معلومة

ضربة قاضية لـ RNA طويل غير مشفر (lncRNA) - كيف يتم ذلك؟

ضربة قاضية لـ RNA طويل غير مشفر (lncRNA) - كيف يتم ذلك؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا لا أعمل في المختبر الرطب ولا أعرف كل التفاصيل حول تقنيات الضربة القاضية.
سؤالي هو:
كيف تتم ضربة قاضية lncRNA؟
على سبيل المثال - لديك lncRNA وهذا هو وظيفية في النواة. كيف يمكن تنفيذ ضربة قاضية باستخدام iRNA إذا يحدث التداخل فقط في السيتوبلازم?
آسف إذا كان هناك سوء فهم متعلق بالبيولوجيا في سؤالي.


ضربة قاضية لـ lncRNA في الثدييات لا تتم عبر RNAi. بدلاً من ذلك ، يقوم المرء بنقل أوليجوس DNA المضاد للدلالة التي ترتبط بـ RNA. هذا يؤدي إلى عمل إنزيم RNase H ، الذي يحط من RNA-DNA مزدوج. يحط من lncRNA.

تحديث: كمرجع ، لقد علمت عن هذا من ندوة ، ولم يتم توثيقه جيدًا ، ولكن بعد بعض البحث في الأدب وجدت هذه الورقة لأقتبس منها:

على الرغم من أننا (الشكل 3 أ) وآخرين (42 ، 49) قد استخدمنا siRNA لهدم NEAT1 lncRNA وعلى الرغم من أن ضربة قاضية لـ RNAs النووية الصارمة قد تم وصفها جيدًا (53 ، 54) ، ظللنا نشعر بالقلق لأن NEAT1 هو في الغالب نووي RNA (55) ، قد لا يكون مستهدفًا بكفاءة عالية بواسطة آلية RNAi. ومع ذلك ، يتم استهداف الحمض النووي الريبي النووي بكفاءة باستخدام oligodeoxynucleotides التكميلية المضادة للدلالة (AS) التي تجند نشاط RNase H النووي لتحطيم الحمض النووي الريبي (56). ومن ثم ، استخدمنا أيضًا أليغودوكسين نيوكليوتيدات AS التكميلية للقضاء على NEAT1 lncRNA في خلايا Jurkat المصابة بفيروس HIV-1 NL4-3 (الشكل 4C ، يسار). أدى نهج AS إلى تقليل NEAT1 (الشكل 4C ، يسار) وزيادة إنتاج HIV-1 p24 (الشكل 4C ، على اليمين) ، مما يوفر نتائج متسقة مع تلك الناتجة عن ضربة قاضية بوساطة siRNA لـ NEAT1 (الشكل 4 أ و ب).


يحدث RNAi النووي ... تحقق من هذه المقالات:

http://www.nature.com/nrg/journal/v14/n2/execsumm/nrg3355.html

http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2011/11/07/nar.gkr891.full

هناك أيضًا بعض الأدلة على أن Ago2 يرتبط بـ lncRNAs.

ومع ذلك ، يمكنك استخدام تقنيات أخرى للقضاء على lncRNAs على سبيل المثال الريبوزيمات.


هذا مثير للجدل ، لكن معظم المجموعات في هذا المجال خلصت إلى أن RNAi لا يعمل في النواة على الرغم من وجود Ago. عندما يكون lncRNA مصابًا بـ KD مع RNAi ، فإنه يظهر عادةً في كل من النواة والسيتوبلازم ، ويُعتقد أن KD يحدث في السيتوبلازم وليس النواة. بالطبع كما هو الحال دائمًا في علم الأحياء ، من الممكن أن يحدث RNAi النووي في بعض أنواع الخلايا أو في ظل بعض الظروف الخاصة. عادة ما تكون oligonucleotides Gapmer التي تعمل عبر RNAseH طريقة ممتازة لـ KD a nncRNA النووي ، لكنني أود أن أضيف أنه يجب أن تكون مستعدًا لاختبار 6 أو أكثر من oligos المختلفة ، حيث لا يمكن التنبؤ بالفعالية ، وعلى عكس RNAi ، لا يوجد شيء عظيم. الخوارزميات المتاحة بشكل عام لتصميم قلة المعنى المضاد.


ضربة قاضية لـ RNA CCAT2 طويل غير مشفر يمنع الانتشار الخلوي والغزو والظهارة & # 8208 الانتقال اللحمي في خلايا الورم الدبقي

الانتماءات: 1: قسم مكافحة العدوى ، مستشفى Taihe ، جامعة هوبى للطب ، شيان ، مقاطعة هوبي ، جمهورية الصين الشعبية 2: قسم جراحة المخ والأعصاب ، مستشفى رينمين ، جامعة هوبي للطب ، شيان ، مقاطعة هوبي ، جمهورية الصين الشعبية 3: قسم مركز PET ومعهد التخدير والألم ، مستشفى Taihe ، جامعة هوبى للطب ، شيان ، مقاطعة هوبى ، جمهورية الصين الشعبية

تاريخ النشر: 5 июля 2017 г.

تم توفير هذه المقالة على الإنترنت في 17 ноября 2016 г. كمقالة المسار السريع بعنوان: "ضربة قاضية لـ RNA CCAT2 طويلة غير مشفرة تمنع الانتشار الخلوي ، والغزو ، و EMT في خلايا الورم الدبقي".

سابقًا: أبحاث الأورام التي تتضمن تصميم الأدوية المضادة للسرطان
أبحاث الأورام التي تتميز بعلاجات السرطان قبل السريرية و Clincal تنشر أبحاثًا عالية الجودة تساهم في فهم السرطان في مجالات البيولوجيا الجزيئية وبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية وعلم الوراثة وعلم الأحياء وعلم الغدد الصماء والمناعة ، بالإضافة إلى دراسات حول الآلية من تأثير المواد المسرطنة والعوامل العلاجية ، والتقارير التي تتناول الوقاية من السرطان وعلم الأوبئة ، والتجارب السريرية التي تحدد نظم علاجية جديدة فعالة.

من المجلد 23 ، بحث علم الأورام الذي يتميز بعلاجات السرطان قبل السريرية والسريرية هو الوصول المفتوح بموجب شروط ترخيص المشاع الإبداعي CC BY-NC-ND.


ضربة قاضية لـ RNA طويل غير مشفر (lncRNA) - كيف يتم ذلك؟ - مادة الاحياء

لقد طلبت ترجمة آلية لمحتوى محدد من قواعد البيانات الخاصة بنا. يتم توفير هذه الوظيفة لراحتك فقط ولا يُقصد بها بأي حال من الأحوال أن تحل محل الترجمة البشرية. لا تقدم BioOne ولا مالكو وناشر المحتوى ، وهم يتنصلون صراحةً من مسؤوليتهم ، أي تعهدات أو ضمانات صريحة أو ضمنية من أي نوع ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، الإقرارات والضمانات فيما يتعلق بوظيفة ميزة الترجمة أو دقة أو اكتمال الترجمات.

لا يتم الاحتفاظ بالترجمات في نظامنا. يخضع استخدامك لهذه الميزة والترجمات لجميع قيود الاستخدام الواردة في شروط وأحكام استخدام موقع BioOne.

ضربة قاضية للـ RNA CCDC144NL-AS1 الطويل غير المشفر يخفف من أنماط الهجرة والغزو في خلايا انسجة بطانة الرحم من الانتباذ البطاني الرحمي

Chen Zhang ، 1 Wei Wu ، 2 Honglan Zhu ، 3 Xiaoming Yu ، 4 Yinli Zhang ، 5 Xue Ye ، 1 Hongyan Cheng ، 1 Ruiqiong Ma ، 1 Heng Cui ، 1 Jianjun Luo />https://orcid.org/0000- 0002-5550-9889، 2، * Jing Guan، 4، * Xiaohong Chang />https://orcid.org/0000-0002-9879-2266 1 ، **

1 1 مركز الأورام النسائية ، مستشفى جامعة بكين ، بكين ، الصين
2 2 المختبر الرئيسي لبيولوجيا الحمض النووي الريبي ، معهد الفيزياء الحيوية ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، بكين ، الصين
3 3 د قسم التوليد وأمراض النساء ، مستشفى جامعة بكين ، بكين ، الصين
4 4 مركز الطب التناسلي ، مستشفى الناس بجامعة بكين ، بكين ، الصين
5 5 قسم علم الأمراض ، مستشفى الناس بجامعة بكين ، بكين ، الصين

* قام JL و JG بتوجيه هذا العمل بشكل مشترك ويجب اعتبارهما مؤلفين مشاركين.
** المراسلات: مركز الأورام النسائية ، مستشفى جامعة بكين ، رقم 11 Xizhimen South Str. ، منطقة Xicheng ، بكين 100044 ، الصين. الهاتف: + 86-10-88324473 الفاكس: + 86-10-88324472 البريد الإلكتروني: [email protected]

يتضمن PDF و HTML ، عند توفره

هذه المقالة متاحة فقط لـ مشتركين.
انها ليست متاحة للبيع الفردي.

