خلية معبأة (PCV) / سم 2 (أنابيب PCV ، منتج بلاستيك تكنو ، Trasadingen ، سويسرا) في قوارير معالجة بثقافة الأنسجة (Sarstedt ، N & # x000fcmbrecht ، ألمانيا) قبل فرز الخلايا المنشط مغناطيسيًا (MACS) في اليوم الأول. تم زرع الخلايا غير المصنفة أو المصنفة عند 1.25 & # x000d710 5 خلايا / سم 2 في 0.32 مل / سم 2 CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS وسط في لوحات تحتوي على 0.32 مل / سم 2 وسط محضن مسبقًا ويتم تربيته عند 37 & # x000b0C ، 5 & # x00025 CO2 و 90 & # x00025 الرطوبة. تم تعداد الخلايا الحية عن طريق استبعاد التريبان الأزرق باستخدام عداد خلايا Cedex (Roche Innovatis ، بيليفيلد ، ألمانيا). تمت المحافظة على الثقافات غير المصنفة والمصنفة بنظام MACS في وسط CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS لمدة 8 أيام ، مع تبادل متوسط ​​في الأيام 2 و 5 و 7. لتطوير الفحص والفحص الخالي من المصل ، تم تقصير الثقافات إلى 6 أيام مع متوسط التبادل في اليومين الثاني والخامس. يتكون الوسط الخالي من المصل CMRL-0.1X ITS الأساسي من CMRL مع 0.5 مجم / لتر من الأنسولين و # x0002b0.5 مجم / لتر ترانسفيرين & # x0002b0.5 & # x000b5g / L selenite (أي 0.1 مرة I -1884 من سيجما) ، 10 ملي نيكوتيناميد و 0.2 & # x00025 BSA (STEMCELL ، BC ، كندا). احتوت حلول الاختبار على 0.1 & # x00025 أو 1 & # x00025 أو 10 & # x00025 FBS (Invitrogen) ، أو 50 & # x00025 وسيط مكيف بخلايا البنكرياس الليفية المخففة في CMRL-0.1X ITS. تم أيضًا اختبار عوامل النمو البشري المؤتلف التالية عند 20 نانوغرام / مل ما لم يذكر خلاف ذلك: عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF ، STEMCELL) ، عامل نمو البشرة (EGF ، STEMCELL) ، عامل نمو خلايا الكبد (HGF ، Sigma) ، عامل نمو الخلايا الكيراتينية ( KGF ، Sigma) ، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF ، Sigma). تمت إضافة ساعة واحدة بعد آخر تبادل متوسط ​​، 10 & # x000b5M من 5-Bromo-2 & # x02032-deoxy-uridine (BrdU ، مجموعة العلامات والكشف II ، Roche ، بازل ، سويسرا) واحتضانها لمدة 20 ساعة قبل التثبيت ، تحليل تلطيخ وسيلوميكس.

وسط مشروط

تم التعامل مع خلايا البنكرياس المخصبة (P3 إلى P8) CD90 المخصبة في CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS حتى الوصول إلى التقاء 90 & # x00025 (& # x0223c6 & # x000d710 4 خلايا / سم 2) باستخدام 10 & # x000b5g / mL ميتوميسين ج ( Sigma) لمدة 1 ساعة ، وغسلها 3 مرات واحتضانها لمدة 24 ساعة في CMRL-0.1X ITS ، ثم تعقيمها بالترشيح وتخزينها في & # x0221280 & # x000b0C.

تشتت الخلية

تم غسل مجموعات الخلايا مرتين باستخدام وسط تشتيت (1 ملي مولار EDTA من Invitrogen ، 10 ملي مولار HEPES من Sigma و 0.5 & # x00025 ألبومين مصل بقري من STEMCELL المحضر في Ca 2 & # x0002b و Mg 2 & # x0002b- خالية من HBSS من Invitrogen) ، ثم إعادة - معلق عند 0.05 مل من PCV / مل في وسط التشتت وحفظه عند 37 & # x000b0C لمدة 7 دقائق مع اهتزاز 75 دورة في الدقيقة. تم هضم المجموعات لمدة 10 دقائق عند 37 & # x000b0C عن طريق إضافة 25 & # x000b5g / mL trypsin و 4 & # x000b5g / mL DNase (Sigma). بعد إضافة وسط CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS ، تم سحن الخلايا وتصفيتها من خلال غربال نايلون 40 & # x000b5m (BD Biosciences). كان إجمالي إنتاج الخلايا على أساس PCV 43 & # x000b17 & # x00025 ، مما يوفر 168 & # x000b139 مليون خلية مشتتة حية / مل من مجموعات الأنسجة الأولية PCV.

فرز الخلايا المغنطيسية

تم غسل الخلايا الملتصقة من مجموعات غير متفرقة باستخدام محلول MACS المؤقت الذي يتكون من Ca 2 & # x0002b و Mg 2 & # x0002b - محلول ملحي خالٍ من الفوسفات (PBS) مع 1 & # x00025 FBS ، 2 مم EDTA ، 100 وحدة / مل بنسلين و 100 & # x000b5g / الستربتومايسين مل. تم تجريب الخلايا ، وسحقها بعد إضافة CMRL & # x0002b10 & # x00025 FBS المتوسطة ثم تصفيتها من خلال مصفاة خلية 40 & # x000b5m (BD Biosciences) ، مما أسفر عن 0.17 & # x000b10.05 & # x000d710 6 خلايا / سم 2 في اليوم الأول. الخلايا ثم تم غسلها مرتين باستخدام المخزن المؤقت MACS وإعادة تعليقها عند & # x022642 & # x000d710 7 خلايا / مل في & # x0226550 & # x000b5L MACS المخزن المؤقت. تمت إضافة حجم متساوٍ من الجسم المضاد الأولي للحصول على 1 & # x02236100 فأر مضاد لـ Ca19-9 (# NCL-L-CA19-9 ، Leica Microsystems ، ألمانيا) أو 1 & # x02236500 mouse anti-CD90 (# 555593 ، BD Pharmingen ، CA ). بعد الحضانة لمدة 25 دقيقة على الجليد عند تقليب 75 دورة في الدقيقة ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول MACS. تم إجراء وضع العلامات المغناطيسية باستخدام جسم مضاد IgG1 للماعز أو الفئران المسمى microbead (# 130-048-402 أو # 130-047-102 ، Miltenyi Biotec ، ألمانيا). تمت إعادة تعليق الخلايا عند 4 & # x000d710 6 خلايا / مل وفصلها باستخدام & # x0201cpossel & # x0201d (لـ Ca19-9) أو & # x0201cdepletes & # x0201d (لـ CD90) برنامج لفاصل الخلايا Automacs & # x000ae (Miltenyi). كان إجمالي إنتاج الخلية الحية من MACS 60 & # x000b13 & # x00025.

التدفق الخلوي

تم غسل الخلايا الملتصقة باستخدام PBS ، وتجريبها ، وسحنها بعد إضافة محلول FACS المؤقت (PBS & # x0002b10 & # x00025 FBS) وتصفيتها من خلال مصفاة 40 & # x000b5m. تم بعد ذلك غسل الخلايا المحفوظة على الجليد مرتين باستخدام محلول FACS ، وتوزيعها للحصول على 2.5 & # x000d710 5 خلايا / عينة ، والطرد المركزي وإعادة تعليقها في 50 & # x000b5L. بعد ذلك ، تمت إضافة 50 & # x000b5L من الجسم المضاد الأولي المخفف في محلول FACS (نفس تركيزات MACS) ، متبوعًا بحضانة لمدة 25 دقيقة عند 75 دورة في الدقيقة. تم غسل الخلايا مرتين ، وإعادة تعليقها في 50 & # x000b5L و 50 & # x000b5L من Alexa 647 المسمى IgG المضاد للفأر الماعز (A21450 ، Invitrogen) للحصول على تخفيف 1 & # x02236200. بعد 15 دقيقة من الحضانة في الظلام عند 75 دورة في الدقيقة ، تمت إضافة 10 & # x000b5L من يوديد البروبيديوم عند 100 & # x000b5g / mL (Sigma ، في PBS). تم غسل الخلايا مرتين ، وإعادة تعليقها في المخزن المؤقت 500 & # x000b5L FACS وتحليلها على مقياس التدفق الخلوي BD FACSCalibur. تم إجراء تحليل البيانات بما في ذلك التعويض باستخدام برنامج Flowjo 7.2.5 (Tree Star ، Ashland ، OR).

كيمياء الخلايا المناعية والسيلوميكس

تم إجراء تثبيت الخلايا وتلطيخها باستخدام BrdU وفقًا لتعليمات مجموعة BrdU (Roche) ، باستثناء تخفيف الأجسام المضادة الأولية والثانوية 1 & # x0223620. بالنسبة للعينات التي لا تتطلب وضع علامات على BrdU ، تم إصلاح الخلايا باستخدام مثبت Bouin لمدة 15 دقيقة وتخزينها في 70 & # x00025 من الإيثانول. تم إجراء استرجاع مستضد CK19 أو Ki67 بواسطة الميكروويف 6 مرات لمدة 5 ثوان عند 1000 واط في 10 ملي سيترات (سيغما) عند درجة الحموضة 6.0 وخلايا نفاذة بواسطة حضانة لمدة 10 دقائق في 0.25 & # x00025 Triton X 100 (Sigma) مذاب في PBS. ما لم يذكر خلاف ذلك ، كانت جميع الحضانات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة وتحريك 100 دورة في الدقيقة. تم بعد ذلك غسل جميع العينات باستخدام PBS ، واحتضانها في محلول منع (Dakocyotmation ، Glostrup ، الدنمارك) لمدة 15 دقيقة ثم تلطيخها طوال الليل عند 4 & # x000b0C مع الأجسام المضادة الأولية في الجسم المضاد المخفف (داكو). كانت الأجسام المضادة الأولية 1 & # x02236200 أنسولين خنزير غينيا مضاد للإنسان (داكو A0564) ، 1 & # x022361000 أرنب الأميليز المضاد للإنسان (سيجما A8273) ، 1 & # x02236200 فأر مضاد للإنسان CK19 (داكو M0888) ، 1 & # x02236200 فأر مضاد للإنسان vimentin (Dako M0725) ، 1 & # x0223650 أرنب مضاد للإنسان Ki67 (سانتا كروز Biotech sc-15402 ، سانتا كروز ، كاليفورنيا) و / أو 1 & # x02236200 ماوس مضاد للإنسان Ki67 (BD Biosciences 556003). في اليوم التالي ، تم غسل الخلايا ببرنامج تلفزيوني وتلطيخ ساعة واحدة في الظلام بأجسام مضادة ثانوية (Alexa 488 goat anti-guinea pig IgG ، Alexa 488 أو 568 goat anti-rabbit IgG و / أو Alexa 568 goat anti-mouse IgG ، جميعها من Invitrogen) في 1 & # x02236200 في مضاد الجسم المضاد. تم بعد ذلك غسل العينات وتلطيخها بـ 1 & # x000b5g / mL DAPI لمدة 15 دقيقة ، ثم غسلها مرة أخرى. تم تصوير اللوحات على Cellomics ArrayScan VTI. تم تركيب الشرائح باستخدام وسيط Vectashield (Vector Labs ، Burlingame ، CA) وتم تصويرها على مجهر Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا) ، باستخدام برنامج تحليل ImageJ (NIH).

تصميم التجارب والتحليل الإحصائي

تمثل النتائج متوسط ​​القيم التي تم الحصول عليها من 3 إلى 5 البنكريات و # x000b1 الخطأ المعياري للمتوسط. استندت المقارنات ثنائية الاتجاه إلى اختبارات t للطالب مع قيم p & # x0003c0.05 تعتبر مهمة ، مع استخدام اختبار t المقترن في حالة المقارنة بين رقم الخلية CK19 & # x0002b وقراءات دمج BrdU. للمقارنة بين الاستجابة القاعدية والاستجابات الطبيعية للاستجابة القاعدية ، تم استخدام فواصل الثقة بمستويات & # x003b1 0.05. تم قياس التأثيرات الرئيسية والتفاعلية لـ bFGF و EGF و HGF و KGF و VEGF من خلال تصميم عاملي كامل من مستويين (مستوى منخفض 0 نانوغرام / مل عالي المستوى 20 نانوغرام / مل) مع 8 نقاط مركزية (10 نانوغرام / مل من الكل خمسة عوامل). لكل بنكرياس ، تكررت هذه الحالات الأربعين على ثلاث طبق من 96 بئر مع عشوائية مختلفة على كل لوحة. تم تحليل النتائج باستخدام برنامج الإحصاء JMP 7.0 أو 8.0 (SAS ، Cary ، NC). تركيزات عامل النمو جأنا تم تحويلها إلى متغيرات متدرجة . كان النموذج كالتالي: حتى تأثير التفاعل من الدرجة الخامسة ، أين & # x003b2أنا تمثل القيم معلمات النموذج المجهزة. تمثل الرموز F و E و H و K و V & # x0201cأنا& # x0201d العوامل bFGF و EGF و HGF و KGF و VEGF. ثم تم تقليل النموذج لاستبعاد العوامل ذات القيم p & # x0003e0.1.


تأثير EGF و FGF على خصائص التمدد لخلايا اللحمة المتوسطة للحبل السري البشري

تم إدخال الخلايا الجذعية الوسيطة بشكل متزايد لتكون لها إمكانات كبيرة في الطب التجديدي والعلاج المناعي والعلاج الجيني نظرًا لخصائصها الفريدة للتجديد الذاتي والتمايز في سلالات خلايا متعددة. أظهرت الدراسات أن هذه الخصائص قد تكون محدودة ومتغيرة بسبب توقف النمو المرتبط بالشيخوخة في ظل ظروف استزراع مختلفة. هدفت هذه الدراسة إلى عرض قدرة بعض عوامل النمو على تمدد خلايا الحبل السري البشري ونشاط التيلوميراز. لتحسين نمو خلايا hUCM ، تم استخدام عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الأرومة الليفية (FGF) في وسط المزرعة ، وتم فحص قدرة عوامل النمو هذه على التعبير عن جين إنزيم التيلوميراز العكسي (TERT) ومراحل دورة الخلية. . زاد تعبير TERT mRNA في خلايا hUCM المعالجة بواسطة EGF و FGF. لذلك ، عبّرت خلايا hUCM غير المعالجة عن 30.49 ± 7.15٪ من TERT ، بينما عبّرت الخلايا المعالجة بـ EGF عن 51.82 ± 12.96٪ والخلايا المعالجة بـ FGF عبرت عن 33.77 ± 11.55٪ من TERT. عزز تعرض خلايا hUCM إلى EGF أو FGF أيضًا تقدم الخلايا من طور G1 إلى S من دورة الخلية وحفزها على تقليل عدد الخلايا التي تدخل مرحلة G2 / M. أظهرت دراستنا أن EGF ، وبدرجة أقل ، FGF تضخيم تكاثر وتوسيع خلايا hUCM.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


علاج عامل نمو البشرة (EGF) على الخلايا اللحمية متعددة الإمكانات (MSCs). التحسين المحتمل للقدرة العلاجية للـ MSC

تبشر الخلايا اللحمية متعددة الإمكانات في نخاع العظم البالغ (MSCs) بوعود كبيرة في الطب التجديدي وهندسة الأنسجة. ومع ذلك ، نظرًا لأعدادها المنخفضة عند الحصاد ، يجب توسيع MSCs في المختبر دون التحيز في التمايز المستقبلي لتحقيق المنفعة المثلى. في ورقة المفاهيم هذه ، نركز على الاستخدام المحتمل لعامل نمو البشرة (EGF) ، وعامل النمو النموذجي لتعزيز حصاد و / أو تمايز الخلايا الجذعية السرطانية. تم عرض عامل EGF القابل للذوبان لزيادة انتشار MSC مع الحفاظ على الأسلاف المبكرة داخل مجموعة MSC ، وبالتالي لم يحفز التمايز. ومع ذلك ، فقد تبين أن الشكل المربوط من EGF يعزز التمايز العظمي. كما تبين أن عامل النمو العشوائي القابل للذوبان يزيد من إفرازات الباراكرين بما في ذلك VEGF و HGF من MSC. وبالتالي ، يمكن استخدام EGF القابل للذوبان ليس فقط لتوسيع MSC في المختبر ، ولكن أيضًا لتعزيز إفراز الباراكرين من خلال السقالات المغلفة بـ MSC التي تطلق الدواء في الجسم الحي. يمكن أيضًا استخدام EGF المربوط لتوجيه MSC نحو النسب العظمية في المختبر وفي الجسم الحي.

1. الخلايا اللحمية متعددة الإمكانات / الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs)

1.1. لمحات عامة عن MSC

الخلايا اللحمية متعددة الإمكانات في نخاع العظم البالغ / الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي خلايا متعددة القدرات ذات أنشطة نظار قوية لعوامل نمو مختلفة [1-7]. تم عزل هذه الخلايا في الأصل على أنها مستعمرة مكونة خلايا شبيهة بالخلايا الليفية الملتصقة أو الخلايا الليفية المكونة للمستعمرة (CFU-Fs) من تعليق نخاع العظم [8] ، ولكن تم إدراك لاحقًا أن هذه الخلايا تحمل قدرة متعددة قادرة على التمايز إلى سلالات خلوية متعددة بما في ذلك بانيات العظم ، الخلايا الغضروفية ، الخلايا الشحمية ، خلايا العضلات الملساء ، الخلايا العضلية الهيكلية والقلبية ، الخلايا البطانية ، والخلايا العصبية [3-6 ، 9 ، 10].

في البداية ، اعتُبر تمايز MSC والدمج المباشر في الأنسجة المحلية التي تخضع لالتئام الجروح وتجديد الأنسجة آلية أساسية لعمل MSC ، ومع ذلك ، لا تزال مساهمة تمايز MSC والدمج المباشر في الأنسجة المتجددة موضع نقاش [11]. على سبيل المثال ، أظهرت بعض المجموعات أن الخلايا الجذعية السرطانية متمايزة ودمجت كخلايا عضلة القلب أو خلايا الأوعية الدموية (الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء الوعائية) في الأوعية المشكَّلة حديثًا في نماذج رأب القلب المستندة إلى MSC في الفئران (زرع MSC متساوي المنشأ وخيفي المنشأ) والخنازير (زرع خيفي المنشأ) ) [11-14]. تم تطعيم الخلايا الجذعية السرطانية البشرية من نخاع العظام البالغ وتم تفريقها إلى خلايا عضلية القلب داخل عضلة القلب لفئران SCID [15].في المقابل ، أظهرت مجموعة أخرى أن الخلايا المشتقة من نخاع العظم لم يتم دمجها في الأوعية الدموية المشكلة حديثًا في نقص تروية الطرف الخلفي في نموذج زرع نخاع العظم الخيفي في الفئران [16]. تم أيضًا عرض الدمج المباشر والتمايز بين MSC المزروعة في الخلايا الكيراتينية وخلايا الأوعية الدموية في نموذج التئام الجروح الجلدية للفئران (زرع MSC الخيفي) [17-19] ، بينما أظهر آخرون أن تمايز MSC المزروعة في الخلايا الكيراتينية وخلايا الأوعية الدموية لم يتم ملاحظته في نموذج التئام الجروح الجلدية (زرع MSC الخيفي) ونماذج نقص تروية أطراف الفئران (زرع MSC متساوي المنشأ) [20 ، 21]. علاوة على ذلك ، حتى عندما يُلاحظ اندماج مبكر في الأنسجة المتجددة ، فإن هذه الخلايا تختفي إلى حد كبير لمدة شهر واحد [15]. تفاوتت فعالية engraftment من MSC المزروع ، مما يشير إلى وجود آليات أخرى لتعزيز MSC بوساطة تجديد الأنسجة [7 ، 11].

إحدى هذه الآليات هي إفراز الباراكرين لعوامل النمو والسيتوكينات. من المعروف أن الخلايا الجذعية السرطانية تتمتع بقدرة قوية على الباراكرين للعديد من عوامل النمو والسيتوكينات مثل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) أو عامل نمو الخلايا الكبدية (HGF) ، والتي تعزز تكوين الأوعية الدموية والتئام الجروح [7 ، 22-24]. في الواقع ، تبين أيضًا أن الوسيط الشرطي للخلايا الجذعية السرطانية يعزز تكوين الأوعية الدموية أو التئام الجروح في النماذج الحيوانية ، مما يشير إلى الدور الحاسم لعمل paracrine MSC في تعزيز تكوين الأوعية الدموية والتئام الجروح [21 ، 23 ، 25].

1.2. في المختبر توسيع MSCs

التوجه الرئيسي هو استخدام MSCs دوائيا. حتى إذا كان التورط الفسيولوجي للخلايا الجذعية الوسيطة محل نقاش ، فقد أظهرت الدراسات حقنة الخلايا الجذعية الوسيطة في موطن الأنسجة المصابة [1 ، 2 ، 4 ، 5]. ومع ذلك ، فإن توافر عدد كافٍ من MSCs التي تحتفظ بنشاطها متعدد القدرات والباراكرين يعد شرطًا أساسيًا للعلاجات وهندسة الأنسجة الناجحة القائمة على MSC. لا توجد الخلايا الجذعية السرطانية إلا بتردد منخفض في نخاع العظام (واحد في

الخلايا أحادية النواة لنخاع العظم ، التردد المنخفض في المضيفين المسنين) [5 ، 26] ، وبالتالي ، يجب توسيع الخلايا الجذعية السرطانية التي يتم حصادها من نخاع العظم للاستخدامات الدوائية في المختبر. هذه الخلايا قابلة للتوسيع في المختبر [3 ، 27] وهذه إحدى الخصائص المرغوبة حول MSCs.

تيار في المختبر تعتمد استراتيجيات التوسع بشكل عام على استخدام مصل الأبقار الجنيني ، ولكن هذه الممارسة لا تحمل فقط مخاطر مرضية متأصلة [28] ولكنها تعيق أيضًا التوحيد القياسي الذي يعد أمرًا حاسمًا لإنشاء اعتماد سريري واسع النطاق. هناك مشكلة أخرى تتعلق بالتوسع الحالي في MSC وهي فقدان الإمكانات التفاضلية والتكاثرية والعلاجية لـ MSCs من خلال في المختبر عملية التوسع [29 ، 30]. وبالتالي ، هناك دافع قوي لتحديد العوامل التي يمكن استخدامها في التركيبات الخالية من المصل لتوسيع MSC في المختبر دون فقدان القدرة على التمايز والحفاظ على التجديد الذاتي والإمكانيات العلاجية للخلايا الجذعية غير المتمايزة [31].

وجد تقرير حديث أن مجموعة من عوامل النمو المحولة-β (TGF-β) ، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF)، ويمكن أن تحل عوامل نمو الأرومة الليفية الأساسية (bFGF) محل مكون المصل في وسط زراعة الخلايا لتوسيع الخلايا الجذعية السرطانية البشرية خارج الجسم الحي دون المساومة على إمكانات التمايزس، ما لا يقل عن 5 مقاطع [32]. بعد ذلك ، أصبحت وسائط ثقافة MSC الخالية من المصل والحيوان (STEMPRO MSC SFM ، من Invitrogen ، Carlsbad ، CA) (MesenCult-ACF Culture Kit ، من STEMCELL Technologies ، فانكوفر ، كندا) متاحة في السوق. يدعي المصنعون أن وسائط الثقافة تمارس إمكانات انتشار MSC فائقة مع الحفاظ على إمكانات التمايز وإمكانات تكوين المستعمرات ، كما تدعمها دراسة واحدة على الأقل [33]. يجب أن تكون هذه الوسائط المحددة كيميائيًا أكثر أمانًا وبالتالي أفضل للإعدادات السريرية ، على الرغم من أن التركيب الخاص بهذه الوسائط الثقافية قد يعيق القبول في الاستخدام قبل السريري والسريري.

1.3 السكان غير المتجانسين في استعدادات MSC

على الرغم من أن MSCs تمتلك إمكانات تكاثرية واسعة ، ولديها القدرة على التجديد الذاتي ، وتؤدي إلى سلالات متباينة ، فقد تبين أن جميع مجموعات MSC التي تم تحليلها بواسطة فحوصات استنساخية غير متجانسة، مع خلايا فردية قادرة على تمايز إمكانات مختلفة وقدرة على التوسع [34]. وهكذا ، اقترحت الجمعية الدولية للعلاج الخلوي تسمية الخلايا الجذعية السرطانية باسم الخلايا اللحمية اللحمية متعددة الإمكانات، والتي يمكن أيضًا اختصارها كـ MSCs [35]. سكان MSC في المختبر من المعروف أنها تشمل أسلافًا مبكرة أو خلايا سريعة التجديد الذاتي (RS) بالإضافة إلى خلايا كبيرة بطيئة التكاثر الناضجة / المتشيخة. من الأسلاف المبكرة أو خلايا RS هي التي تحتفظ بتعدد إمكانات قوية للتمايز. في المقابل ، تمتلك الخلايا الناضجة / الشائخة إمكانات تمايز محدودة فقط ، وتهيمن هذه الخلايا في الخلايا الجذعية السرطانية المتعددة المارة [27 ، 29 ، 36].

واحدة من الخصائص البارزة حول الخلايا الجذعية السرطانية هي قدرتها على إنتاج مستعمرات بعد زرعها بكثافة منخفضة [8]. يعتمد توليد مستعمرة مشتقة من خلية واحدة على وجود أسلاف مبكرة أو خلايا RS في مستحضرات MSC. بعبارة أخرى ، يمكن استخدام تقييم وحدة تكوين المستعمرة (CFU) لقياس نسبة المستعمرة التي تشكل أسلافًا مبكرة في مجتمع MSC [29 ، 37 ، 38]

تم إظهار عدد MSC داخل الخلايا وحيدة النواة لنخاع العظم يتناقص مع تقدم العمر [26]. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن كلا من MSCs من المتبرعين القدامى والخلايا الجذعية ذات المرور المرتفع قد قللوا من نشاط paracrine وقللوا من تأثيرات حماية الأعضاء عند الزرع [30 ، 39]. تشير هذه التقارير بوضوح إلى أهمية الحفاظ على الأسلاف المبكرة أو خلايا RS في إعداد MSC للحفاظ على الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية السرطانية.