إن الانتباذ البطاني الرحمي (EM) هو مرض غامض ومعقد وجد أنه متعدد العوامل. أظهرت الدراسات الحديثة أن RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) تلعب دورًا مهمًا في التسبب في مرض EM. ومع ذلك ، فإن الآليات الوظيفية والبيولوجية للـ lncRNAs في EM لا تزال غير معروفة. هنا ، أجرينا تحليلات ميكروأري لمقارنة ملامح تعبير lncRNA لأربعة أنسجة بطانة الرحم (EC) المقترنة وأنسجة بطانة الرحم (EU) من المرضى الذين يعانون من المبيض EM. تم تحديد lncRNA جديد ، CCDC144NL-AS1 ، على أنه يحتمل أن يكون وظيفيًا. تم تنظيم تعبير CCDC144NL-AS1 في أنسجة EC مقارنةً بالاتحاد الأوروبي وأنسجة بطانة الرحم الطبيعية (NE). كان تعبيره أعلى في أنسجة EC مقارنة بأنسجة الاتحاد الأوروبي في 86.7 ٪ (26/30) من المرضى الذين يعانون من EM. على الرغم من عدم وجود زيادة كبيرة وفقًا لمراحل جمعية الخصوبة الأمريكية المنقحة (rAFS) ، أظهر ما يقرب من 60 ٪ من حالات المرحلة السادسة EM مستويات أعلى من CCDC144NL-AS1 ، أكثر بكثير مما كانت عليه في حالات المرحلة الثانية والثالثة. أظهر التجزئة الخلوية أن CCDC144NL-AS1 قد تم توطينه في السيتوبلازم والنواة لخط خلية انسجة بطانة الرحم الخاملة المشتقة من EM البشري hEM15A. أدى استنفاد CCDC144NL-AS1 إلى كبت هجرة وغزو خلايا hEM15A ، لكنه لم يؤثر على التصاق الخلية أو انتشارها أو موت الخلايا المبرمج أو دورة الخلية. أدت ضربة قاضية لـ CCDC144NL-AS1 إلى تغيير توزيع ألياف الإجهاد الخيطي الخيطي (F-actin) للهيكل الخلوي مقارنةً بمعاملة مجموعة التحكم السلبية. كشف تحليل اللطخة الغربية أن ضربة قاضية لـ CCDC144NL-AS1 خففت مستويات البروتين في خيوط الفيمنتين و MMP-9 ، ولكن ليس N-cadherin أو β-كاتينين. بشكل جماعي ، تشير نتائجنا إلى أن CCDC144NL-AS1 قد يكون متورطًا في التسبب في مرض EM وتوفر هدفًا جديدًا للمبيض EM.

تساهم مستويات lncRNA CCDC144NL-AS1 المرتفعة في إعادة تنظيم الهيكل الخلوي والهجرة والغزو في خلايا انسجة بطانة الرحم من خلال تنظيم الفيمنتين و MMP-9.

© المؤلف (المؤلفون) 2018. تم النشر بواسطة مطبعة جامعة أكسفورد نيابة عن جمعية دراسة الاستنساخ. كل الحقوق محفوظة. للحصول على الأذونات ، يرجى إرسال بريد إلكتروني إلى: [email protected]

Chen Zhang و Wei Wu و Honglan Zhu و Xiaoming Yu و Yinli Zhang و Xue Ye و Hongyan Cheng و Ruiqiong Ma و Heng Cui و Jianjun Luo و Jing Guan و Xiaohong Chang "ضربة قاضية للـ RNA CCDC144NL-AS1 الطويل غير المشفر يخفف من أنماط الهجرة والغزو في خلايا انسجة بطانة الرحم من الانتباذ البطاني الرحمي ، "بيولوجيا التكاثر 100 (4) ، 939-949 ، (28 نوفمبر 2018). https://doi.org/10.1093/biolre/ioy252

تم الاستلام: 25 أغسطس 2018 القبول: 27 نوفمبر 2018 تاريخ النشر: 28 نوفمبر 2018


نتائج ومناقشة

ال ذبابة الفاكهة يشفر الجينوم العديد من lncRNAs التي تظهر تعبيرًا خاصًا بالأنسجة والجنس (16 ، 17). ومع ذلك ، تظل وظائف غالبية هذه النصوص غير معروفة. لقد رأينا أن قمع نسخ lncRNAs بواسطة CRISPRi من شأنه التغلب على قيود الأساليب الحالية المطبقة لتحليلها وقررنا إعادة تقييم فعالية dCas9 في قمع النسخ من مواقع lncRNA الذاتية في ذبابة الفاكهة الخلايا. تم استخدام نظام CRISPR / Cas9 على نطاق واسع لتحرير الجينات في ذبابة الفاكهة (11 ، 13-14 ، 18-26). ومع ذلك ، لم يتم تطبيق CRISPRi حتى الآن في ذبابة الفاكهة.

لتنفيذ CRISPRi في ذبابة الفاكهة الخلايا ، قمنا أولاً ببناء ناقل تعداء واحد يسمح بالتعايش بين بروتين Cas9 الطافر و sgRNA ، على غرار ذلك الذي وصفناه سابقًا (14). هذه الاستراتيجية تقضي على التباين بين التجارب التي تنشأ من النقل المشترك لاثنين من البلازميدات. يحتوي ناقل ترنسفكأيشن pGTL-1 (الشكل 1 ب) ، المشتق من ناقل متعدد الخلايا pAc5-STABLE2-neo (12) ، على جين Bla R الذي يسمح بالاختيار الفعال للخلايا المنقولة بالعدوى ويقلل من الوقت لإنشاء خطوط خلايا مستقرة (27) ). بالإضافة إلى ذلك ، يتيح وجود GFP المراقبة السهلة للخلايا المحولة. يتم التعبير عن جين Cas9 المُحسن من الكودون البشري الذي يفتقر إلى نشاط نوكلياز (dCas9) المحاط بتسلسلات NLS والمُحدد بحلقة FLAG عند الطرف N ، تحت أكتين 5 ج المروجين. للتعبير الأمثل عن الدليل RNAs ، تم إدخال كاسيت U6: 3 – sgRNA في المتجه ، يحتوي هذا المروج على نشاط تحرير جيني CRISPR / Cas9 بوساطة أعلى في ذبابة الفاكهة، بالمقارنة مع مروج U6: 2 الشائع الاستخدام (13).

كجينة مرشح ، اخترناها ROX (R NA o n X chromosome) ، الذي يشفر lncRNAs المشاركة في تعويض الجرعة في ذبابة الفاكهة ذكور (28). خاصة بالذكور ROX الحمض النووي الريبي ، roX1 و ROX2، شكل مركب مع بروتينات MSL (m ale- secific l ethal) ويسهل استهداف المركب على كروموسوم X ، وهو ضروري لتنشيط مفرط مرتين للجينات المرتبطة بـ X في الذكور. يظهر التحليل الجيني ذلك roX1 roX2 الطفرات المزدوجة هي قاتلة للذكور يتم إنقاذها من قبل أي منهما roX1 أو ROX2 (كدنا) ، مما يشير إلى التكرار الوظيفي في نشاطهم (29 ، 30). في الوقت الحاضر ، تعد الأليلات المستخدمة لتحليل فقدان الوظيفة عبارة عن عمليات حذف جينومية للمواضع أو الترتيبات الصبغية المعقدة. علاوة على ذلك ، تظل مواقع بدء النسخ وهوية العناصر التنظيمية غير واضحة. لقد صممنا العديد من sgRNAs التي تستهدف roX1 و ROX2 موضع (الشكلان 2 أ و 3 أ). لتحديد ما إذا كان إسكات فعال ROX تعتمد الحمض النووي الريبي على خصوصية الخيوط ، اخترنا تسلسلات مكملة لكل من حبلا القالب (rT) وغير القالب (rNT) وبالقرب من مواقع بدء النسخ المتوقعة. للمقايسة ، أنشأنا خطوط خلايا مستقرة باستخدام ذبابة الفاكهة استنساخ 8 خلايا تعبر عن كليهما ROX الحمض النووي الريبي (31).

ال roX1 تم إسكات التعبير بكفاءة بواسطة CRISPRi. (أ) تمثيل تخطيطي لـ ذبابة الفاكهة ROX1 الموضع والمواقف النسبية لـ roX1-استهداف sgRNAs. هناك نوعان من مواقع بدء النسخ roX1 الجين (270 nt على حدة) الذي ينتج الأشكال الإسوية RA و RB (فلاي بيس). تظهر sgRNAs التي تستهدف قالب بوليميريز RNA (rT ، أحمر) وخيوط غير قالب (rNT ، بنفسجي). المنطقة 5 ′ بين الجينات roX1 RA والجين المنبع يين يظهر بخط أسود خالص. تشير رؤوس الأسهم إلى موضع المواد الأولية المستخدمة في الكشف roX1 RNA (أسود) و roX1 RA شكل إسوي (أزرق) لتحليل RT-qPCR. (ب) يُظهر تحليل RT-PCR باستخدام خلايا استنساخ 8 وجود roX1 RA و RB النصوص. البادئات الخاصة بالتسلسلات في المنطقة الجينية ، roX1 RA و roX1 RB تم استخدام isoform لتضخيم PCR. (ج ، د ، هـ) RT-qPCR قياس وفرة roX1 و ROX2 النصوص في خطوط الخلايا التي تتعايش مع الإنسان (C ، D) أو ذبابة الفاكهة (E) بروتين dCas9 و sgRNAs (كما هو موضح على المحور السيني) مكمل لخيط DNA rT أو rNT في الجوهر الداخلي roX1 المكان. تظهر خطوط الخلايا التي تعبر عن sgRNA واحد (C) ، أو اثنين من RNAs الإرشادية في وقت واحد (D ، E). تتوسط gRNAs rNT7 و rT8 و rT9 الضربة القاضية الفعالة لـ roX1 نسخة طبق الأصل ، سواء بمفردها أو بالاشتراك مع آخرين. ومع ذلك ، فإن مجموعات rT1 + rT3 و rT4 + rNT5 التي تستهدف roX1 RA موقع بدء النسخ ، فعالة فقط في أزواج في وجود dCas9 البشري و ذبابة الفاكهة dCas9 ، على التوالي. يُظهر المحور الصادي إثراء الحمض النووي الريبي بالنسبة إلى rp49 نسخة وطبيعية للخلايا المنقولة باستخدام pGTL-1 الذي يحتوي على تسلسل غير مستهدف (Ctrl). يتم عرض البيانات من نسختين بيولوجيتين ، يتم تنفيذ كل منهما في ثلاث نسخ. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. يُظهر٪ ضربة قاضية بالنسبة المئوية مقارنةً بـ Ctrl.