1.4 توسع MSC وإمكانيات التمايز

للحفاظ على الأسلاف المبكرة داخل مجموعات MSC ، يجب الحفاظ على التجديد الذاتي لهذه الخلايا أو حتى تعزيزها من خلالها في المختبر عملية توسيع MSC. خلاف ذلك ، سيتم فقدان الأسلاف المبكرة أثناء في المختبر توسع. انقسام الخلايا هو خطوة مركزية للتجديد الذاتي وتوسيع هذه الخلايا. هناك العديد من عوامل النمو والسيتوكينات المعروفة بأنها تعمل كميتوجين ، ولكن عوامل النمو المثالية لها في المختبر يجب أن يقمع توسع MSC بشكل عكسي أو على الأقل لا يغير عملية التمايز اللاحقة. بمعنى آخر ، يجب ألا تقلل هذه العوامل من إمكانات التمايز للخلايا الجذعية الوسيطة. لا يمكن استخدام عوامل النمو أو السيتوكينات التي تعزز تمايز الخلايا الجذعية السرطانية في سلالات معينة في المختبر توسع MSC ، حيث أن عملية التمايز نفسها تتعارض مع التجديد الذاتي للخلايا الجذعية غير المتمايزة بما في ذلك الأسلاف المبكرة ، ومن شأن التمايز أن يضر باستخدام هذه الخلايا.

من بين عوامل النمو هذه ، ركزنا على عامل نمو البشرة (EGF) كمرشح للاستفادة منه في المختبر توسيع MSCs حيث يحفز EGF انتشار MSC دون تغيير عملية التمايز والإمكانات [3].

2. EGF لتعزيز التجديد الذاتي وتوسيع MSCs في المختبر

2.1. مستقبلات EGF و EGF

تم عزل EGF في الأصل من مستخلص الغدد اللعابية للفأر كعامل يسرع التئام جرح القرنية [40] ، ولكن سرعان ما تم التعرف على أنه بالفعل عامل نمو عام يمارس العديد من الإجراءات بما في ذلك هجرة الخلايا والتكاثر على مجموعة متنوعة من الخلايا [41] –43].

مُستقبل EGF (EGFR / ErbB-1 أو مستقبل عامل نمو البشرة البشري 1 (HER1)) هو مستقبل عامل النمو النموذجي مع نشاط كيناز التيروزين الداخلي. يتم التعبير عنه على نطاق واسع في العديد من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الأنساب الظهارية واللحمة المتوسطة [42]. عند ربط ما لا يقل عن خمسة روابط جينية متميزة (بما في ذلك EGF ، وتحويل عامل النمو-

(TGF-) ، و EGF المرتبط بالهيبارين (HB-EGF)) ، يتم تنشيط كيناز التيروزين الجوهري داخل EGFR / ErbB-1 ويفسفر المستقبل نفسه (الفسفرة الذاتية) والعديد من جزيئات المصب المستهدفة. تشتمل مسارات الإشارات داخل الخلايا في اتجاه مجرى EGFR / ErbB-1 على phosholipase C

(PLC) وشلالات الكالسيوم والبروتين كيناز سي المصب (PKC) ، تنشيط ras الذي يؤدي إلى العديد من كينازات البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK) ، وغيرها من GTPases الصغيرة مثل rho و rac ، ومحول إشارة متعدد ومنشط النسخ (STAT ) الأشكال الإسوية ، وبروتينات G غير المتجانسة ، فوسفاتيديلينوسيتول

-أوه كيناز (PI3K) وفوسفوليباز د (PLD) [3 ، 42 ، 43].

عند الارتباط والتنشيط بالـ ligand ، يخضع EGFR / ErbB-1 للاستيعاب من سطح الخلية عبر نظام الالتقام المغلف بالكالاثرين. داخل مقصورة الاندوسوم الحمضي المتأخر ، يخضع كل من EGF و EGF المرتبط بـ EGFR / ErbB-1 للتدهور لأن EGF عبارة عن رابط غير فصامي لـ EGF ، بينما يتم إعادة تدوير TGF- -bound EGFR / ErbB-1 إلى سطح الخلية بعد تفكك TGF- من EGFR / ErbB-1 [42]. هناك أدلة متزايدة تشير إلى أن التنشيط التفضيلي والمطول لـ EGFR / ErbB-1 من سطح الخلية يمارس نشاطًا متميزًا من EGFR / ErbB-1 الداخلي ، حيث يعزز EGF المرتبط بالسطح انتشار الخلايا وبقاء MSCs ، في حين أن EGF القابل للذوبان لا (انظر المناقشة أدناه) [44].

2.2. EGF يعزز انتشار MSC

EGF هو ميتوجين نموذجي لأنواع مختلفة من الخلايا. تعبر MSCs البشرية عن EGFR / ErbB-1 ، وقد أظهرنا نحن وآخرون التأثير الانقسامي لـ EGF و HB-EGF على MSCs [3 ، 45]. يعد تكاثر الخلايا جزءًا لا يتجزأ من التجديد الذاتي وتوسيع الخلايا ، وبالتالي تدعم هذه البيانات فرضيتنا القائلة بإمكانية استخدام EGF من أجل في المختبر توسع MSC ، على الأقل في إعداد الثقافة قصيرة الأجل ، ومع ذلك ، تصبح التأثيرات الإضافية لعلاج EGF على انتشار MSC البشري أقل وضوحًا في الثقافة طويلة الأجل (الشكل 1) ، ويفترض أن ذلك يرجع إلى التنظيم السفلي لـ EGFR / ErbB1 ، كما هو موضح أدناه .


(أ)
(ب)
(أ)
(ب) تأثير EGF على انتشار MSC البشري الأولي (أ) ومضاعفة السكان التراكمي (PD) (ب). (أ) يزيد عدد خلايا MSCs الأولية البشرية بحوالي 5.5 ضعفًا في المادة المخففة (Ctrl) في وسط المزرعة المكمّل بـ 17٪ FBS في 120 ساعة (5 أيام) فترة زمنية. تعطي إضافة EGF (10 نانومتر) زيادة إضافية في عدد الخلايا إلى 8.5 ضعفًا. تم بذر ما مجموعه 10000 خلية لكل بئر في لوحة 12 بئرًا وتم قياس عدد الخلايا لكل بئر بواسطة Coulter Cell Counter Z2 (Beckman Coulter ، Inc. Fullerton ، CA). المبينة تعني

في الشهر من ثلاث تجارب أجريت كل منها في ثلاث نسخ. تمت مقارنة الفروق في الانتشار بين عامل النمو والمخفف (Ctrl) المكشوف (*

). (ب) تراكم PD من MSCs البشرية الأولية في اليوم 5 و 19 في حالة الثقافة مثل (أ). بعد عد الخلايا في اليوم الخامس ، تم بذر عدد متساوٍ من الخلايا (إجمالي 1000) لكل بئر في لوحة 6 آبار وتم قياس عدد الخلايا لكل بئر في اليوم 19 بواسطة Coulter Cell Counter Z2 (Beckman Coulter ، Inc. ، كاليفورنيا). لاحظ أن PD أعلى في المجموعة المعالجة بـ EGF (2.54 في Ctrl ، 3.07 في EGF) للأيام الخمسة الأولى (*

الجانب الثاني للتوسع هو الحفاظ على وحدات تشكيل المستعمرات. في هذا الجانب ، يكون علاج EGF ناجحًا أيضًا. يؤدي EGF إلى زيادة ذات دلالة إحصائية بنسبة 25 ٪ في المستعمرات القابلة للتلطيخ (الشكل 2) ، مما يشير إلى أن علاج EGF يساعد في الحفاظ على الأسلاف المبكرة داخل مجموعات MSC البشرية.


(أ)
(ب)
(أ)
(ب) آثار علاج EGF (10 نانومتر) على تكوين مستعمرة MSC البشرية الأولية. تم زرع خمسمائة خلية في طبق 10 سم داخل وسط زراعة مكمل بـ 17٪ FBS وعدد المستعمرات المشكلة (القطر

تم عد 1.5 مم) يدويًا في اليوم 14. (أ) صورة تمثيلية لمستعمرات MSC الملطخة باللون البنفسجي الكريستالي. (ب) عدد مستعمرات MSC. يتم إعطاء عدد المستعمرة لكل 1000 خلية مصنفة في البداية (*

2.3 إمكانيات التمايز EGF و MSC

تعد إمكانية تعدد التمايز سمة أساسية من سمات الخلايا الجذعية السرطانية ، والتي تجذب الكثير من الاهتمام في مجال هندسة الأنسجة والطب التجديدي [4 ، 5]. يجب الحفاظ على إمكانات التمايز نفسها من خلال في المختبر توسيع MSCs ومع ذلك ، يجب قمع عملية التمايز المستمرة نفسها أو عدم تحريضها على الأقل لأنها تعارض التجديد الذاتي وتوسيع MSCs غير المتمايزة وتحد من الاستخدام الإضافي لهذه الخلايا.

أظهرت Kratchmarova وزملاؤها أن تحفيز EGF يعزز التمايز العظمي للخلايا البشرية MSCs في وجود إشارات كيميائية ، في حين أن PDGF لا يفعل ذلك [46]. من خلال نهج البروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي ، حددوا PI3K كمفتاح جزيئي لإيقاف الإشارة المؤيدة لتكوين العظم من PDGFR.

هذا التقرير مخالف لتقارير مجموعتنا وغيرها. تُظهر بياناتنا أن EGF وحده لا يؤدي إلى التمايز في حالة عدم وجود إشارات كيميائية أو غيرها من الإشارات ، ولا يغير عمليات تمايز MSC البشرية إلى سلالات عظمية ، وشحمية ، وغضروفية عن طريق الإشارات الكيميائية في المختبر [3]. قد يُعزى هذا الاكتشاف المتضارب إلى إشارات مختلفة داخل الخلايا ، حيث يتم تنشيط مسار PI3K-protein kinase B / akt في اتجاه مصب EGFR / ErbB-1 في تقريرنا [3] ، بينما لم يتم تنشيط هذا المسار في تقريرهم [46] ]. السبب الواضح لهذا التناقض غير واضح ، ولكن أحد الاختلافات البارزة هو تركيز EGF 10 نانومتر تم استخدام EGF في تقريرنا [3] ، بينما استخدمت Kratchmarova وزملاؤها 83 نانومتر من EGF في تقريرهم [46]. هذه التكهنات مدعومة بتقرير حديث يظهر أن 80 pM EGF يثبط التمايز العظمي للخلايا الجذعية البشرية MSCs [47]. أظهر كرامبرا وزميله أيضًا أن HB-EGF (2.3 نانومتر) يثبط التمايز العظمي للـ MSC الناجم عن الإشارات الكيميائية [45]. لا تعبر MSCs البشرية عن ErbB-4 ، وهو مستقبل آخر لـ HB-EGF ، يرتبط كل من EGF و HB-EGF فقط بـ EGFR / ErbB-1 على MSC ، كما أن سلسلة الإشارات النهائية متشابهة [3 ، 45].

هل تمارس ناهضات EGFR / ErbB1 تأثيرات إيجابية وسلبية على التمايز العظمي لـ MSC بطريقة تعتمد على التركيز؟ وإذا كان الأمر كذلك ، فما هي الآلية الأساسية؟ لا يزال هذا السؤال بدون حل ، لكننا نحن والمتعاونين معنا نستخدم سطح EGF المعطّل المربوط بطريقة توفر بعض التلميحات المهمة [44 ، 47]. يحظر EGF المربوط الاستيعاب الداخلي للخلية الداخلية EGFR / ErbB1 ويعزز التمايز العظمي من خلال توفير التنشيط المستمر للإشارات النهائية من خلال EGFR / ErbB1 ، بينما يتداخل 80 pM من EGF القابل للذوبان مع التمايز العظمي من خلال تحفيز استيعاب المستقبل والتدهور اللاحق [47] ، بالاتفاق مع بيانات Krampera [45]. وبالتالي ، فإننا نفترض أن الإشارات الضعيفة والزمنية من التركيز المنخفض لـ EGF القابل للذوبان تمارس تأثيرات مضادة لتكوين العظم ، في حين أن الإشارات القوية المستمرة من EGF المربوطة تمارس إشارات مؤيدة لتكوين العظم على MSC (الشكل 3). أظهرت التقارير السابقة أن تنشيط مسار ERK / MAPK ، وهو أحد مسارات الإشارات الرئيسية في اتجاه مصب EGFR / ErbB-1 [3 ، 42] ، يعزز التمايز العظمي المنشأ لـ MSC [48-50]. بالاتفاق مع هذه التقارير ، لوحظ تنشيط قوي ومستدام لمسار ERK / MAPK في MSCs المزروعة على سطح EGF المربوط [44 ، 47] ، وبالتالي ، قد يكون مسار ERK / MAPK أحد مسارات الإشارات الرئيسية المؤيدة لتكوين العظام في المصب من EGFR / ErbB-1.


نموذج مبسط لتأثيرات إشارات EGFR / ErbB1 على التمايز العظمي المنشأ MSC. يؤدي التحفيز الضعيف والزمني لـ EGFR / ErbB1 إلى تأثيرات مضادة لتكوين العظام ، في حين أن التحفيز القوي والمستمر لـ EGFR / ErbB1 يؤدي إلى تأثيرات مؤيدة لتكوين العظام على MSC.

تشمل الأسباب المحتملة الأخرى للتناقض العام حول تأثيرات EGF على تمايز MSC عدم تجانس مستحضرات MSC البشرية بما في ذلك الأولية أو الخالدة. استخدمت كراتشماروفا وزملاؤها الخلايا الجذعية التي تم تخليدها بواسطة النسخ العكسي للتيلوميراز البشري (hTERT) [46] ، في حين استخدم كرامبيرا وزملاؤه الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية الأولية [45]. استخدمنا ومجموعة جريفيث أيضًا استنساخ AOC (منشط شحمي ، منشط للعظم ، غضروفي) لخلايا MSCs بشرية تم تخليدها بواسطة hTERT [3 ، 47 ، 51]. نظرًا لأنه تم اشتقاق MSCs الخالدة من استنساخ واحد ، فمن المحتمل أن تكون النتائج المتناقضة بين مجموعة Kratchmarova ومجموعتنا ناتجة عن تحيز اختيار الاستنساخ. يوجد عدم التجانس حتى في الإعداد الأولي أيضًا. إن مستويات التعبير عن EGFR / ErbB-1 متغيرة بدرجة كبيرة في كل نسخة من إعداد MSC البشري ، وتصل إلى 77 ضعفًا بين الحيوانات المستنسخة [52]. في هذا التقرير ، لم يلاحظ أي ارتباط كبير بين مستويات EGFR / ErbB-1 وقدرة التمايز العظمي ، على الرغم من أن مستويات EGFR / ErbB-1 في المتوسط ​​كانت أعلى في المستعمرات غير المكونة للعظام من المستعمرات المكونة للعظام. ظهرت أنماط فسفرة البروتين التيروزين في اتجاه مجرى EGFR / ErbB-1 غير متجانسة بين المستعمرات أيضًا. وبالتالي ، فمن المحتمل أن عدم التجانس موجود ليس فقط في مستويات التعبير EGFR / ErbB-1 ، ولكن أيضًا في مسارات الإشارات النهائية من EGFR / ErbB-1 حتى داخل نفس إعداد MSC ، والذي يجب أن يساهم أيضًا في التناقض العام حول آثار EGF على تمايز MSC.

كما نرى أعلاه ، لا تزال التقارير حول ناهضات EGFR وتأثيرها على تمايز MSC المستمر تقدم توجيهات متناقضة بسبب ظروف EGF المختلفة والمحفزات الخارجية. ومع ذلك ، نحتاج إلى التأكيد على أن كلاً من تقريرنا وتقرير Krampera يتفقان على أن علاج EGF أو HB-EGF لا يقلل من إمكانات التمايز MSC [3 ، 45]. لا توجد تقارير تشير إلى أن EGF وحده في حالة عدم وجود إشارات كيميائية تكوّن العظم يعزز التمايز العظمي للخلايا الجذعية MSCs. في المختبر لم يتم تغيير تمايز MSC إلى سلالات شحمية وغضروفية بواسطة EGF القابل للذوبان [3]. وبالتالي ، لا يزال من الممكن استخدام EGF القابل للذوبان لتوسيع MSCs في المختبر دون إحداث تمايز أو التضحية بإمكانيات التمايز.

3. علاج EGF لتعزيز الإمكانات العلاجية لـ MSC

3.1. EGF يعزز حركة MSC

تشارك العديد من الأنشطة الخلوية والهرمونية والمصفوفة والأنزيمية في عمليات إصلاح الجروح وتجديد الأنسجة. EGF هو أحد عوامل النمو المحورية الموجودة في طبقة الجرح ، مما يسرع من إصلاح الجرح إلى جانب عوامل النمو الأخرى مثل PDGF. ثبت أن التطبيق الموضعي لعامل EGF المؤتلف يسرع عملية التئام الجروح بما في ذلك قرحة القدم السكرية [53 ، 54].

يفرز EGF من الصفائح الدموية والضامة في الأنسجة المصابة [55]. HB-EGF متوفر بكثرة في ECM [56]. يحفز كل من EGF و HB-EGF انتشار وهجرة الخلايا الليفية والخلايا الكيراتينية. وبالمثل ، تحتاج الخلايا الجذعية السرطانية المزروعة في الأنسجة المصابة إلى التكاثر وإعادة التكاثر لتعزيز عمليات التئام الجروح وتجديد الأنسجة في العلاجات القائمة على MSC. أظهرنا وآخرون أن كلاً من EGF و HB-EGF يثيران استجابة متولدة ومحفزة للـ MSCs في المختبر [3 ، 45 ، 52]. وبالتالي ، يُفترض أن الاستجابات الانقسامية والمتحركة التي يسببها عامل النمو البشري (EGF) تلعب دورًا في تنظيم تكاثر الخلايا الجذعية السرطانية وإعادة توطينها في الأنسجة المصابة.

لا توجد روابط EGFR / ErbB1 في شكل قابل للذوبان فحسب ، بل توجد أيضًا في تكرارات متعددة تشبه EGF لجزيئات المصفوفة خارج الخلية مثل tenascin و laminin في الجسم الحي [57]. لقد أظهرنا سابقًا أن هذه التكرارات الشبيهة بـ EGF داخل tenascin C ترتبط بـ EGFR / ErbB1 وتنتج إشارات داخل الخلايا تعزز حركية الخلية والالتصاق ، على غرار EGF المربوط [58 ، 59]. يتم إنتاج Tenacin C بواسطة الخلايا الكيراتينية والأرومات الليفية أثناء عملية التئام الجروح ، وبالتالي يمكن أن تكون بمثابة روابط داخلية شبيهة بـ EGF وتنتج مسارات مبكرة للخلايا الليفية أو الخلايا الجذعية الوسيطة المزروعة داخل حواف التئام الجروح [57 ، 60].

على الرغم من أن الحركة تمكن MSC من إعادة وضع نفسها في الأنسجة المصابة ، إلا أنها قد تتحكم بدقة في في الجسم الحي صعوبة توزيع الخلايا. يتمثل أحد الأساليب الممكنة في إنشاء تدرجات تركيز أو أنماط من EGF المربوطة داخل سقالات MSC المدمجة.يتم الحفاظ على النشاط المحفز لعامل النمو في العين في الشكل المربوط ، حيث تم الإبلاغ عن انتقال الخلايا الكيراتينية البشرية على تدرجات عامل النمو EGF المربوطة في اتجاه تركيز أعلى لعامل النمو في العين [61]. يسمح الشكل المربوط لـ EGF بالتحكم الأكثر دقة في تركيز EGF والنمذجة داخل البيئات الدقيقة للأنسجة وواحد يدوم لفترة أطول. يجب أن يكون ربط الترابط المتحرك بالمصفوفة المكونة للفضاء أداة قوية في مجال هندسة الأنسجة.

3.2 EGF يعزز أنشطة Paracrine من MSC

تعتمد العلاجات القائمة على MSC بشكل كبير على القدرة القوية على إفراز عوامل النمو المختلفة والسيتوكينات لتعزيز تكوين الأوعية وإصلاح الجروح وتجديد الأنسجة [7 ، 21-25]. يلزم زرع الخلايا الجذعية السرطانية في الأنسجة المصابة ، والتي تفشل في التئامها بطريقة أخرى. في الجسم الحي تتميز البيئات الميكروية لهذه الجروح غير الملتئمة بنقص الأكسجين والمغذيات بسبب ضعف تدفق الدم والوسطاء الالتهابيين الوافدين [62-64]. هناك حاجة إلى MSCs لإنتاج جزيئات نشطة بيولوجيًا حتى في تلك البيئات القاسية لممارسة تأثيرات تجديد الأنسجة. في الواقع ، أظهر عامل نخر الورم الوسيط المنبه للالتهاب ألفا (TNF-) أو السكاريد الدهني (LPS) لتعزيز وظائف paracrine و autocrine لـ MSCs [65]. أيضًا ، أظهر TGF- ، وهو يجند EGFR / ErbB1 آخر ، زيادة إفراز VEGF من MSCs التي تم تنظيمها بالفعل بواسطة تحفيز TNF- بطريقة تعتمد على p42 / 44 MAPK [66 ، 67].

لنا في المختبر أظهرت البيانات أن علاج EGF لـ MSCs يعزز أيضًا إفراز VEGF و HGF ، ولكن ليس bFGF (الشكل 4) ، بالاتفاق مع دراسة سابقة [65]. يلعب كل من VEGF و HGF دورًا محوريًا في التئام الجروح المتسارع بوساطة MSC من خلال تحفيز تكوين الأوعية وتحسين إمدادات الأكسجين للأنسجة الدماغية [7 ، 21 ، 68-70].


(أ)
(ب)
(ج)
(أ)
(ب)
(ج) آثار علاج EGF (10 نانومتر) على أنشطة paracrine من MSCs الأولية البشرية. تم تربيتها MSCs في وسط ثقافة خالية من المصل مع وبدون EGF (10 نانومتر) لمدة 24 ساعة. تم قياس تركيزات VEGF (a) و HGF (b) و bFGF (c) داخل الوسائط المكيفة بواسطة ELISA وتم توحيدها مع الكمية الإجمالية لمحتويات البروتين الخلوي (*

وبالتالي ، فمن المحتمل أن روابط EGFR / ErbB1 القابلة للذوبان (TGF- و EGF و HB-EGF) تعزز وظائف paracrine و autocrine لـ MSCs ليس فقط في المختبر، ولكن أيضا في الجسم الحي، حتى في البيئات الميكروية الالتهابية داخل الأنسجة المصابة التي لا تلتئم. من المحتمل أيضًا أن يعزز EGF المربوط وظائف paracrine و autocrine في MSCs في المختبر إلى جانب في الجسم الحي من خلال التنشيط القوي والمستدام لمسار P42 / 44 MAPK في اتجاه المصب من EGFR / ErbB1 [44]. يتم تكهن كل من روابط EGFR / ErbB1 القابلة للذوبان والمربوطة لتعزيز التئام الجروح وعملية تجديد الأنسجة من خلال تحفيز إفراز عوامل النمو الوعائية من الخلايا الجذعية السرطانية المزروعة في الجسم الحي. هناك ما يبرر إجراء مزيد من الدراسات لتوضيح دور روابط EGFR / ErbB1 القابلة للذوبان و EGF المربوطة على تأثيرات paracrine و autocrine لـ MSCs في المختبر إلى جانب في الجسم الحي.

3.3 هل يعزز EGF الإمكانات العلاجية لـ MSC؟

يحفز EGF تكاثر الخلايا ويعزز التجديد الذاتي لـ MSCs ، وخاصة الأسلاف المبكرة غير المتمايزة داخل تحضيرات MSC في المختبر. يعد وجود الأسلاف المبكرة أمرًا بالغ الأهمية بالنسبة للعلاجات القائمة على MSC ، حيث إن الخلايا الجذعية الوسيطة من المتبرعين القدامى والخلايا الجذعية الوسيطة عالية المرور قد قللت من نشاط الباراكرين وتقليل تأثيرات حماية الأعضاء عند الزرع ، ويفترض من خلال فقدان الأسلاف المبكرة [27 ، 29 ، 30 ، 36 ، 39 ]. يعزز علاج EGF أيضًا حركة الخلية ، وهو أمر مطلوب لإعادة توطين الخلايا الجذعية السرطانية داخل سرير الجرح. يزيد علاج EGF أيضًا من إفراز الباراكرين لـ VEGF و HGF ، وكلاهما يعزز تكوين الأوعية ويعزز التئام الجروح وتجديد الأنسجة كما أنه يحفز الخلايا الملتصقة الموجودة داخل سرير الجرح. مجتمعة ، من المعقول أن نفترض ذلك في المختبر يعزز علاج MSC باستخدام روابط EGFR / ErbB1 الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة. يمكن اختبار هذا بواسطة في الجسم الحي دراسة.

من المعقول أيضًا افتراض أن تحفيز EGFR / ErbB1 على MSC يعزز الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الوسيطة في الجسم الحي، على الأرجح من خلال زيادة نشاط paracrine وممارسة الأنشطة الانقسامية والمحفزة للخلايا الجذعية. السقالات القابلة للتحلل هي طريقة واعدة لدعم توصيل الخلايا وتكاثرها وتمايزها [71]. كما تتوفر سقالات توصيل الأدوية أو سقالات إطلاق عامل النمو ، والتي تتيح التحكم في إطلاق عامل النمو [72]. توافر EGF أقل قابلية للتنبؤ في الجسم الحي الإعداد ومع ذلك ، فإن السقالات بطيئة تحرير EGF تسمح بالتنبؤ بشكل أفضل بتركيز EGF داخل البيئات الدقيقة في الجسم الحي ، هكذا، في المختبر النتائج يجب أن تترجم بشكل أفضل إلى في الجسم الحي يمكن تقييم الإعدادات ودور EGF في العلاجات المستندة إلى MSC بشكل أفضل.

بالإضافة إلى روابط EGFR / ErbB1 القابلة للذوبان ، قد يمنح EGF المربوط إمكانات علاجية أقوى على الخلايا الجذعية السرطانية. أولاً ، يمارس EGF المربوط تأثيرات تكاثرية وواقعية للخلايا على MSCs [44 ، 73]. تعتمد التأثيرات العلاجية لـ MSC إلى حد كبير على عدد MSC المحقون [19] ومع ذلك ، فإن قابلية البقاء المنخفضة للخلايا الجذعية المتقدمة بعد الزرع تحد من الفعالية الإجمالية للعلاجات القائمة على MSC بسبب البيئات الدقيقة القاسية [15 ، 74]. وبالتالي ، فإن تحسين بقاء MSC بعد الزرع يجب أن يزيد من فعالية العلاجات القائمة على MSC. ثانيًا ، يوفر EGF المربوط إشارات مؤيدة لتكوّن العظام لـ MSCs ، وبالتالي يمكن استخدامها في كليهما في المختبر و في الجسم الحي التمايز العظمي المنشأ للخلايا الجذعية السرطانية قد تلعب هذه الآلية دورًا مهمًا في الجسم الحي، مثل laminin 5 ، الذي يحتوي على تكرارات تشبه EGF ، وقد ثبت أنه يحفز التمايز العظمي للخلايا الجذعية البشرية من خلال تنشيط ERK داخل أنسجة العظام [75]. وبالتالي ، يمكن أن تكون السقالة المضمنة في MSC مع EGF المربوطة قابلة للتطبيق على الدراسات البشرية الحالية مثل العظم الناقص [76-78].