ال roX1 تم إسكات التعبير بكفاءة بواسطة CRISPRi. (أ) تمثيل تخطيطي لـ ذبابة الفاكهة ROX1 الموضع والمواقف النسبية لـ roX1-استهداف sgRNAs. هناك نوعان من مواقع بدء النسخ roX1 الجين (270 nt على حدة) الذي ينتج الأشكال الإسوية RA و RB (فلاي بيس). تظهر sgRNAs التي تستهدف قالب بوليميريز RNA (rT ، أحمر) وخيوط غير قالب (rNT ، بنفسجي). المنطقة 5 ′ بين الجينات roX1 RA والجين المنبع يين يظهر بخط أسود خالص. تشير رؤوس الأسهم إلى موضع البادئات المستخدمة في الكشف roX1 RNA (أسود) و roX1 RA شكل إسوي (أزرق) لتحليل RT-qPCR. (ب) يُظهر تحليل RT-PCR باستخدام خلايا استنساخ 8 وجود roX1 RA و RB النصوص. البادئات الخاصة بالتسلسلات في المنطقة الجينية ، roX1 RA و roX1 RB تم استخدام isoform لتضخيم PCR. (ج ، د ، هـ) RT-qPCR قياس وفرة roX1 و ROX2 النصوص في خطوط الخلايا التي تتعايش مع الإنسان (C ، D) أو ذبابة الفاكهة (E) بروتين dCas9 و sgRNAs (كما هو مبين على المحور السيني) مكمل لخيط DNA rT أو rNT في الجوهر الداخلي roX1 المكان. تظهر خطوط الخلايا التي تعبر عن sgRNA واحد (C) ، أو اثنين من RNAs الإرشادية في وقت واحد (D ، E). تتوسط gRNAs rNT7 و rT8 و rT9 الضربة القاضية الفعالة لـ roX1 نسخة طبق الأصل ، سواء بمفردها أو بالاشتراك مع آخرين. ومع ذلك ، فإن مجموعات rT1 + rT3 و rT4 + rNT5 التي تستهدف roX1 RA موقع بدء النسخ ، فعالة فقط في أزواج في وجود dCas9 البشري و ذبابة الفاكهة dCas9 ، على التوالي. يُظهر المحور الصادي إثراء الحمض النووي الريبي بالنسبة إلى rp49 نسخة وطبيعية للخلايا المنقولة باستخدام pGTL-1 الذي يحتوي على تسلسل غير مستهدف (Ctrl). يتم عرض البيانات من نسختين بيولوجيتين ، يتم تنفيذ كل منهما في ثلاث نسخ. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. يُظهر٪ ضربة قاضية بالنسبة المئوية مقارنةً بـ Ctrl.

ال ROX2 يتم تنظيم النسخة بكفاءة بواسطة CRISPRi. (أ) تمثيل تخطيطي لـ ذبابة الفاكهة ROX2 موضع إظهار المواقف النسبية ل ROX2 استهداف sgRNAs. يتم تمييز موقع بدء النسخ بسهم بينما يتم وضع intron داخل ملف ROX2 يظهر الجين بخط رمادي صلب. المنطقة بين الجينات بين ROX2 موقع بدء النسخ والجين المجاور (cg11695) يظهر بخط أسود خالص. تظهر sgRNAs التي تستهدف خيوط rT و rNT باللون الأحمر والبنفسجي ، على التوالي. تشير رؤوس الأسهم إلى موضع البادئات المستخدمة في الكشف ROX2 الحمض النووي الريبي لتحليل RT-qPCR. (ب و ج) RT-qPCR قياس وفرة roX1 و ROX2 النصوص في خطوط الخلايا التي تتعايش مع الإنسان (ب) أو ذبابة الفاكهة (C) بروتين dCas9 واثنين من sgRNAs (كما هو موضح على المحور x). بينما لا تؤثر sgRNAs rTb + rTc roX1 أو ROX2 مستويات في وجود dCas9 البشري ، فإنها ضربة قاضية على وجه التحديد ROX2 مستويات النسخ في الخلايا تتعايش ذبابة الفاكهة دكاس 9. يُظهر المحور y إثراء الحمض النووي الريبي بالنسبة إلى rp49 نسخة وطبيعية للخلايا المنقولة باستخدام pGTL-1 الذي يحتوي على تسلسل غير مستهدف (Ctrl). يتم عرض البيانات من نسختين بيولوجيتين ، يتم تنفيذ كل منهما في ثلاث نسخ. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. يُظهر٪ ضربة قاضية بالنسبة المئوية مقارنةً بـ Ctrl.

ال ROX2 يتم تنظيم النسخة بكفاءة بواسطة CRISPRi. (أ) تمثيل تخطيطي لـ ذبابة الفاكهة ROX2 موضع إظهار المواقف النسبية ل ROX2 استهداف sgRNAs. يتم تمييز موقع بدء النسخ بسهم بينما يتم وضع intron داخل ملف ROX2 يظهر الجين بخط رمادي صلب. المنطقة بين الجينات بين ROX2 موقع بدء النسخ والجين المجاور (cg11695) يظهر بخط أسود خالص. تظهر sgRNAs التي تستهدف خيوط rT و rNT باللون الأحمر والبنفسجي ، على التوالي. تشير رؤوس الأسهم إلى موضع المواد الأولية المستخدمة في الكشف ROX2 الحمض النووي الريبي لتحليل RT-qPCR. (ب و ج) RT-qPCR قياس وفرة roX1 و ROX2 النصوص في خطوط الخلايا التي تتعايش مع الإنسان (ب) أو ذبابة الفاكهة (C) بروتين dCas9 واثنين من sgRNAs (كما هو موضح على المحور x). بينما لا تؤثر sgRNAs rTb + rTc roX1 أو ROX2 مستويات في وجود dCas9 البشري ، فإنها ضربة قاضية على وجه التحديد ROX2 مستويات النسخ في الخلايا تتعايش ذبابة الفاكهة دكاس 9. يُظهر المحور الصادي إثراء الحمض النووي الريبي بالنسبة إلى rp49 نسخة وطبيعية للخلايا المنقولة باستخدام pGTL-1 الذي يحتوي على تسلسل غير مستهدف (Ctrl). يتم عرض البيانات من نسختين بيولوجيتين ، يتم تنفيذ كل منهما في ثلاث نسخ. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. يُظهر٪ ضربة قاضية بالنسبة المئوية مقارنةً بـ Ctrl.

أولاً ، حاولنا قمع نسخ ملف roX1 RNA عن طريق دمج RNA موجِّه واحد مع بروتين dCas9. نموذج الجين FlyBase (http://flybase.org/) لـ roX1 يتنبأ بموقعين مميزين لبدء النسخ مما يؤدي إلى مدة أطول roX1 RA وأقصر roX1 RB إسوفورم. تظهر بياناتنا أن كلا النسختين موجودتان في 8 خلايا مستنسخة (الشكل 2 ب) للتحقق من موقعي البدء. والجدير بالذكر أن roX1 RB تم استخدام منطقة الجين وحدها في التركيبات المعدلة وراثيا لتحليل الإنقاذ (30). تظهر نتائجنا أن تجنيد dCas9 المجاور لـ roX1 RB أدى بدء النسخ إلى إسكات فعال لكليهما RA و RB الأشكال الإسوية (الشكل 2C ، الشكل التكميلي S1A). ومن المثير للاهتمام ، أن sgRNA الذي يستهدف الشريط غير النموذجي (rNT7) والقالب (rT8) أظهر كفاءة مماثلة (95٪ و 85٪ ، على التوالي) ، مما يشير إلى عدم وجود تحيز في قالب الحمض النووي لإسكات كما لوحظ في الخلايا البشرية (7). باستمرار ، يُظهر rT9 ، الذي يستهدف حبلا القالب ويتداخل جزئيًا مع rNT7 ، نشاطًا قمعيًا مشابهًا. الضربة القاضية تعتمد على roX1 تسلسل الاستهداف ويكون محددًا كخلايا منخفضة بشكل ملحوظ roX1 لم تظهر المستويات ما يصاحب ذلك من انخفاض ROX2 مستويات الحمض النووي الريبي. استهداف dCas9 لمناطق المنبع من roX1 فشلت مواقع بدء النسخ (TSS) في التأثير على مستويات الحمض النووي الريبي. أظهر التحليل الغربي تعبيرًا فعالًا عن بروتين dCas9 في خطوط الخلايا هذه (الشكل التكميلي S2A) مما يؤكد الدور الحاسم لتسلسل توجيه الحمض النووي الريبي في القمع. يمكن أن يكون التباين في تعبير بروتين dCas9 بسبب تأثيرات موضع الكروموسومات و / أو تغييرات رقم نسخة الكروموسوم في خط الخلية هذا (31). مجتمعة نتائجنا تكشف عن sgRNAs قوية لـ roX1 إسكات وإظهار أن تجميع مركب dCas9-sgRNA على أي من خيطي الحمض النووي يمكن أن يسكت بشكل فعال تعبير lncRNA ، ربما عن طريق منع ارتباط و / أو استطالة بوليميريز RNA.