يكمن التحدي المتمثل في ترجمة النتائج النظرية إلى الأسِرّة دائمًا في الانتقال من في المختبر إلى في الجسم الحي دراسات ثم في الناس. بينما لا يمكننا توقع جميع العقبات ، فإن التحدي الرئيسي في هذه الترجمة ينطوي على الوضع الالتهابي والقضايا المناعية. في حالة الأخير ، يكون هذا موضع نقاش إذا كانت الخلايا MSCs ذاتية ، ولكن MSCs الخيفي مفيدة أيضًا ، خاصة للمرضى المسنين ، مثل حصاد MSC وما بعده خارج الجسم الحي قد يقتصر التوسع على هؤلاء السكان [26 ، 39]. الطبيعة المثبطة للمناعة لـ MSC تجعل الزرع الخيفي ممكنًا [26]. الالتهاب غير المحدد بسبب أي جسم غريب هو شيء لا يمكن تجنبه. في الواقع نقترح أن يضفي عامل النمو العكسي المربوط مقاومة لإشارات الموت على MSCs [44]. لا يزال المزيج المعقد من السيتوكينات الالتهابية والكيموكينات قد يغير الاستجابة لروابط EGFR / ErbB1 بطرق غير متوقعة. أخيرًا ، إذا كانت الاستجابة الالتهابية تتجه نحو التليف ، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة تخاطر بأن تكون معزولة عن موقع الإصابة. هناك تحدٍ آخر محتمل للترجمة إلى البشر وهو الحالات المرضية الكامنة ، حيث غالبًا ما يتعرض توصيل المغذيات وإمدادات الأكسجين وإزالة المستقلبات السامة للخطر الشديد لدى هؤلاء السكان [62-64] في مرض السكري ، يؤثر ارتفاع السكر في الدم أيضًا على مسارات إشارات EGFR [79 ، 80 ]. ستؤثر هذه البيئات الدقيقة القاسية ، مع تغيير درجة الحموضة خارج الخلية ، على سلوك MSC بطريقة لا يمكن التنبؤ بها. هذا هو السبب في أننا نتحرك بسرعة لاختبار هذه النماذج في نماذج حيوانية تواجه تحديات متزايدة.

4. خاتمة

تشير الدراسات السابقة إلى أن EGF يسهل توسع المستعمرة التي تشكل أسلافًا مبكرة في مجتمع MSC دون التسبب في التمايز أو المساس بإمكانيات التمايز. يعزز علاج EGF أيضًا نشاط paracrine لـ MSC ، على الأقل إنتاج VEGF و HGF ، وكلاهما محوريان في التئام الجروح وتجديد الأنسجة. يمكن استخدام EGF لتعزيز التوسع وأنشطة paracrine من MSCs في المختبر، على الأقل مع العلاج قصير الأمد مع EGF. ل في الجسم الحي الإعدادات ، يمكن دمج EGF في سقالات إطلاق عامل النمو التي تغلف MSC لزيادة انتشار MSC وعمل paracrine. يمكن أيضًا دمج الشكل المربوط من EGF في السقالة للتحكم في التمايز العظمي لتوزيعات MSCs أو MSC في الجسم الحي. تم تلخيص أدوار روابط EGFR / ErbB1 وإشارات المصب من EGFR / ErbB1 في فسيولوجيا MSC في الشكلين 5 و 6. بشكل عام ، يجب أن يكون من المعقول استخدام EGF لتوسيع MSC في المختبر، وتعزيز الإمكانات العلاجية MSC في الجسم الحي، وتنظيم التمايز MSC على حد سواء في المختبر و في الجسم الحي.


رسم تخطيطي مبسط لمسارات إشارات EGFR / ErbB1 في فسيولوجيا MSC. تعمل روابط EGFR / ErbB1 على تنشيط PLCγ pathway ، مسار p42 / 44 MAPK ، ومسارات PI3K / Akt في MSCs [3]. PLCγ يلعب pathway دورًا محوريًا في النشاط المحفز ، بينما يلعب مسار MAPK p42 / 44 دورًا رئيسيًا في النشاط الانقسامي وأنشطة paracrine لعوامل معينة مثل VEGF [42 ، 43 ، 66 ، 67]. يؤدي التنشيط المستمر والقوي لمسار p42 / 44 MAPK إلى تأثيرات واقية للخلايا ومُؤيدة لتكوين العظام [44 ، 47] ، بينما قد يؤدي مسار PI3K / Akt إلى تأثيرات مضادة لتكوّن العظام [46].


أدوار روابط EGFR / ErbB1 القابلة للذوبان والمربوطة في فسيولوجيا MSC. روابط قابلة للذوبان EGFR / ErbB1 (EGF ، HB-EGF ، TGF-

شكر وتقدير

تم إعداد هذه المقالة بدعم من المنح المقدمة من منحة AHA للمبتدئين (09BGIA2050227) وصندوق بدء التشغيل من قسم علم الأمراض ، OSU (K.T.) ومن المعاهد الوطنية للصحة (R01GM063569 و R01GM069668) (A.W.). نود أن نشكر الدكتور جيه فان بروكلين (جامعة ولاية أوهايو ، كولومبوس ، أوهايو) على دعمه السخي الفعال.

مراجع

  1. إف بي باري وجي إم مورفي ، "الخلايا الجذعية الوسيطة: التطبيقات السريرية والتوصيف البيولوجي ،" المجلة الدولية للكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية، المجلد. 36 ، لا. 4 ، ص 568-584 ، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  2. دي جي فيني ودي جيه بروكوب ، "مراجعة موجزة: جذعية اللحمة المتوسطة / الخلايا اللحمية متعددة القدرات: حالة التحويل وأنماط إصلاح الأنسجة - وجهات النظر الحالية ،" الخلايا الجذعية، المجلد. 25 ، لا. 11 ، ص 2896-2902 ، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  3. K. Tamama ، و V. H. Fan ، و L.G Griffith ، و H.C Blair ، و A. Wells ، "عامل نمو البشرة كمرشح للتوسع خارج الجسم الحي للخلايا الجذعية المشتقة من النخاع العظمي ،" الخلايا الجذعية، المجلد. 24 ، لا. 3، pp.686–695، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  4. دي جي بروكوب ، "الخلايا اللحمية النخاعية كخلايا جذعية للأنسجة غير المكونة للدم ،" علم، المجلد. 276 ، لا. 5309، pp. 71–74، 1997. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  5. إم إف بيتنجر ، إيه إم ماكاي ، إس سي بيك وآخرون ، "إمكانية تعدد السلالات للخلايا الجذعية الوسيطة للإنسان البالغ" علم، المجلد. 284 ، لا. 5411، pp. 143–147، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  6. M. Owen and A.J. Friedenstein ، "الخلايا الجذعية اللحمية: السلائف العظمية المشتقة من النخاع ،" ندوة مؤسسة سيبا، المجلد. 136 ، ص 42-60 ، 1988. عرض على: الباحث العلمي من Google
  7. T. Kinnaird و E. Stabile و M. S. Burnett و S.E Epstein ، "الخلايا المشتقة من نخاع العظام لتعزيز تطوير الضمانات: الآليات والبيانات الحيوانية والتجارب السريرية الأولية ،" بحوث الدورة الدموية، المجلد. 95 ، لا. 4، pp.354–363، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  8. A. J. Friedenstein ، و J.F Gorskaja ، و N.N. أمراض الدم التجريبية، المجلد. 4 ، لا. 5 ، ص 267-274 ، 1976. عرض على: الباحث العلمي من Google
  9. J. Oswald، S. Boxberger، B. Jorgensen et al. ، "يمكن تمييز الخلايا الجذعية الوسيطة إلى خلايا بطانية في المختبر ،" الخلايا الجذعية، المجلد. 22 ، لا. 3، pp.377–384، 2004. View at: Google Scholar
  10. K. Tamama ، C. K. Sen ، و A. Wells ، "تمايز الخلايا الجذعية الوسيطة للنخاع العظمي في سلالة العضلات الملساء عن طريق منع مسار إشارات ERK / MAPK ،" الخلايا الجذعية والتنمية، المجلد. 17 ، لا. 5 ، ص 897-908 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  11. إم إف بيتنجر وبي جيه مارتن ، "الخلايا الجذعية الوسيطة وإمكانياتها كعلاجات للقلب ،" بحوث الدورة الدموية، المجلد. 95 ، لا. 1 ، ص 9-20 ، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  12. إس دافاني ، أ. ماراندين ، إن. الدوران، المجلد. 108 ، لا. 10 ، ملحق ، الصفحات من II253 إلى II258 ، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  13. L. C. Amado ، A. P. Saliaris ، K.H.Schuleri et al. ، "إصلاح القلب عن طريق الحقن داخل عضلة القلب للخلايا الجذعية اللحمية الخيفية بعد احتشاء عضلة القلب ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 102 ، لا. 32، pp. 11474–11479، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  14. دبليو داي ، إس إل هيل ، بي جيه مارتن وآخرون ، "زرع الخلايا الجذعية الوسيطة الخيفي في عضلة القلب الجرذان بعد الإصابة بالاحتشاء: تأثيرات قصيرة وطويلة المدى ،" الدوران، المجلد. 112 ، لا. 2، pp. 214–223، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  15. توما ، إم إف بيتنجر ، ك.س كاهيل ، بي جيه بيرن ، وبي دي كيسلر ، "الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية تتمايز إلى النمط الظاهري لخلايا عضلة القلب في قلب فأر بالغ ،" الدوران، المجلد. 105 ، لا. 1، pp. 93–98، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  16. T. Ziegelhoeffer ، B. Fernandez ، S. Kostin et al. ، "لا تندمج الخلايا المشتقة من نخاع العظم في الأوعية الدموية البالغة المتنامية ،" بحوث الدورة الدموية، المجلد. 94 ، لا. 2، pp.230–238، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  17. Y. Wu و L. Chen و P. G. Scott و E. E. Tredget ، "تعزز الخلايا الجذعية الوسيطة التئام الجروح من خلال التمايز وتكوين الأوعية ،" الخلايا الجذعية، المجلد. 25 ، لا. 10، pp. 2648–2659، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  18. M. Sasaki و R. Abe و Y. Fujita و S. Ando و D. Inokuma و H. Shimizu ، "يتم تجنيد الخلايا الجذعية الوسيطة في الجلد المصاب وتساهم في إصلاح الجروح عن طريق التحويل إلى نوع خلايا الجلد المتعددة ،" مجلة علم المناعة، المجلد. 180 ، لا. 4، pp.2581–2587، 2008. View at: Google Scholar
  19. V. Falanga، S. Iwamoto، M. Chartier et al. ، "الخلايا الجذعية اللحمية المتوسطة المشتقة من نخاع العظم الذاتية والتي يتم تسليمها في رذاذ الفيبرين تسرع الشفاء في الجروح الجلدية البشرية والفأرية ،" هندسة الانسجة، المجلد. 13 ، لا. 6، pp. 1299–1312، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  20. جافازون ، S.G.Keswani ، A. T. إصلاح الجروح وتجديدها، المجلد. 15 ، لا. 3، pp.350–359، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  21. T. Kinnaird ، E. Stabile ، M. S. Burnett et al. ، "يزيد التوصيل المحلي للخلايا اللحمية المشتقة من النخاع من التروية الجانبية من خلال آليات paracrine ،" الدوران، المجلد. 109 ، لا. 12 ، ص 1543-1549 ، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  22. G. E. Kilroy ، S.J.Foster ، X. Wu et al. ، "ملف تعريف السيتوكين للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية: التعبير عن العوامل المولدة للأوعية الدموية ، والعوامل المكونة للدم ، والعوامل المؤيدة للالتهابات ،" مجلة علم وظائف الأعضاء الخلوية، المجلد. 212 ، لا. 3، pp. 702–709، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  23. L. Chen ، E. E. Tredget ، P. Y.G Wu ، Y. Wu ، and Y. Wu ، "عوامل باراكرين للخلايا الجذعية الوسيطة تجند الضامة وخلايا النسب البطانية وتعزز التئام الجروح ،" بلوس واحد، المجلد. 3 ، لا. 4 ، المقالة e1886 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  24. T. Schinkothe ​​، و W. Bloch ، و A. Schmidt ، "ملف إفراز في المختبر للخلايا الجذعية اللحمية البشرية ،" الخلايا الجذعية والتنمية، المجلد. 17 ، لا. 1، pp.199–205، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  25. M. Gnecchi ، H. He ، N. Noiseux et al. ، "الأدلة التي تدعم فرضية نظير الصنوبر من أجل حماية القلب من خلال الخلايا الجذعية الوسيطة المعدلة من Akt وتحسين وظيفي ،" مجلة FASEB، المجلد. 20 ، لا. 6، pp.661–669، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  26. A. I. Caplan ، “لماذا الخلايا الجذعية السرطانية العلاجية؟ بيانات جديدة: رؤية جديدة ، " مجلة علم الأمراض، المجلد. 217 ، لا. 2 ، ص 318-324 ، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  27. سيكيا ، ب.ل.لارسون ، ج.ر.سميث ، آر.بوشامبالي ، ج.ج. Cui ، و D.J. Prockop ، "توسيع الخلايا الجذعية البشرية البالغة من سدى نخاع العظم: الظروف التي تزيد من إنتاجية الأسلاف المبكرة وتقيم جودتها ،" الخلايا الجذعية، المجلد. 20 ، لا. 6، pp.530–541، 2002. View at: Google Scholar
  28. N. Stute ، K. Holtz ، M. Bubenheim ، C. Lange ، F. Blake ، and A. R. Zander ، "مصل ذاتي لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية اللحمية البشرية للاستخدام السريري ،" أمراض الدم التجريبية، المجلد. 32 ، لا. 12 ، ص 1212-1225 ، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  29. دي سي كولتر ، آر كلاس ، سي إم ديجيرولامو ، ودي جي بروكوب ، "التوسع السريع في إعادة تدوير الخلايا الجذعية في مزارع الخلايا الملتصقة بالبلاستيك من نخاع العظام البشري ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 97 ، لا. 7 ، ص 3213-3218 ، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  30. بي آر كريسوستومو ، إم وانج ، جي إم ويريوكو وآخرون ، "يؤثر العدد الكبير من الخلايا الجذعية الممر سلبًا على تنشيط الخلايا الجذعية وحماية عضلة القلب ،" صدمة، المجلد. 26 ، لا. 6 ، ص 575-580 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  31. P. A. Sotiropoulou، S. A. Perez، M. Salagianni، C.N Baxevanis، and M.Papamichail ، "التركيبة المتوسطة لزراعة الخلايا وأبحاث الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم البالغ" الخلايا الجذعية، المجلد. 24 ، لا. 5، pp.1409–1410، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  32. Ng، S. Boucher، S. Koh et al.، “تعد إشارات PDGF و TGF- ß و FGF مهمة لتمايز ونمو الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs): يمكن أن يحدد التنميط النسخي العلامات ومسارات الإشارة المهمة في التمايز من MSCs إلى سلالات شحمية ، وغضروفية ، وعظمية المنشأ ، " دم، المجلد. 112 ، لا. 2 ، ص 295-307 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  33. H. Agata ، N. Watanabe ، Y. Ishii et al. ، "جدوى وفعالية هندسة أنسجة العظام باستخدام خلايا انسجة نخاع العظم البشري المزروعة في ظروف خالية من المصل ،" الكيمياء الحيوية والبيوفيزيائية تبحث في الاتصالات، المجلد. 382 ، لا. 2، pp. 353–358، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  34. إ.جافازون ، ك.ج.بيغز ، وأيه دبليو فليك ، "الخلايا الجذعية الوسيطة: مفارقات المرور ،" أمراض الدم التجريبية، المجلد. 32 ، لا. 5 ، ص 414-425 ، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  35. E.M Horwitz ، K. Le Blanc ، M. Dominici et al. ، "توضيح التسمية لـ MSC: بيان موقف الجمعية الدولية للعلاج الخلوي ،" العلاج بالخلايا، المجلد. 7 ، لا. 5 ، ص 393-395 ، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  36. دي سي كولتر وإي سيكيا ودي جي بروكوب ، "تحديد مجموعة سكانية فرعية من الخلايا الجذعية البالغة سريعة التجديد الذاتي ومتعددة الإمكانات في مستعمرات خلايا انسجة النخاع البشري ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 98 ، لا. 14، pp. 7841–7845، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  37. جيه آر سميث ، آر بوتشامبالي ، إيه بيري ، إس. Hsu ، و D.J. Prockop ، "عزل جزء فرعي شديد التكاثر ومتعدد الإمكانات من الخلايا الجذعية البالغة من سدى نخاع العظم ،" الخلايا الجذعية، المجلد. 22 ، لا. 5، pp.823–831، 2004. View at: Google Scholar
  38. R. Pochampally ، "فحوصات وحدة تشكيل المستعمرة لـ MSCs ،" طرق في علم الأحياء الجزيئي، المجلد. 449 ، ص 83-91 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  39. S. جيانغ ، هـ. خ. حيدر ، ر. مجلة أمراض القلب الجزيئية والخلوية، المجلد. 44 ، لا. 3 ، ص 582-596 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  40. كوهين وج. أ. إليوت ، "تحفيز تقرن البشرة بواسطة بروتين معزول من الغدة تحت الفك السفلي للفأر ،" مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية، المجلد. 40، pp. 1–5، 1963. View at: Google Scholar
  41. كاربنتر وس. كوهين ، "عامل نمو البشرة ،" مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 265 ، لا. 14، pp.7709–7712، 1990. View at: Google Scholar
  42. أ. ويلز ، "مستقبل عامل النمو العكسي ،" المجلة الدولية للكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية، المجلد. 31 ، لا. 6 ، الصفحات من 637 إلى 643 ، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  43. A. Wells و M.F Ware و F. D. Allen و D.A Lauffenburger ، "التشكيل للشحن للخارج: PLC γ الإشارة إلى تغيرات التشكل في هجرة الخلايا الليفية المحفزة بـ EGF ،" حركة الخلية والهيكل الخلوي، المجلد. 44 ، لا. 4، pp.227–233، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  44. في.ه.فان ، كيه تاماما ، إيه أو وآخرون ، "يوفر عامل نمو البشرة المربوط ميزة البقاء على قيد الحياة للخلايا الجذعية الوسيطة" ، الخلايا الجذعية، المجلد. 25 ، لا. 5، pp. 1241–1251، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  45. M. Krampera ، A. Pasini ، A. Rigo et al. ، "إشارات HB-EGF / HER-1 في الخلايا الجذعية الوسيطة للنخاع العظمي: تحفيز تمدد الخلية ومنع التمايز متعدد السلالات بشكل عكسي ،" دم، المجلد. 106 ، لا. 1، pp.59–66، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  46. أ. كراتشماروفا ، ب. بلاغوف ، إم هاك سورنسن ، إم. قاسم ، ومان ، "آلية تأثيرات عامل النمو المتباينة في تمايز الخلايا الجذعية الوسيطة ،" علم، المجلد. 308 ، لا. 5727 ، الصفحات من 1472 إلى 1477 ، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  47. M. O. Platt و A.J Roman و A. Wells و D.A Lauffenburger و L.G Griffith ، "مستويات مستقبلات عامل نمو البشرة المستدام وتنشيطها عن طريق الربط الترابطي يعزز التمايز العظمي للخلايا اللحمية النخاعية المتعددة الفعالية ،" مجلة علم وظائف الأعضاء الخلوية، المجلد. 221 ، لا. 2، pp.306–317، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  48. R.K Jaiswal، N. Jaiswal، S.P Bruder، G. Mbalaviele، D.R Marshak، and M.F Pittenger، "يتم تنظيم تمايز الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية للبالغين إلى سلالة العظم أو شحمي المنشأ بواسطة بروتين كيناز المنشط بالميتوجين ،" مجلة الكيمياء البيولوجية، المجلد. 275 ، لا. 13 ، ص 9645-9652 ، 2000. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  49. R.M Salasznyk و R. F. Klees و M.K Hughlock و G.E Plopper ، "تنظم مسارات إشارات ERK التمايز العظمي للخلايا الجذعية اللحمية البشرية على الكولاجين الأول والفيترونكتين ،" الاتصال الخلوي والالتصاق، المجلد. 11 ، لا. 5-6 ، ص 137-153 ، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  50. D.F Ward Jr. ، R.M Salasznyk ، R.F Klees et al. ، "الإجهاد الميكانيكي يعزز تركيز الجين الناجم عن المصفوفة خارج الخلية ويعزز التمايز العظمي للخلايا الجذعية اللحمية البشرية من خلال مسار يعتمد على كيناز خارج الخلية ،" الخلايا الجذعية والتنمية، المجلد. 16 ، لا. 3، pp.467–479، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  51. T. Okamoto ، T. Aoyama ، T. Nakayama et al. ، "عدم التجانس النسيلي في إمكانات التمايز للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية الخالدة ،" الكيمياء الحيوية والبيوفيزيائية تبحث في الاتصالات، المجلد. 295 ، لا. 2، pp.354–361، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  52. K. Satomura ، A. R. Derubeis ، N. S. Fedarko et al. ، "تعبير مستقبلات التيروزين كيناز في خلايا انسجة نخاع العظم البشري ،" مجلة علم وظائف الأعضاء الخلوية، المجلد. 177 ، لا. 3، pp.426–438، 1998. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  53. G.L Brown ، L.Banney ، J. Griffen et al. ، "تعزيز التئام الجروح عن طريق العلاج الموضعي بعامل نمو البشرة ،" صحيفة الطب الانكليزية الجديدة، المجلد. 321 ، لا. 2، pp. 76–79، 1989. View at: Google Scholar
  54. J. P. Hong و H. D. Jung و Y.W Kim ، "عامل نمو البشرة البشري المؤتلف (EGF) لتعزيز الشفاء من قرح القدم السكرية ،" حوليات جراحة التجميل، المجلد. 56 ، لا. 4 ، ص 394-398 ، 2006. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  55. شولتز ، دي إس روتاتوري ، و دبليو كلارك ، "EGF و TGF- α في التئام الجروح وإصلاحها ،" مجلة الكيمياء الحيوية الخلوية، المجلد. 45 ، لا. 4، pp.346–352، 1991. View at: Google Scholar
  56. ماريكوفسكي ، ك.برينج ، بي واي ليو وآخرون ، "ظهور عامل نمو شبيه بعامل النمو الشبيه بالهيبارين في سائل الجرح كاستجابة للإصابة ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 90 ، لا. 9 ، ص 3889-3893 ، 1993. عرض على: الباحث العلمي من Google
  57. K. T. Tran و L. Griffith و A. Wells ، "تشير المصفوفة خارج الخلية من خلال مستقبلات عامل النمو أثناء التئام الجروح ،" إصلاح الجروح وتجديدها، المجلد. 12 ، لا. 3، pp.262–268، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  58. A. K. V. Iyer ، K. T. Tran ، L. Griffith ، and A. Wells ، "يعتبر تقييد سطح الخلية لـ EGFR بواسطة تكرار tenascin cytotactin-like EGF تفضيليًا للإشارات المرتبطة بالحركة ،" مجلة علم وظائف الأعضاء الخلوية، المجلد. 214 ، لا. 2 ، ص 504-512 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  59. C. S. Swindle ، K. T. Tran ، T. D. مجلة بيولوجيا الخلية، المجلد. 154 ، لا. 2 ، ص 459-468 ، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  60. إي جي ماكي ، و. مجلة بيولوجيا الخلية، المجلد. 107 ، لا. 6 ، الجزء 2 ، الصفحات 2757-2767 ، 1988. عرض على: الباحث العلمي من Google
  61. T.J Stefonek و K. S. Masters ، "تعمل التدرجات الثابتة لعامل نمو البشرة على تعزيز الهجرة المتسارعة والموجهة للخلايا الكيراتينية" ، إصلاح الجروح وتجديدها، المجلد. 15 ، لا. 6 ، الصفحات 847-855 ، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  62. جي سي جورتنر ، إس فيرنر ، واي.باراندون ، إم تي لونجاكر ، "إصلاح الجروح وتجديدها ،" طبيعة سجية، المجلد. 453 ، لا. 7193 ، الصفحات من 314 إلى 321 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  63. هنري و دبليو إل غارنر ، "الوسطاء الالتهابيون في التئام الجروح ،" عيادات الجراحة في أمريكا الشمالية، المجلد. 83 ، لا. 3 ، ص 483-507 ، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  64. سي كاي سين ، "أساسيات التئام الجروح: يجب أن يكون هناك أكسجين ،" إصلاح الجروح وتجديدها، المجلد. 17 ، لا. 1، pp. 1–18، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  65. PR Crisostomo و Y. Wang و TA Markel و M. Wang و T. آلية تابعة ، " المجلة الأمريكية لعلم وظائف الأعضاء، المجلد. 294 ، لا. 3، pp. C675-C682، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  66. Y. Wang ، و PR Crisostomo ، و M. Wang ، و TA Markel ، و NM Novotny ، و DR Meldrum ، "يزيد TGF- α VEGF البشرية التي تفرز الخلايا الجذعية الوسيطة بواسطة MEK- و PI3-K- ولكن ليس الآليات المعتمدة على JNK أو ERK ، " المجلة الأمريكية لعلم وظائف الأعضاء، المجلد. 295 ، لا. 4، pp. R1115-R1123، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  67. Y. Wang و M. Wang و A.M Abarbanell et al. ، "تتوسط منظمة مجاهدي خلق في الحديث المتبادل الجديد بين TNFR2 و TGF-EGFR في تعزيز إفراز عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) من الخلايا الجذعية اللحمية البشرية ،" جراحة، المجلد. 146 ، لا. 2، pp. 198–205، 2009. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  68. H.-F. دوان ، سي. وو ، د. Wu et al. ، "علاج إقفار عضلة القلب بالخلايا الجذعية المشتقة من النخاع العظمي والتي تفرط في التعبير عن عامل نمو خلايا الكبد ،" العلاج الجزيئي، المجلد. 8 ، لا. 3، pp.467–474، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  69. Kinnaird، E. Stabile، M. S. Burnett et al. ، "تعبر الخلايا اللحمية المشتقة من النخاع عن جينات ترميز طيفًا واسعًا من السيتوكينات الشريانية وتعزز تكوين الشرايين في المختبر وفي الجسم الحي من خلال آليات paracrine ،" بحوث الدورة الدموية، المجلد. 94 ، لا. 5، pp.678–685، 2004. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  70. إي روزوفا ، إم داو ، بي كابوتشيا ، دي لينك ، وجيه إيه نولتا ، "يؤدي التكييف المسبق ناقص التأكسد إلى زيادة الحركة وتحسين الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية اللحمية البشرية" الخلايا الجذعية، المجلد. 26 ، لا. 8 ، ص 2173-2182 ، 2008. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  71. J. Guan و K. L. Fujimoto و M. S. Sacks و W. R. Wagner ، "إعداد وتوصيف سقالات البولي يوريثان عالية المسامية والقابلة للتحلل لتطبيقات الأنسجة الرخوة ،" المواد الحيوية، المجلد. 26 ، لا. 18، pp. 3961–3971، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  72. J. Guan و J. J. Stankus و W. R. Wagner ، "سقالات مرنة قابلة للتحلل مع إطلاق عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي ،" مجلة الإصدار المراقب، المجلد. 120 ، لا. 1-2 ، ص 70-78 ، 2007. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  73. إم أو بلات ، سي إل وايلدر ، إيه ويلز ، إل جي غريفيث ، ودي إيه لافينبرغر ، "إن تواقيع كيناز متعدد المسارات للخلايا اللحمية متعددة القدرات تنبؤية للتمايز العظمي: الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة ،" الخلايا الجذعية، المجلد. 27 ، لا. 11، pp.2804–2814، 2009. View at: Google Scholar
  74. A. A. Mangi ، N. Noiseux ، D. Kong et al. ، "تمنع الخلايا الجذعية الوسيطة المعدلة باستخدام Akt إعادة التشكيل واستعادة أداء القلوب المحتجزة ،" طب الطبيعة، المجلد. 9 ، لا. 9، pp. 1195–1201، 2003. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  75. R. F. Klees ، R.M Salasznyk ، K. Kingsley ، W.A Williams ، A. Boskey ، and G.E Plopper ، "Laminin-5 يحفز التعبير الجيني العظمي في الخلايا الجذعية اللحمية البشرية من خلال مسار يعتمد على ERK ،" البيولوجيا الجزيئية للخلية، المجلد. 16 ، لا. 2 ، ص 881-890 ، 2005. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  76. E. M. Horwitz، P. L. Gordon، W.K K. Koo et al. ، "الخلايا اللحمية المتوسطة المعزولة المشتقة من نخاع العظم الخيفي تنخرط وتحفز النمو لدى الأطفال الذين يعانون من تكوّن العظم الناقص: الآثار المترتبة على العلاج الخلوي للعظام ،" وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم بالولايات المتحدة الأمريكية، المجلد. 99 ، لا. 13 ، ص 8932-8937 ، 2002. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  77. هورويتز ، دي جيه بروكوب ، إل إيه فيتزباتريك وآخرون ، "إمكانية الزرع والتأثيرات العلاجية لخلايا اللحمة المتوسطة المشتقة من نخاع العظم في الأطفال الذين يعانون من تكون العظم الناقص ،" طب الطبيعة، المجلد. 5 ، لا. 3، pp.309–313، 1999. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  78. هورويتز ، دي جيه بروكوب ، بي إل جوردون وآخرون ، "الاستجابات السريرية لزرع نخاع العظم في الأطفال الذين يعانون من تكوّن عظم حاد غير كامل ،" دم، المجلد. 97 ، لا. 5، pp. 1227–1231، 2001. عرض على: موقع الناشر | منحة جوجل
  79. إم بورتيرو أوتين ، آر بامبلونا ، إم جيه بيلمونت وآخرون ، "سلائف المنتج النهائي للجليكيشن المتقدمة تعيق إشارات مستقبلات عامل نمو البشرة ،" داء السكري، المجلد. 51 ، لا. 5، pp. 1535–1542، 2002. View at: Google Scholar
  80. برادا ، إي آر روبيل ، آر إتش موراو وآخرون ، "يعمل مثبط EGFR التيروزين كينيز (PD153035) على تحسين تحمل الجلوكوز وعمل الأنسولين في الفئران عالية الدهون التي تتغذى على النظام الغذائي ،" داء السكري، المجلد. 58 ، لا. 12 ، ص 2910 - 2919 ، 2009. عرض على: الباحث العلمي من Google