أظهرت دراسة سابقة أنه يمكن تعزيز كفاءة CRISPRi باستخدام اثنين من sgRNAs تستهدف نفس الجين في البكتيريا (9). لاختبار هذا في ذبابة الفاكهة الخلايا ، قمنا بإدخال كاسيت U6: 1-sgRNA في ناقل pGTL-1 فورًا في اتجاه المنبع من الكاسيت U6: 3 ، وبالتالي إنشاء متجه pGTL-2 (الشكل 1 ب) وهذا يسمح بالتعبير عن sgRNA الثاني تحت سيطرة U6: مروج واحد يُظهر أيضًا نشاطًا قويًا في ذبابة الفاكهة (13). للتعبير ، اخترنا مجموعات sgRNA التي تقع & gt30 bp بصرف النظر عن السماح بالربط الفعال لبروتين dCas9. كما هو مبين في الشكل 2D ، فإن sgRNAs مكملة لتسلسلات المنبع من (rNT6 + rNT7) وتحيط بـ roX1 RB أظهر الشكل الإسوي (rNT7 + rT8 ، rT8 + rT9) انخفاضًا قويًا في roX1 نسخة طبق الأصل. هذا متوقع ويمكن أن يُعزى إلى فعالية rNT7 و rT8 و rT9 sgRNA كما لوحظ سابقًا (الشكل 2C) ، على الرغم من أنه يتم الآن التعبير عن rNT7 و rT8 تحت سيطرة مروج U6: 1. بشكل ملحوظ ، نلاحظ إسكات فعال لـ roX1 RNA بواسطة sgRNAs التي تستهدف roX1 RA منطقة النسخ. على الرغم من عدم فعاليتها بشكل فردي ، فإن مجموعات sgRNA التي تستهدف حبلا القالب (rT1 + rT3) أو كل من القالب والحبلا غير القالب (rT4 + rNT5) تظهر خسارة ملفتة في roX1 مستويات الحمض النووي الريبي (50٪ و 90٪ على التوالي). لم نلاحظ وجود علاقة قوية بين مستويات dCas9 وتثبيط النسخ (الشكل التكميلي S2B). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن ربط عدة بروتينات dCas9 في مواقع بدء النسخ يمكن أن يزيد من فعالية إسكات النسخ.

حددنا بعد ذلك ما إذا كان تحسين الكودون لبروتين dCas9 يمكن أن يعزز النشاط الاندماجي لـ CRISPRi. ال ذبابة الفاكهة تم استخدام Cas9 المحسن من الكودون مؤخرًا من أجل في الجسم الحي ومع ذلك ، فإن تعديل الجينات ، أدى التعبير عن البروتين باستخدام محركات Gal4 القوية في كل مكان إلى حدوث فتك كبير لأسباب غير معروفة حتى الآن (13). أنشأنا خاملًا تحفيزيًا ذبابة الفاكهة Cas9 عن طريق تحور الأحماض الأمينية الضرورية لنشاط نوكلياز (D10A و H841A) واستبدال dCas9 البشري في ناقل pGTL-2. كما هو مبين في الشكل 2E ، فإن تعايش sgRNAs و ذبابة الفاكهة يلخص dCas9 نشاط إسكات sgRNAs إلى حد مماثل كما لوحظ مع بروتين dCas9 البشري (rNT6 + rNT7 و rNT7 + rT8 و rT8 + rT9). أظهر التحليل الغربي ترجمة فعالة لـ ذبابة الفاكهة بروتين dCas9 (الشكل التكميلي S2B). لم تظهر خطوط الخلايا أي نمط ظاهري صريح يشير إلى ذلك ذبابة الفاكهة تعبير dCas9 ليس سامًا والبروتين نشط في إسكات التعبير الجيني. ومع ذلك ، بالمقارنة مع dCas9 البشري ، لاحظنا انخفاضًا مذهلاً (97 ٪ لـ ذبابة الفاكهة dCas9 مقابل 50٪ لـ dCas9 البشري) من roX1 RA و RB RNA مع sgRNAs التي تستهدف المنطقة 5 من roX1 RA TSS (rT1 + rT3) (الشكل 2E ، الشكل التكميلي S1B). الآثار المعززة لتوليفة الحمض النووي الريبي الدليلي هذه ، على الرغم من عدم فعاليتها بشكل فردي ، يمكن أن تكون راجعة إلى استهداف العناصر التنظيمية الزائدة عن الحاجة في roX1 منطقة بين الجينات. لاحظنا أيضًا أن الخلايا التي تعبر عن rT4 + rNT5 تظهر انخفاضًا بنسبة 40٪ في ROX2 مستويات الحمض النووي الريبي (الشكل 2E) - هذا غير مرجح بسبب تأثير خارج الهدف حيث لا تتأثر مستويات Gapdh و CTPsyn RNA بالمثل (الشكل التكميلي S3A). الأهم من ذلك ، كشف تسلسل الحمض النووي أن تأثير إسكات ذبابة الفاكهة لا يتضمن مجمع dCas9-sgRNA في الموقع الداخلي تغييرات في تسلسل الحمض النووي (الشكل التكميلي S4).

حيث roX1 أظهر استهداف sgRNAs تأثيرًا اندماجيًا في إسكات الجينات وكان فعالًا في وجود ذبابة الفاكهة dCas9 ، اختبرنا ما إذا كان يمكن استخدام استراتيجية مماثلة للإلغاء ROX2 النسخ. للتحليل ، اخترنا ثلاثة تسلسلات استهداف حول roX2 RA TSS ، مكمل لكل من خيوط غير القالب (rNTa) والقالب (rTb و rTc) (الشكل 3 أ). لم يؤثر تعايش sgRNAs مع dCas9 البشري على ROX2 مستوى النص بشكل ملحوظ (الشكل 3 ب). ومع ذلك ، عندما تم التعبير عن نفس التوليفات من sgRNAs جنبًا إلى جنب مع ذبابة الفاكهة dCas9 ، لاحظنا انخفاضًا كبيرًا (90 ٪ ضربة قاضية) من ROX2 نسخة في sgRNAs المرافقة لموقع بدء النسخ (rTb + rTc ، الشكل 3C). الأهم من ذلك ، أن roX1 لم يتأثر النص في نفس خط الخلية ، مما يدل على خصوصية الضربة القاضية. بشكل ثابت ، تظل مستويات RNA Gapdh و CTPsyn أيضًا دون تغيير (الشكل التكميلي S3B). والجدير بالذكر أن مستويات بروتين dCas9 لا تتوافق مع درجة القمع (الشكل التكميلي S2C). هذه البيانات ، جنبًا إلى جنب مع ملاحظتنا السابقة مع roX1، يدعم النشاط المحسن لـ ذبابة الفاكهة dCas9 في التوسط في قمع النسخ عبر CRISPRi.

حتى الآن ، لم يتم تطبيق CRISPRi في أي كائن متعدد الخلايا. لتحديد فعالية CRISPRi في قمع نسخ ملفات ROX الحمض النووي الريبي في الجسم الحي، أنشأنا ذبابين معدلين وراثيًا معبرًا ذبابة الفاكهة dCas9 و sgRNAs تحت المروجين النشطين. للتحليل ، اخترنا الدليل RNAs الذي أظهر نشاطًا قويًا في تقليل تنظيم المقابل ROX الجينات في ذبابة الفاكهة خط الخلية - rT8 + rT9 للهدف roX1 و rTb + rTc لـ ROX2. من أجل التحوير ، قمنا بتعديل pAct5c-Cas9 vector (13) لتوليد ناقل pGTL-3 - تم استبدال الجين Cas9 بـ ذبابة الفاكهة dCas9 و U6: 1-sgRNA-U6: تم إدخال شرائط 3-sgRNA بين مصغرة بيضاء الجين و Act5c المروج (الشكل 4 أ). يسمح هذا الموجه بالتكامل الثابت الخاص بالموقع في ملف ذبابة الفاكهة الجينوم ، وبالتالي القضاء على تأثير الموقع والتنوع في التعبير الجيني. في الواقع ، فإن dCas9-roX1 و dCas9-ROX2 تعبر خطوط الطيران بكفاءة عن مستويات مماثلة من ذبابة الفاكهة البروتين (الشكل التكميلي S2D) وكانت قابلة للتطبيق مما يشير إلى أن التعبير عن هذه الجينات المحورة لم يكن سامًا. أظهر RT-qPCR انخفاضًا قويًا ومحددًا في roX1 و ROX2 مستويات الحمض النووي الريبي (الشكل 4 ب) والتي تتوافق مع تحليلاتنا في خط الخلية ، وبالتالي ، تتحقق من صحة النشاط القمعي لـ ذبابة الفاكهة دكاس 9 في الجسم الحي. من المحتمل أن يكون الخلل هو التقليل من شأن أكتين 5 ج لا يتم التعبير عنه في بعض أنسجة البالغين (32) ويتم استبعاده من السلالة الجرثومية. بشكل ملحوظ ، مقارنة بالإناث ، لاحظنا انخفاضًا حادًا في قابلية الذكور للتعايش roX1 و ROX2 توجيه الحمض النووي الريبي (7.6٪ dCas9-roX1/ dCas9-ROX2 الذكور مقابل 52.1٪ من الذكور من النوع البري ، الشكل 4 ج). الذكور الهاربون هم من الخصوبة ولا تظهر عليهم عيوب مظهرية واضحة. هذا يتفق مع خسارة كبيرة في وظيفة ROX (33). وهكذا ، نستنتج أن تجنيد ذبابة الفاكهة dCas9 في roX1 و ROX2 يعطل الموضع تعبيرهم عن طريق قمع النسخ ، مما يؤدي إلى وفاة الذكور.