حقوق النشر

حقوق النشر & # x00A9 2010 Kenichi Tamama et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط الاستشهاد بالعمل الأصلي بشكل صحيح.


توليد الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري من الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من دماغ الجنين البشري: دور عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي

تحتوي الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) على بعض الخصائص المحددة ولكنها غير ملتزمة عمومًا وبالتالي يمكنها تغيير مصيرها بعد التعرض للإشارات البيئية. من غير الواضح إلى أي مدى يمكن تعديل مرونة NSC هذه بواسطة إشارات خارجية وما هي الآليات الجزيئية الكامنة وراء تحديد مصير الخلايا العصبية. عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) هو عامل ميتوجين معروف لتكاثر NSCs. ومع ذلك ، فإن دوره في توجيه الخلايا الجذعية لمواصفات الأنواع الفرعية العصبية غير محدد. نحن هنا نبلغ أن الخلايا الجذعية السرطانية المشتقة من الدماغ الأمامي للجنين البشري الموسعة في المختبر يمكن أن تولد الخلايا العصبية الكولينية بخصائص الخلايا العصبية الحركية الشوكية عند معالجتها باستخدام bFGF خلال نافذة زمنية محددة. يستحث bFGF NSCs للتعبير عن علامة الخلايا العصبية الحركية Hb9 ، والتي يتم حظرها بواسطة مثبطات مستقبلات FGF المحددة والأجسام المضادة المعادلة لـ bFGF. هذا التطور لخصائص الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري مستقل عن الانتشار الانتقائي أو البقاء على قيد الحياة ولا يتطلب مستويات عالية من تنشيط MAPK. وهكذا تشير دراستنا إلى أن bFGF يمكن أن يلعب دورًا مهمًا في تعديل اللدونة والمصير العصبي لمراكز NSCs البشرية ويفترض أن يكون لها آثار على استكشاف الإمكانات الكاملة لمراكز NSCs الدماغية للتطبيقات السريرية ، لا سيما في تجديد الخلايا العصبية الحركية الشوكية. حقوق النشر © لعام 2008 محفوظة لشركة Wiley-Liss، Inc.


شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة جزئيًا بمنحة بحثية من التمويل الوطني للعلوم الطبيعية في الصين (81722028 ، 81802235 ، 81972150 ، 81572227 ، 81572237) ، مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ في الصين (LY17H060009 ، LR18H50001) ، مشروع Zhejiang التجريبي لعلوم وتكنولوجيا الحيوانات الصين (2018C37112) ، ومشروع خطة بحث العلوم الأساسية ونتشو (Y20180033). تم دعم هذه الدراسة أيضًا جزئيًا من قبل مجلس البحوث الصحية والطبية الأسترالي (NHMRC ، رقم 1107828 ، 1027932 إلى Jiake Xu). منحه المشروع الافتتاحي للتخصص الرئيسي الرئيسي للطب السريري في مقاطعة تشجيانغ (رقم LKFJ017) ، قدم صموئيل شو الدعم التحريري. يشكر المؤلفون جينيفر تيكنر وناثان بافلوس على تعليقاتهم على هذه المخطوطة.


أساليب

عزل خلايا MIAMI

تم الحصول على نخاع العظم بالكامل من قمة الحرقفي لمتبرع ذكر حي يبلغ من العمر 20 عامًا (Lonza Walkersville ، ميريلاند MIAMI # 3515) ، وتم التعامل معها ومعالجتها وفقًا لإرشادات الموافقة المستنيرة التي وضعتها لجنة الطب بجامعة ميامي بشأن استخدام الموضوعات البشرية في البحث. كما هو موضح سابقًا [3] ، تم طلاء خلايا نخاع العظم الكاملة المعزولة بكثافة ثابتة تبلغ 1 × 10 5 خلايا / سم 2 في وسط DMEM منخفض الجلوكوز ، يحتوي على 3 ٪ من مصل بقري جنيني (FBS ، Hyclone Waltham ، MA ، Lot # 30039) ، 20 ملي حمض الأسكوربيك (فلوكا / سيجما سانت لويس ، مو ، # 49752) ، خليط الأحماض الدهنية الأساسية (سيجما سانت لويس ، MO 12.9 نانومتر حمض الأراكيدونيك ، (# A9673) ، 1.12 ميكرومتر من الكوليسترول (# C3045) ، 290 نانومتر DL-alpha tocopherol-acetate (# T3376) ، 85.9 نانومتر حمض الميريستيك (# M3128) ، 69.4 نانومتر حمض الأوليك (# 01383) ، 76.5 نانومتر حمض البالمتيك (# P5585) ، 77.1 نانومتر حمض بالميتوليك (P9417) و 68.9 nM حامض دهني (# S4751) (معدل من [21]) والمضادات الحيوية (100 U / mL بنسلين ، 0.1 مجم / مل ستربتومايسين) (Gibco Carlsbad ، CA ، # 15140) على 10 نانوغرام / مل فبرونيكتين (سيجما سانت لويس ، MO ، # F2518) قوارير مغلفة (Nunclone Rochester، NY). تم تحضين خلايا نخاع العظم الكاملة ، التي تحتوي على خلايا ملتصقة وغير ملتصقة ، عند 37 درجة مئوية تحت ظروف نقص الأكسجة (3٪ O.2, 5٪ كو2 و 92٪ ن2). بعد سبعة أيام ، تم استبدال نصف وسط الثقافة. بعد أربعة عشر يومًا من الطلاء الأولي ، تمت إزالة الخلايا غير الملتصقة. تم شطف المستعمرات المجمعة من الخلايا الملتصقة ببرنامج تلفزيوني ومطلي بكثافة منخفضة للتمدد (100 خلية / سم 2) في قوارير مغلفة بالفيبرونكتين مقاس 75 سم 2.

شروط زراعة خلايا MIAMI

نمت خلايا MIAMI في وسط توسع يتكون من جلوكوز منخفض DMEM (كما هو موصوف أعلاه) في ظروف منخفضة الأكسجين (3٪ O2، 5٪ كو2 و 92٪ ن2).تم تغيير الوسائط كل 2-3 أيام وتم فصل الخلايا وتكويرها باستخدام التربسين (Gibco Carlsbad ، CA ، # 25300) عند الوصول

60٪ التقاء. تم تعليق الخلايا المكسورة في الوسائط وطليها في قوارير مغلفة بـ 10 نانوغرام / مل (Sigma St Louis ، MO ، # F2518) (Nunclon ، Rochester ، NY) عند 100 خلية / سم 2. قبل عزل الحمض النووي الريبي ، تم شطف الخلايا الملتصقة 2 × باستخدام برنامج تلفزيوني. تم تمييز خلايا MIAMI الموسعة لمدة 3 ممرات باستخدام قياس التدفق الخلوي وكانت موجبة لـ MHC1 و CD29 و CD81 و CD90 و 50٪ إيجابية لـ CD63 ، وسلبية لـ MHC2 و HLA-DR و CD49 و CD109 و CD54 و CD56 و CD36 (البيانات غير موجودة. معروض).

شروط زراعة الخلايا RS-1

تم الحصول على خلايا انسجة النخاع البشري (hMSC ، المتبرع رقم 7081 ، 22 عامًا ذكر) من مختبر الدكتور داروين بروكوب ، مدير مركز تكساس إيه آند إم بي إم للعلوم الصحية ، معهد الطب التجديدي. تم عزل خلايا نخاع العظام (BM) من المتبرعين من البشر وفقًا للإرشادات الخاصة باستخدام الموضوعات البشرية في البحث كما هو موصوف من قبل جميع البائعين التجاريين. تمت تربية hMSC في وسط Alpha-Minimum Essential (αMEM) مع L-glutamine ، ولكن بدون ريبونوكليوسيدات أو deoxyribonucleosides (Invitrogen / Gibco Carlsbad ، CA ، # 12561-056) ، مكمل بـ 16.5 ٪ FBS (Hyclone Waltham ، MA ، # 31752) ، 2 ملي GlutaMAX (# 35050) والمضادات الحيوية (جيبكو كارلسباد ، كاليفورنيا ، # 15140). لإثراء خلايا RS-1 ، تم طلاء hMSC (P1) عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف سامة (21 ٪ O)2، 5٪ كو2 و 74٪ ن2) على 10 نانوغرام / مل من فبرونيكتين (سيجما سانت لويس ، MO ، # F2518) بين عشية وضحاها. تم فصل الخلايا باستخدام التربسين (Gibco Carlsbad ، CA # 25300) والبذر عند 50 خلية / سم 2. تم فصل hMSCs المخصب RS-1 عند التقاء 30-40 ٪ وإعادة طلاءه بكثافة منخفضة (50 خلية / سم 2) [7]. تم حصاد خلايا RS-1 لعزل الحمض النووي الريبي في كل ممر. كانت خلايا RS-1 المشتقة من MSC ، المقطع 2 ، إيجابية بالنسبة لـ CD29 و CD90 و CD105 و CD73 وفقًا لما حدده مركز جامعة تولين للعلاج الجيني (hMSCs # 7801). كانت خلايا RS-1 المشتقة في منشآتنا ، المقطع 3 ، إيجابية لـ MHC1 ، CD81 ، CD90 ، CD29 (20٪) ، CD63 (45٪) وسلبية لـ MHC2 ، HLA-DR ، CD49 ، CD109 ، CD54 ، CD56 ، CD36 ، على النحو المحدد باستخدام تحليل التدفق الخلوي (البيانات غير معروضة).

شروط ثقافة خلية MSC

تم شراء الخلايا الجذعية اللحمية البشرية (MSC) المشتقة من قمة الحرقفة من لونزا (ووكرسفيل ، ماريلاند (PT-2501: 21yo أنثى)). تم عزل خلايا نخاع العظام (BM) من المتبرعين من البشر وفقًا للإرشادات الخاصة باستخدام الموضوعات البشرية في البحث كما هو موصوف من قبل جميع البائعين التجاريين. تم طلاء MSC عند 6000 خلية / سم 2 في وسط الجلوكوز عالي DMEM (Gibco Carlsbad ، CA ، # 31053) مكملًا بنسبة 15 ٪ FBS (Hyclone Waltham ، MA ، # 30039) ، وحمض الأسكوربيك ، والمضادات الحيوية والأحماض الدهنية الأساسية (مثل المذكورة أعلاه) ، وتم توسيعها بنسبة 21٪ O2، 5٪ كو2 و 92٪ ن2. تم تغيير وسائط الاستنبات بالكامل كل 3-4 أيام وتم فصل الخلايا واستبدالها كل 7 أيام [16]. كانت MSC التي تم شراؤها من Lonza إيجابية بالنسبة لـ CD105 و CD166 و CD29 و CD44 وسلبية لـ CD14 و CD34 و CD45 ، كما هو محدد بواسطة قياس التدفق الخلوي (Lonza Wlkersville ، Maryland (المستند رقم TS-PT-212-8 06/09).

المعالجة المسبقة العصبية

تم إجراء عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) لخلايا MIAMI باستخدام 20 نانوغرام / مل لكل من EGF (# AF-100-15) و bFGF (Peprotech Rocky Hill ، NJ ، # AF-100- 18 ب) منفردة أو مجتمعة. تم فصل الخلايا المعالجة مسبقًا باستخدام التربسين واستبدالها بعد اليوم الخامس ، تليها فترة معالجة ثانية مدتها 5 أيام. نمت الخلايا المعالجة مسبقًا في وسط تمدد تحت ظروف التمدد (3٪ O2، 5٪ كو2 و 92٪ ن2). تم تغيير الوسائط كل 2-3 أيام وتم تقسيم الخلايا باستخدام التربسين (Gibco Carlsbad ، CA ، # 25300) عند الوصول

التمايز البطاني

من أجل التمايز البطاني ، تم طلاء خلايا MIAMI عند 20000 خلية / سم 2 في 6 أطباق آبار (Nunclone Rochester ، نيويورك) في وسط منخفض الجلوكوز DMEM ، يحتوي على 100 ميكرومتر من حمض الأسكوربيك ، والمضادات الحيوية ، والأحماض الدهنية الأساسية ، وكوكتيل عامل النمو الوعائي [Sigma St . Louis ، MO: 10 نانوغرام / مل من bFGF ، 10 نانوغرام / مل EGF ، 10 نانوغرام / مل IGF R & ampD Systems، Inc.2، 5٪ كو2 وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 21 يومًا ، مع تغيير الوسائط كل 5 أيام. تم حصاد الخلايا في اليوم 10 و 21 وتقييمها بواسطة RT-qPCR للعلامة البطانية CD 31.

إجمالي إعداد عينة الحمض النووي الريبي وتوليف (كدنا)

تم فصل خلايا MIAMI (التربسين) وطردها لتشكيل خلية بيليه. تم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة RNAqueous ® -4PCR (Ambion Austin ، TX ، # AM1914) وفقًا لتوجيهات الشركة الصانعة. تم تحديد كمية الحمض النووي الريبي الإجمالي على مقياس الطيف الضوئي Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Wilmington ، DE). تم إجراء النسخ العكسي لـ 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى (كدنا) باستخدام بادئات سداسية عشوائية باستخدام مجموعة النسخ العكسي (كدنا) عالية السعة (Applied Biosystems Foster City ، CA ، # 4368814). تم تخفيف (كدنا) 1:20 (ماء خالٍ من نوكلياز: Gibco # 10977-015) إلى تركيز (كدنا) نهائي قدره 5 نانوغرام / ميكرولتر ، مقتبس ، وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام التالي. تم استخدام RNA فقط بنسبة 260/280 بين 1.9-2.0 لتحليل PCR.

الوقت الحقيقي الكمي RT-PCR (RT-qPCR)

تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) باستخدام 10 ميكرولتر من 1:20 (كدنا) المخفف (50 نانوغرام) على نظام PCR الكمي المتعدد Mx3005P (Stratagene # 401513) باستخدام RT-qPCR SYBR الكواشف الخضراء (Brilliant ® II SYBR ® Green QPCR Master Mix ، Agilent Technologies) مع صبغة مرجعية ROX. تم إعادة تكوين أزواج التمهيدي الأمامية والعكسية في Nuclease Free Water (Gibco # 10977-015). تم خلط محلول مخزون 2 ميكرومتر يحتوي على كل من أزواج التمهيدي الأمامية والعكسية وتخزينها عند -20 درجة مئوية. تم استخدام تركيز نهائي قدره 160 نانومتر من أزواج التمهيدي الأمامي والخلفي لكل تفاعل RT-qPCR. كانت ظروف ركوب الدراجات على النحو التالي: 95 درجة مئوية مبدئية لمدة 10 دقائق ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. تم استخدام برنامج MxPro-Mx3005P v4.10 لتحديد CP لكل تفاعل تضخيم. تم تصدير النتائج إلى Microsoft Excel لتحليلها.

تحليل بيانات RT-qPCR

تم تحليل جميع بيانات RT-qPCR المقابلة باستخدام طريقة ΔΔCP [13] وتم تطبيعها مقابل عنصر تحكم سلبي واحد وجينين مرجعيين (جينات التدبير المنزلي).

يتم تعريف نقطة العبور (CP) على أنها النقطة التي يرتفع عندها التألق بشكل ملحوظ فوق مضان الخلفية. تم استخدام "طريقة نقطة الملاءمة" بواسطة برنامج Mx3005P لتحديد CP لكل تفاعل. تم تعيين عينة التحكم على القيمة "1" في جميع الحالات ، ويتم عرض أشرطة الخطأ في الأرقام ذات الصلة على أنها انحراف معياري. تم تحديد عدد التجارب المستقلة على أنها "N" مع جمع 2-3 نقاط بيانات فردية لكل تجربة.

جينات التطبيع

تم اختبار ثمانية جينات للتطبيع [بيتا أكتين (ACTB، NM_001101) ، بيتا 2-ميكروغلوبولين (B2M، NM_004048) ، عامل استطالة الترجمة حقيقية النواة 1 ألفا (EF1α، NM_001402) ، نازعة هيدروجين الغليسيرالديهيد -3 فوسفات (جابده، NM_002046) ، Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1، NM_000194) ، بروتين الريبوسوم L13a (RPL13a، NM_01242) ، بروتين تنشيط التيروزين 3-أحادي أوكسيجيناز / التربتوفان 5-أحادي أوكسيجيناز ، متغير زيتا متعدد الببتيد 1 & amp 2 (YWHAZ، NM_003406 & amp NM_145690) ، ويوبيكويتين C (UBC، NM_021009)]. توجد قائمة بتسلسلات زوج التمهيدي المستخدمة في الجدول رقم 1.

تحديد كفاءة زوج البرايمر

تم حساب تحديد كفاءة زوج التمهيدي لكل جينات (E) لـ RT-qPCR باستخدام هذه المعادلة: E = 10 ^ (- 1 / م) [22]. تم حساب المنحدر (م) من خلال رسم نقطة عبور رقم الدورة (CP) المحسوبة خلال المرحلة الأسية لمؤامرة التضخيم (برنامج PxPro-Mx3005P v4.10) مقابل تركيز cDNA الكلي. تراوحت تركيزات (كدنا) من 50-1 نانوغرام لكل تفاعل. تم حساب النسبة المئوية للكفاءة (٪ E) أيضًا:٪ E = (E-1) * 100. N = 4 (2-3 نقاط بيانات لكل تجربة) (ملف إضافي # 1).

بناء أزواج التمهيدي الخاصة بالأنواع

من أجل إنشاء أزواج التمهيدي الخاصة بالأنواع التي تكشف فقط متواليات mRNA البشرية أو متواليات mRNA الفئران فقط داخل مكتبة (كدنا) بشرية الفئران ، يجب أن يكون لتسلسلات mRNA البشرية والفئران المقابلة منطقة فريدة لا تقل عن 60 نقطة أساس أو أكثر. استخدام متواليات FASTA مرنا البشرية والفئران المقابلة ل EF1α, RPL13a و YWHAZ، استخدمنا Blast-n http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi لمقارنة التسلسلات. EF1α تغطية تسلسلية بنسبة 99٪ (هوية 100٪) بين متواليات الرنا المرسال للإنسان والجرذان. RPL13a لديها 57٪ تغطية تسلسلية (87٪ هوية) و YWHAZ تحتوي متغيرات النسخ 1 و 2 على 92٪ - 63٪ تغطية تسلسلية (هوية 100٪). وبالتالي، RPL13a و YWHAZ كلاهما كانا جينات تطبيع خاصة بالأنواع البشرية المرشحة أثناء EF1α لم يكن يحتوي على منطقة تحتوي على تسلسل فريد (≥60 نقطة أساس) من أجل إنشاء أزواج أولية. تم إنشاء أزواج التمهيدي الخاصة بالأنواع البشرية لجينات التطبيع RPL13a و YWHAZ ول 3 جينات مستهدفة ستانيوكالسين -1 (STC-1) ، عامل نخر الورم ، بروتين مستحث بألفا 6 (TSG6) ، والبروتين المرتبط بعامل النمو المحول الكامن 2 (LTBP2). تم استخدام NCBI Primer-BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ لبناء تسلسل زوج التمهيدي [23] باستخدام متواليات mRNA الفريدة من نوعها (تنسيق FASTA). تم استخدام التدرج PCR لتحديد درجة حرارة التلدين المثلى. تم التحقق من صحة جميع أزواج التمهيدي الخاصة بالإنسان والفئران باستخدام RT-qPCR باستخدام (كدنا) من خلايا MIAMI البشرية H3515 (3) أو الثقافات العضوية الحُصينية للفئران إما بشكل منفصل أو معًا. أنتجت جميع أزواج التمهيدي أمبليكون واحدًا خاصًا بالأنواع ، مع الحد الأدنى من التضخيم خارج الهدف. تم تحديد ذلك من خلال منحنى الانصهار لكل تفاعل تضخيم (ملف إضافي # 2) و agarose gel electrophoresis (البيانات غير معروضة). تم اختبار ما يقرب من 3-5 أزواج من التمهيدي لكل تطبيع خاص بنوع الإنسان أو الفئران أو الجين المستهدف. تم تطبيع جميع نتائج RT-qPCR مقابل عنصر تحكم سلبي ، وجينات التطبيع 2 hRPL13a و هيواز (بشري) ، أو rRPL13a (جرذ). باستخدام هذه الطريقة نفسها ، تم أيضًا إنشاء أزواج التمهيدي الخاصة بالفئران RPL13a, IGF1, IGFBP3، و IGFBP5.

نموذج لنقص التروية الدماغي العالمي خارج الجسم الحي لتحليل RT-qPCR عبر الأنواع

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقًا للإرشادات المعتمدة التي وضعتها جامعة ميامي IACUC. تم وصف إعداد شريحة الحصين العضوية للفئران بالتفصيل [19 ، 24]. باختصار ، تم الحصول على 400 ميكرومتر شريحة دماغية من صغار الفئران من كلا الجنسين بين أيام ما بعد الولادة 9 و 10. تمت زراعة الشرائح لمدة أسبوعين في وسط يتكون من 25٪ من مصل الحصان المعطل بالحرارة ، و 50٪ من الوسط الأساسي الأدنى ، و 25٪ متوازن لهانك. محلول ملح ، 5.5 مجم / مل د-جلوكوز و 1 مليمول / لتر جلوتامين. بالنسبة للإقفار ، استخدمنا نموذجًا راسخًا يتكون من الأكسجين والحرمان من الجلوكوز معًا ([19 ، 24]) خلال 40 دقيقة. بالنسبة لـ OGD ، يتم استبدال الأكسجين بالنيتروجين والجلوكوز بالسكروز. عولجت خلايا MIAMI مسبقًا بـ bFGF و EGF (7 أيام: 50 نانوغرام / مل) قبل الحقن في منطقة CA1 من قرن آمون (7500 خلية / ميكرولتر لكل حقنة (3 حقن)). ساعة واحدة بعد تحريض OGD و 24 ساعة بعد عزل الحمض النووي الريبي الكلي OGD من ثقافات شريحة عضوي حصين الفئران (موصوفة في [25]) مع أو بدون حقن MIAMI. كما هو موضح سابقًا ، تم استخدام 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتخليق (كدنا). تم إجراء تحليل RT-qPCR باستخدام 5 ميكرولتر من (كدنا) غير المخفف. تم تحديد أزواج التمهيدي الخاصة بالإنسان والفئران بواسطة (h) و (r) على التوالي (الجدول رقم 2: تم تعيين أزواج التمهيدي الخاصة بالإنسان بواسطة (*)).


شاهد الفيديو: PETITFEE GOLG u0026 EGF MASK (أغسطس 2022).