هدم roX1 و ROX2 الحمض النووي الريبي في الجسم الحي. (أ) تمثيل تخطيطي لـ ذبابة الفاكهة نواقل الجينات pGTL-3. علامة الاختيار السائدة مصغرة بيضاء يتبعه الدليل المزدوج RNA الذي يعبر عن الكاسيت تحت سيطرة U6: 1 و U6: 3 المروجين أثناء التعبير عن ذبابة الفاكهة يتم التحكم في dCas9 بواسطة المروج النشط التأسيسي أكتين 5 ج. تم تمييز بقايا الأحماض الأمينية المتحولة (D10 & gt A و H841 & gt A) في dCas9 بعلامات نجمية حمراء (*). N = تسلسل NLS ، F = حاتمة FLAG ، pA = عديد الأدينيل. (ب) يُظهر تحليل RT-qPCR استنفادًا قويًا لـ roX1 و ROX2 RNAs في ذكور خطوط الطيران التي تعبر عن الدليل المقابل RNAs (كما هو موضح على المحور x). يُظهر المحور الصادي إثراء الحمض النووي الريبي بالنسبة إلى rp49 نسخة وتطبيع إلى النوع البري (ذ ، ث) ذكور. يتم عرض البيانات من نسختين بيولوجيتين ، يتم تنفيذ كل منهما في ثلاث نسخ. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. تُظهر النسبة المئوية ضربة قاضية بالنسبة المئوية مقارنة بالنوع البري. (ج) جدول يوضح انخفاضًا حادًا في ذرية الذكور معبرة في وقت واحد roX1 و ROX2 دليل RNAs (rT8 + rT9-Act: dCas9 / rTb + rTc-Act: dCas9). يتم حساب النسبة المئوية لبقاء الذكور بناءً على العدد الإجمالي لنسل نفس النمط الجيني المستعاد في نفس الهجين. ال ذ ، ث تم استخدام سلالة كنوع بري.

هدم roX1 و ROX2 الحمض النووي الريبي في الجسم الحي. (أ) تمثيل تخطيطي لـ ذبابة الفاكهة نواقل التحوير pGTL-3. علامة الاختيار السائدة مصغرة بيضاء يتبعه الدليل المزدوج RNA الذي يعبر عن الكاسيت تحت سيطرة U6: 1 و U6: 3 المروجين أثناء التعبير عن ذبابة الفاكهة يتم التحكم في dCas9 بواسطة المروج النشط التأسيسي أكتين 5 ج. تم تمييز بقايا الأحماض الأمينية المتحولة (D10 & gt A و H841 & gt A) في dCas9 بعلامات نجمية حمراء (*). N = تسلسل NLS ، F = حاتمة FLAG ، pA = عديد الأدينيل. (ب) يُظهر تحليل RT-qPCR استنفادًا قويًا لـ roX1 و ROX2 RNAs في ذكور خطوط الطيران التي تعبر عن الدليل المقابل RNAs (كما هو موضح على المحور x). يُظهر المحور الصادي إثراء الحمض النووي الريبي بالنسبة إلى rp49 نسخة وتطبيع إلى النوع البري (ذ ، ث) ذكور. يتم عرض البيانات من نسختين بيولوجيتين ، يتم تنفيذ كل منهما في ثلاث نسخ. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. تُظهر النسبة المئوية ضربة قاضية بالنسبة المئوية مقارنة بالنوع البري. (ج) جدول يوضح انخفاضًا حادًا في ذرية الذكور معبرة في وقت واحد roX1 و ROX2 دليل RNAs (rT8 + rT9-Act: dCas9 / rTb + rTc-Act: dCas9). يتم حساب النسبة المئوية لبقاء الذكور بناءً على العدد الإجمالي لنسل نفس النمط الجيني المستعاد في نفس الهجين. ال ذ ، ث تم استخدام السلالة كنوع بري.

في هذا التقرير ، نصف نهجًا فعالًا لفقدان الوظيفة لدراسة جينات lncRNA في ذبابة الفاكهة بواسطة نظام CRISPRi أدنى لا يتطلب اندماج مجالات المستجيب إلى dCas9. باستخدام هذه الطريقة المباشرة ، حققنا مستويات عالية من إسقاط ROX الحمض النووي الريبي (حتى 50 ضعفًا) عن طريق استهداف المواقع الداخلية في ذبابة الفاكهة الخلايا. تتغلب استراتيجيتنا على القيود السابقة للنهج الجينية المستخدمة لتقييم وظيفة lncRNA - فهي لا تدخل تغييرات في الحمض النووي وتزيل التوظيف خارج الرحم لمجمعات إسكات الكروماتين. توضح نتائجنا أن استهداف العديد من sgRNAs التي تحيط بموقع بدء النسخ للجينات يحسن من فاعلية CRISPRi. في هذا الصدد ، يجب أن يؤدي التطوير الأخير لبروتينات Cas9 المهندسة بخصائص التعرف على PAM المرنة والخصوصية المحسنة إلى زيادة اختيار التسلسلات المستهدفة مع تقليل التأثيرات غير المستهدفة (34 ، 35). نظرًا لأن نشاط RNA الإرشادي لا يزال من الصعب التنبؤ به وتوصيف العناصر التنظيمية للمروج والنسخ من lncRNAs لا تزال غير مكتملة ، فإننا نوصي باختبار RNAs دليل متعدد لتحديد أدلة قوية للتحليل. يسمح تصميم ناقل تعداء الخلايا والمقايسة المستندة إلى الخلايا الخاصة بنا بالتقييم السريع لفعالية العديد من sgRNAs قبل استخدامها في في الجسم الحي دراسات تتراوح من القياس إلى إسكات التعبير الجيني وكذلك تجارب رسم خرائط المحفز و / أو المحسن. يجب أن تسمح هذه الإستراتيجية ، جنبًا إلى جنب مع مناهج التقويض التقليدية ، بالاستكشاف الوظيفي والميكانيكي لـ lncRNAs عبر الميتازوا ، وبالتالي إلقاء الضوء على هذه النسخ الغامضة التي تشكل "المادة المظلمة" للجينوم.

نشكر Fillip Port و Simon Bullock على هبة البلازميدات ، ومركز موارد Drosophila Genomics المدعوم بمنح NIH 2P40OD010949-10A1 لخط الخلية ، Yong Huang للمساعدة في تحليل البيانات ، Stuart Grice لقراءة نقدية للمخطوطة وأعضاء Liu المختبر لإجراء مناقشات مفيدة. نشكر أيضًا مرفق الذباب التابع لقسم علم الوراثة بجامعة كامبريدج لتوليد خطوط طيران معدلة وراثيًا.


مقالة - سلعة

لقد تحدى اكتشاف RNAs الوظيفية الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) النموذج القائل بأن معظم الـ RNAs تشفر البروتينات. LncRNAs هي فئة وفيرة من RNAs> 200 nt في الطول والتي كان يُفترض سابقًا أنها ضوضاء نسخية. من المقبول الآن على نطاق واسع أن بعض هذه lncRNAs لها أدوار تنظيمية متنوعة في التعبير الجيني ، ويمكن أن تكون بمثابة مكونات هيكلية لتشكيل التنظيم النووي ويمكن حتى أن تعمل كشراك خادعة لـ RNAs الأخرى أو البروتينات 1-3. بينما تم فهرسة عشرات الآلاف من نسخ lncRNA ، لا تزال الوظيفة البيولوجية لغالبية lncRNAs لغزا. يعد تحديد الوظائف الفردية لأعضاء هذه الفئة المكتشفة حديثًا من الحمض النووي الريبي مهمًا لفهم البيولوجيا التطورية والتطور والأمراض الوراثية بشكل أفضل.

على غرار البروتينات ، تمتلك lncRNAs الفردية توزيعات خلوية محددة تعتبر بالغة الأهمية لوظيفتها 4. يتم تخصيب بعض lncRNAs في النواة وتشارك في تنظيم العمليات النووية مثل النسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي. يتم إثراء lncRNAs الأخرى في السيتوبلازم حيث يمكنها التأثير على توطين البروتين أو تعديل استقرار mRNA وترجمتها. يتم توزيع بعض lncRNAs بشكل متساوٍ بين النواة والسيتوبلازم. يمكن أن يؤثر موقع الخزان الأساسي لـ lncRNA على القدرة على هدم مستويات التعبير لتلك الأنواع.

تُستخدم ثلاث استراتيجيات بشكل شائع لضربة قاضية أو الضربة القاضية لـ lncRNAs ، بما في ذلك: تدهور الحمض النووي الريبي بواسطة تدخل RNA (RNAi) ، تدهور RNA بواسطة RNase H تنشيط oligonucleotides (ASOs) ، أو الحذف / التغيير الإجمالي على مستوى DNA باستخدام CRISPR / طرق تحرير الجينوم Cas9 (الشكل 1). كل من هذه الأدوات لها مزاياها وعيوبها ، ويمكن أن يتأثر النجاح بالتوطين الخلوي للـ lncRNA والمشهد النسخي الذي توجد فيه.

شكل 1: رسم تخطيطي للطرق الثلاثة الشائعة المستخدمة لضربة قاضية أو الضربة القاضية lncRNAs. يستخدم تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) مركب الإسكات الناجم عن الحمض النووي الريبي متعدد البروتينات (RISC) الذي يحتوي على سيرنا لتقليل الحمض النووي الريبي المستهدف على وجه التحديد. يرتبط oligonucleotides مضاد المعنى (ASOs) بالحمض النووي الريبي المستهدف ويستخدم RNase H1 ، وهو إنزيم يشق الحمض النووي الريبي في RNA / DNA heteroduplex. يقوم تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 بإجراء تعديلات على المستوى الجينومي باستخدام هدف معين من الحمض الريبي النووي الريبي المهجن إلى tracrRNA ، والذي يتم تعقيده مع بروتين Cas9.

RNAi هي تقنية ضربة قاضية شائعة الاستخدام تستخدم مركب إسكات مستحث بـ RNAi متعدد البروتينات (RISC) لقمع mRNAs 5. يتكون مجمع تحميل RISC البشري (RLC) من ثلاثة بروتينات (Dicer و TRBP و Ago2) مسؤولة عن معالجة dsRNAs الأطول في siRNAs الناضجة وتحميل هذه siRNAs في Ago2. لقد ثبت سابقًا أن تحلل الرنا المرسال بوساطة الحمض النووي الريبي يحدث في السيتوبلازم 6. في سلسلة من تجارب التجزؤ والمناعة المشتركة ، Stalder et al. أوضح بشكل أكثر تحديدًا أن تحميل RISC الكنسي ، والربط اللاحق مع mRNA المستهدف وانقسام الرنا المرسال بوساطة Ago2 يحدث بشكل أساسي في الشبكة الإندوبلازمية الخشنة ، حيث يتم ترجمة mRNAs إلى بروتينات 7. تستفيد ضربة قاضية RNA بوساطة RNase H1 المضادة للتحسس من إنزيم RNase H1 الداخلي ، وهو أكثر وفرة في النواة حيث يُعتقد أنه يعمل في تكرار الحمض النووي وإصلاحه 8-11. بدلاً من ذلك ، يمكن استخدام ASOs للحظر الفراغي لمنع تقاطعات لصق لتقليل تراكم نسخ lncRNA الناضجة أو منع الوصول إلى المجالات الوظيفية الرئيسية دون التسبب في تدهور RNA الهدف 12،13. يتم تصنيع ASOs الحجب المجسم من بقايا معدلة كيميائيًا لا تدعم انقسام RNase H1 ، مثل العمود الفقري المعدل 2’الريبوز أو morpholino 14. يعتمد كل من ASOs RNAi و RNase H النشط على جزيئات المستجيب الموجودة بشكل طبيعي لتحطيم lncRNA. في المقابل ، تعتمد طرق تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 على إنزيم نوكلياز داخلي بكتيري يمكن أن يستهدف المواقع المرغوبة في الجينوم بواسطة دليل RNA خاص بالموقع حيث يولد فواصل DNA مزدوجة الشريطة في أو حول الموقع المستهدف 15،16. تعمل آلية الإصلاح الخلوي على شفاء الفواصل المزدوجة ، تاركًا "ندوبًا" صغيرة في الجينوم ، أو حتى يمكن استخدامها لحذف كتل كبيرة من الحمض النووي وبالتالي القضاء على lncRNA على المستوى الجيني. يمكن أيضًا استخدام طرق CRISPR / Cas9 لإدخال تسلسلات جديدة في الموقع المستهدف ، مثل محولات النسخ التي ستمنع إنتاج lncRNAs كاملة الطول. يمكن أن يساعد فهم طبيعة lncRNA موضع الاهتمام بشكل أفضل في اختيار تقنية الضربة القاضية المثلى.

مع خلفية واسعة من تجربة ضربة قاضية لـ mRNA ، توقعنا أن تطبيق نفس ذخيرة الكواشف لقمع lncRNAs يمكن أن يتحقق بسهولة. ومع ذلك ، وجدنا أن بعض lncRNAs كان من الصعب قمعها ، ولاحظنا في النهاية ما يبدو أنه ارتباط بأن الطرق القائمة على RNAi (RNAs صغيرة متداخلة ، أو siRNAs أو ركيزة Dicer ، DsiRNAs) كانت أقل فعالية ضد أهداف lncRNA المحلية. افترضنا أن هذه lncRNAs النووية يمكن قمعها بسهولة أكبر باستخدام ضربة قاضية بوساطة RNase-H ، نظرًا لأن RNase H موجود في الغالب في النواة. على العكس من ذلك ، اعتقدنا أن RNAi ، وهي عملية حشوية في الغالب ، قد تكون أكثر فعالية عند استهداف مجموعات السيتوبلازم من lncRNAs. لاختبار هذا الاحتمال ، تم إجراء دراسة منهجية في زراعة الخلايا لمقارنة فعالية ASOs (20mer DNA-PS ، أو فجوة 20mer 2'OMe-PS أو فجوات LNA-PS 16mer (Exiqon) ، حيث PS = روابط الفوسفوروثيوات ، LNA = مغلق nucleic acid و 2'OMe = 2'-O-Methyl RNA) أو RNAi (DsiRNAs أو siRNA أو Silencer® Select siRNAs (Thermo Fisher Scientific)) مقابل سبعة lncRNAs ذات أنماط توطين متغيرة 17. تم استهداف lncRNAs النووية (MALAT1 و NEAT1) أو lncRNAs السيتوبلازمية (DANCR و OIP5-AS1) أو lncRNAs المزدوجة المترجمة (TUG1 و CasC7 و HOTAIR) بواسطة ASOs (18 موقعًا / هدف) أو RNAi (28 موقعًا / هدفًا). نظرًا لوجود مجموعة واسعة من الفعالية بين المواقع اعتمادًا على معلمات مثل محتوى GC وإمكانية الوصول المستهدفة ، فقد تم اختيار المواقع باستخدام خوارزميات التصميم المُحسَّنة (RNAi) أو باستخدام معايير تصميم داخلية صارمة ومحددة جيدًا (ASOs) لزيادة الاحتمالية لمقارنة المواقع النشطة للغاية بين استراتيجيتي الضربة القاضيتين. كانت النتائج متوافقة مع فرضيتنا: تم هدم lncRNAs النووية بسهولة أكبر عند استخدام ASOs ، بينما كانت الأهداف السيتوبلازمية أكثر سهولة عند استخدام RNAi (الشكل 2). عند مقارنة فاعلية استراتيجيات التعديل الكيميائي المختلفة لـ ASO ، وجد أنه بينما كان لدى DNA-PS و 2’OMe-PS ASOs أنماط ضربة قاضية متشابهة جدًا بين المواقع المختلفة ، كانت فجوات 2’OMe-PS أكثر فعالية باستمرار. كان هذا متوقعًا ، نظرًا لأن قواعد 2’OMe تزيد من تقارب ربط ASO بالهدف. أظهرت فجوة 2’OMe-PS و ASOs LNA-PS فاعلية مماثلة عند جرعة 10 نانومتر ، ومع ذلك ، كانت فجوات LNA-PS أكثر فاعلية عند الجرعات المنخفضة. لم يكن هناك فرق إجمالي في النشاط بين أي من الكواشف RNAi المختلفة التي تم اختبارها. لم يتم تناول مدة الضربة القاضية في هذه الدراسة ، وعادةً ما يُلاحظ قمع يستمر من 3 إلى 7 أيام في زراعة الخلايا (حيث يمكن الحد من التخفيف من انقسام الخلية عن طريق تقليل تركيز ASOs أو siRNAs) ، في حين أن الضربة القاضية لعدة أسابيع أو حتى شهر يمكن أن تكون محدودة. يمكن رؤيتها في الخلايا غير المنقسمة في الجسم الحي 18،19. في حين أن هذه الدراسة فحصت فقط ضربة قاضية للـ lncRNA في زراعة الخلايا ، فمن المتوقع حدوث أنشطة نسبية مماثلة بين فئات الكواشف المختلفة في الجسم الحي إذا تم استخدام أدوات توصيل مناسبة. ل في الجسم الحي الاستخدام ، يمكن توقع ميزة أداء واضحة لفجوات LNA-PS القصيرة إذا تم إعطاؤها عن طريق الحقن الوريدي العاري (بدون أي مساعدة توصيل). يمكن أن يؤدي استخدام أداة توصيل ، مثل الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) أو الترابط المترافق (مثل الكوليسترول أو الجسم المضاد) إلى تحسين توصيل ASOs وسيكون مطلوبًا لاستخدام أي كواشف RNAi في الجسم الحي 18،19،21،22.

حتى الآن ، علقنا على "السهولة النسبية" لأي من أسلوب الضربة القاضية لقمع أهدافها بناءً على ما إذا كان lncRNA في الغالب نوويًا أو سيتوبلازميًا. تظهر نظرة فاحصة على البيانات أن ASOs فعالة أيضًا في تحطيم الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي (الشكل 2). لا تتمتع ASOs بالقدرة الفطرية على استهداف الحمض النووي الريبي المحتفظ به نوويًا فحسب ، بل يمكنها أيضًا تحطيم الحمض النووي الريبي الوليدة قبل التصدير السيتوبلازمي. أيضًا ، وجدت دراسة حديثة فحصت خطوة تحديد معدل تحلل الرنا المرسال بواسطة ASOs أن RNase H1 كان موجودًا أيضًا بمستويات منخفضة في السيتوبلازم 23. بينما حدث تدهور mRNA بوساطة ASO بسرعة أكبر في النواة ، فقد حدث أيضًا بمعدل أبطأ في السيتوبلازم. يشير هذا إلى أنه إذا كان توطين lncRNA غير معروف ، فإن اختيار ضربة قاضية ASO (على عكس RNAi) سيكون له أفضل فرصة للنجاح. ومن المثير للاهتمام ، أظهرت دراستنا أنه عند استهداف lncRNAs ثنائية الموقع ، يمكن تحقيق ضربة قاضية محسنة من خلال الجمع بين ASOs و siRNAs معًا. كان هذا متوقعًا ، مع الأخذ في الاعتبار أن ASO يمكن أن يؤدي إلى تدهور أسرع في تعداد lncRNA النووي وأن siRNA يمكن أن تتدهور بسرعة أكبر في مجتمع lncRNA السيتوبلازمي.

الشكل 2: نظرة عامة على نتائج ضربة قاضية lncRNA التي تقارن فعالية الطريقة مع التوطين الخلوي lncRNA (17). تم نقل oligonucleotides antisense (فجوات LNA-PS أو فجوات 2’OMe-PS أو DNA-PS) أو كواشف RNAi (siRNAs أو DsiRNAs أو Silencer ® Select siRNAs) إلى خلايا هيلا باستخدام Lipofectamine® 2000 لمدة 24 ساعة بجرعة 10 نانومتر. ASOs = oligonucleotides مضادات المعنى PS = روابط الفوسفوروثيوات.

ستكون بعض lncRNAs مقاومة للضربة القاضية بواسطة ASOs أو RNAi. يمكن أن يحدث هذا إذا كان التوطين الخلوي للـ lncRNA لا يمكن الوصول إليه من قبل RNase H أو آلية RNAi. يمكن أن يحدث أيضًا إذا كان lncRNA شديد التنظيم أو مسدودًا بسبب الارتباط المفرط بالبروتين أو التهجين مع الأحماض النووية الخلوية الأخرى. اختبرنا مجموعة متنوعة من ASOs وكواشف RNAi ضد NRON ، وهو lncRNA يعمل كإسفنجة بروتينية ، ولم نتمكن من تحقيق مستويات عالية من الضربة القاضية (نتائج غير منشورة). في هذه الظروف ، قد يكون من الضروري استخدام تقنية مثل تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. إن استخدام أداة تحرير الجينوم لضرب lncRNA ليس بالأمر التافه ، لأن جعل indel صغيرًا في lncRNA المستهدف لن يؤدي على الأرجح إلى تعطيل النسخ ، ولا يوجد "إطار قراءة مفتوح" يمكن تعطيله بسهولة من خلال أحداث indel خارج الإطار. قد لا تزال lncRNAs المنسوخة التي تحتوي على indels التي تم إدخالها حديثًا تحتفظ بالمجالات الوظيفية و / أو مواقع الربط التي من شأنها أن تحجب تحليل النمط الظاهري. نجحت استراتيجيتان في استخدام تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 لإخراج lncRNAs. تستخدم إحدى الإستراتيجيات الحمض النووي الريبي التوجيهي المزدوج لكسر الحمض النووي في وقت واحد في موقعين محددين ، مما يؤدي إلى استئصال جزء كبير من الموقع الجيني الذي يشفر lncRNA. نجح إثبات المفهوم لهذه التقنية في القضاء على lncRNA-21A و UCA1 و AK023948 عن طريق إزالة الأجزاء الكبيرة التي تتراوح من 475 نقطة أساس (lnRNA-21A) إلى 5.6 كيلو بايت (UCA1) 24. تستخدم الإستراتيجية الثانية CRISPR / Cas9 لهندسة عنصر زعزعة استقرار الحمض النووي الريبي (مثل إشارة بولي (A) ، موقع ربط ميرنا ، ريبوزيم ذاتي الانقسام ، وما إلى ذلك) في التسلسل الجيني ، مما يتسبب في زيادة معدل دوران / تدهور نسخة lncRNA. باستخدام هذه الإستراتيجية في البداية مع نوكليازات أصابع الزنك ، طور Gutschner et al نموذج خروج المغلوب MALAT1 من خلال دمج إشارة بولي (A) المنبع لموقع بدء النسخ ، مما أدى إلى تقليل 1000 ضعف لمستويات MALAT1 25،26. أدى ظهور تقنية CRISPR / Cas9 إلى تبسيط هذا النهج إلى حد كبير. تثبيط كريسبر (كريسبري) هي تقنية تستخدم إما بروتين Cas9 (dCas9) غير نشط حفزيًا (ميت) لمنع وظيفة بوليميريز الحمض النووي الريبي ، أو إذا كان قمع النسخ الأعلى مطلوبًا ، فقم بإقران dCas9 مع مثبط النسخ (مثل KRAB) . استهدف Gilbert et al ستة lncRNAs مختلفة باستخدام dCas9-KRAB ، وحققوا> 80٪ ضربة قاضية لـ 5/6 lncRNAs 27. على وجه الخصوص ، يتطلب الاستخدام الفعال لطرق CRISPRi أن يكون موقع عناصر المحسن / المروج معروفًا وأيضًا إذا كانت هذه العناصر التنظيمية تتحكم فقط في التعبير عن lncRNA أو تساهم أيضًا في التعبير عن النصوص (الترميز) الأخرى. باستخدام أي طريقة CRISPR ، يمكن أيضًا التخلص من النصوص التي تتداخل أو يتم نسخها من الخيط المقابل أو تتم معالجتها في أشكال إسوية مختلفة عن غير قصد ، مما يؤدي إلى إرباك تفسير البيانات. في الواقع ، أظهر Goyal et al مؤخرًا أن 62 ٪ من 15،929 lncRNAs التي تم تحليلها في دراستهم كانت أهدافًا ضعيفة لتحرير الجينوم CRISPR / Cas9 بسبب احتوائها على محفزات ثنائية الاتجاه أو داخلية ، وبالتالي ، يمكن أن تؤثر الضربة القاضية على الجينات المجاورة. اختار المؤلفون بعض الأمثلة من هذا التحليل ، وأظهروا أن استخدام CRISPRi لإخراج lncRNAs مع مواضع تتداخل مع جينات أخرى قد أثر بالفعل على الجينات المجاورة لها. في المقابل ، كانت ضربة قاضية RNAi أو ASO لأهداف lncRNA هذه خاصة بالنسخة المستهدفة 28.

جميع التقنيات التي تقمع التعبير الجيني معرضة لخطر التأثيرات غير المستهدفة (OTEs) ، حيث يتم قمع الجينات ذات الصلة التي لها تماثل تسلسلي مع الهدف المقصود عن طريق التهجين المتبادل مع الأحماض النووية المستهدفة. تعتمد خصوصية ASOs فقط على تهجين الحمض النووي Watson-Crick ، ​​كما أن OTEs أسهل في التنبؤ من خلال تحليل المعلومات الحيوية مقارنة بالطرق الأخرى التي يمكن أن تُظهر هذه الكواشف خصوصية قاعدة واحدة ، خاصة عند استخدام ASOs قصيرة التقارب عالية 29. بينما يمكن أن تُظهر طرق RNAi خصوصية قاعدة واحدة ، فإن هذه الطرق لديها مخاطر أعلى من OTEs غير المشتبه به بسبب الحديث المتبادل مع مسارات miRNA ، حيث تحدد "منطقة البذور" القصيرة 6-7 قاعدة خصوصية القمع ، مما يؤدي إلى خطر التأثير على العديد 30- مصل اللبن. ومع ذلك ، فإن عنصرًا كبيرًا في مسار OTE هذا مستمد من القمع الترجمي ، والذي ، بحكم التعريف ، لا يمكن أن يؤثر بشكل مباشر على وظيفة lncRNA. طرق CRISPR بالمثل تنطوي على مخاطر من OTEs. يُظهر استخدام طرق تحرير الجينات المباشرة للبروتينوكليوبروتين (RNP) (حيث يتم استخدام بروتين Cas9 ودليل RNAs فقط في تنسيق خالٍ من الحمض النووي) ملفات تعريف OTE أقل بكثير من الطرق التي تستخدم التعبير المفرط القائم على البلازميد لـ Cas9 وتوجيه RNAs ، إلى حد ما التخفيف من مخاطر OTEs 31. علاوة على ذلك ، تم تطوير طفرات Cas9 التي قللت بشكل كبير من خطر التصرف في المواقع غير المستهدفة 32. ومن ثم ، فإن استخدام "الجيل الأحدث من أساليب CRISPR" يمكن أن يقلل من مخاطر تأثير OTE على النتائج. كمصدر قلق إضافي ، غالبًا ما تؤدي طرق كريسبر التي تغير الحمض النووي للخلية بشكل دائم إلى إنشاء طفرات مختلفة على كل كروموسوم في الخلية أو بين الخلايا في مجموعة سكانية. قد يكون من الضروري عزل خطوط الخلايا النقية نسليًا للدراسة قبل التوصل إلى استنتاجات نهائية من هذه الأنواع من تجارب تحرير الجينوم.

أدى اكتشاف الآلاف من lncRNAs وأدوارها الغامضة في العمليات الخلوية إلى زيادة الحاجة إلى تقنيات ضربة قاضية موثوقة للمساعدة في تحديد وظائفها الفردية. أن تكون قادرًا على تحديد طريقة الضربة القاضية على الأرجح لإعطاء أفضل النتائج ، يوفر الوقت والمال ، ويزيد من تقدم أبحاث lncRNA. وصفنا هنا مجموعة من التقنيات التي يمكن استخدامها اعتمادًا على توطين lncRNA ، ونسخة lncRNA (في) إمكانية الوصول إلى الإنزيمات ، والمشهد النسخي الذي يقيمون فيه.


ضربة قاضية لـ RNA طويل غير مشفر AFAP1-AS1 عززت الجدوى والموت المكبوت لخلايا عضلة القلب استجابةً لـ I / R في المختبر وفي الجسم الحي

يلعب الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNA) دورًا محوريًا في تطور احتشاء عضلة القلب (MI). كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في آثار البروتين المرتبط بخيوط الأكتين lncRNA 1 المضاد للحساسية RNA 1 (AFAP1-AS1) على دورة الخلية ، والتكاثر ، وموت الخلايا المبرمج. تم استخدام RT-qPCR للكشف عن مستويات التعبير عن AFAP1-AS1 و miR-512-3p و reticulon 3 (RTN3) في نموذج الفئران من I / R. تم إنشاء بيئة محاكاة MI. تم استخدام فحص MTT وقياس التدفق الخلوي للكشف عن التغيرات في صلاحية خلايا عضلة القلب ودورة الخلية / موت الخلايا المبرمج بعد MI عن طريق إسكات AFAP1-AS1 أو إسكات RTN3. تم التحقق من علاقة الاستهداف بين miR-512-3p و AFAP1-AS1 و RTN3 في خلايا عضلة القلب عن طريق فحص مراسل لوسيفيراز المزدوج. تم تنظيم مستويات التعبير عن AFAP1-AS1 و RTN3 بشكل كبير في نموذج الفئران لربط LAD (أو MI) ، بينما تم تقليل مستوى التعبير عن miR-512-3p بشكل كبير. عزز الإفراط في التعبير عن AFAP1-AS1 و RTN3 موت الخلايا المبرمج للقلب وتمنع تكاثر خلايا عضلة القلب. كان MiR-512-3p هدفًا مباشرًا لـ AFAP1-AS1 ، وكان RTN3 هدفًا مباشرًا لـ miR-512-3p. عزز AFAP1-AS1 تقدم MI من خلال استهداف miR-512-3p. عزز AFAP1-AS1 تقدم MI من خلال تعديل محور miR-512-3p / RTN3. قد يكون AFAP1-AS1 هدفًا علاجيًا محتملاً لـ MI.

دور AFAP1-AS1 في تنظيم إصابة MI في الجسم الحي. (أ) تأثير AFAP1-AS1 في إصابة MI في الجسم الحي. (ب) مستوى مرنا من RTN3 في إصابة MI في الجسم الحي. (C) مستوى بروتين RTN3 في إصابة MI في الجسم الحي. (D) تأثير miR-512-3p في مجموعة طراز MI. (ه) فحص TUNEL. *ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 مقابل مجموعة الشام #ص & lt 0.05 ، ##ص & lt 0.01 مقابل مجموعة MI


ضربة قاضية لـ PU.1 AS lncRNA تمنع تكون الشحم من خلال تعزيز ترجمة PU.1 mRNA

المراسلات مع: Wei-Jun Pang ، PhD. ، مختبر ترسب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة شمال غرب A&F ، 22 Xinong Road ، Yangling ، مقاطعة شنشي 712100 ، الصين.

مركز أبحاث تغذية الأطفال ، كلية بايلور للطب ، هيوستن ، تكساس ، 77030

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مركز أبحاث تغذية الأطفال ، كلية بايلور للطب ، هيوستن ، تكساس ، 77030

المراسلات مع: Wei-Jun Pang ، PhD. ، مختبر ترسب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة شمال غرب A&F ، 22 Xinong Road ، Yangling ، مقاطعة شنشي 712100 ، الصين.

مركز أبحاث تغذية الأطفال ، كلية بايلور للطب ، هيوستن ، تكساس ، 77030

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

مختبر ترسيب الدهون الحيوانية وتنمية العضلات ، كلية علوم وتكنولوجيا الحيوان ، جامعة نورث وست إيه أند إف ، يانغلينغ 712100 ، الصين

نبذة مختصرة

PU.1 هو عامل نسخ لعائلة Ets يشارك في التمايز النخاعي اللمفاوي. لقد أظهرنا سابقًا أن PU.1 يتم التعبير عنه أيضًا في سلالة الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن مستويات التعبير عن PU.1 mRNA والبروتين في الخلايا الشحمية لا تتطابق مع المستويات الموجودة في الخلايا الشحمية الناضجة. يكون مستوى PU.1 mRNA أعلى في الخلايا preadipocytes ، في حين يتم التعبير عن البروتين في الخلايا الشحمية ولكن ليس في الخلايا preadipocytes. الآلية الأساسية لا تزال بعيدة المنال. هنا ، نجد أن ضربة قاضية miR-155 أو الإفراط في التعبير ليس لها أي تأثير على مستويات PU.1 mRNA والبروتين في الخلايا الشحمية أو الخلايا الشحمية. لا ينظم MiR-155 تكوين الشحم من خلال PU.1 ، ولكن عبر C / EBPβ وهو هدف آخر لـ miR-155. قمنا أيضًا بفحص مستويات التعبير عن PU.1 mRNA و RNA طويل الأمد غير المشفر (AS lncRNA). ومن المثير للاهتمام ، مقارنة بمستوى PU.1 mRNA ، أن مستوى PU.1 AS lncRNA أعلى بكثير في الخلايا الأولية ، بينما يكون عكسه في الخلايا الشحمية. نكتشف كذلك أن PU.1 AS lncRNA يرتبط بـ mRNA الخاص به مكونًا مركب mRNA / AS lncRNA. ضربة قاضية لـ PU.1 AS بواسطة siRNA تمنع تكون الشحم وتعزز تعبير بروتين PU.1 في كل من الخلايا الدهنية والخلايا الشحمية. علاوة على ذلك ، فإن قمع PU.1 AS يقلل من التعبير عن الأديبونكتين وإفرازه. وجدنا أيضًا أن تأثير ضربة قاضية PU.1 AS بوساطة الفيروسات القهقرية على تكوين الشحم يتوافق مع تأثير ضربة قاضية لـ PU.1 AS بواسطة siRNA. مجتمعة ، تشير نتائجنا إلى أن PU.1 AS lncRNA يعزز تكوين الشحم من خلال منع ترجمة PU.1 mRNA عبر الارتباط بـ PU.1 mRNA لتشكيل mRNA / AS lncRNA مزدوج في الخلايا المسبقة. J. الخلية. بيوتشيم. 114: 2500-2512، 2013. © 2013 Wiley Periodicals، Inc.

يمكن العثور على معلومات إضافية داعمة في النسخة الموجودة على الإنترنت من هذه المقالة على موقع الويب الخاص بالناشر.

اسم الملف وصف
jcb24595-sm-0001-SupFig-S1.tif14.7 ميجا بايت الشكل S1. ج: تستهدف miRNAs المتوقعة PU.1 mRNA باستخدام TargetScan الإصدار 6.2. ب: المعلومات الإحصائية عن الاقتران التبعي المتوقع بين PU.1 mRNA و miRNA-155.
jcb24595-sm-0002-SupFig-S2.tif11.6 ميجا بايت الشكل S2. ج: هدف miRNAs المتوقع C / EBPβ mRNA باستخدام TargetScan الإصدار 6.2. B: المعلومات الإحصائية عن الاقتران التبعي المتوقع بين C / EBPβ mRNA و miRNA-155.
jcb24595-sm-0003-SupFig-S3.tif 3.1 ميجا بايت الشكل S3. التعبير عن الدورة الزمنية للأديبونكتين أثناء تمايز الخلايا الأولية.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


شبكات تنظيم الجينات التي تتحكم في تطور الخلايا العصبية

27.6.3 lncRNA - دليل على الوظيفة

RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) هي نوع من النسخ ينشأ من الحمض النووي الجيني ، أطول من 200 نيوكليوتيد ولكنه أقصر من معظم الرنا المرسال ، ويتم التعبير عنه بشكل عام عند مستويات منخفضة. لا يوجد دليل على أن هذه النصوص ترمز للبروتينات ، ويبدو أن غالبية lncRNAs غير مقيدة نسبيًا بالانتقاء الطبيعي مقارنة بجينات ترميز البروتين (Perry and Ulitsky ، 2016 Ramos et al. ، 2016). إن ملاحظة أن غالبية الجينوم قد تم نسخه يدعو وظيفة هذه النصوص إلى التشكيك (بيرني وآخرون ، 2007). ومع ذلك ، يتم التعبير عن ما يقرب من 1000 lncRNAs بشكل معتدل إلى مرتفع في البشر وتظهر علامات على القيد التطوري ، مما يشير بقوة إلى أنها وظيفية (هيزروني وآخرون ، 2015).علاوة على ذلك ، هناك تلميحات إلى أن هذه الوظيفة يمكن أن تكون مهمة لنمو الدماغ ، حيث أن 40 ٪ من lncRNAs مع تعبير خاص بالأنسجة تأتي من الدماغ ، وهي من بين أكثر lncRNAs المعبر عنها تفاضليًا (Derrien et al. ، 2012). بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن lncRNA ديناميكيًا بطريقة خاصة بمنطقة الدماغ أثناء نمو الدماغ والتمايز بين الأسلاف العصبية (Aprea et al.، 2013 Mercer et al.، 2008 Ramos et al.، 2013).

هناك ثلاث فئات عامة مقترحة لآليات العمل بواسطة lncRNAs: القمع الناجم عن النسخ ، رابطة الدول المستقلة-، و عبرالتمثيل lncRNAs (الشكل 27.4 ب ، ج). غالبًا ما يتم تمييز الأجزاء الأخيرة من المناطق المنسوخة من الجينوم بواسطة H3K36me3 للقمع ، على الأرجح لتقليل النسخ خارج الرحم في اتجاه مجرى المروج الجيني الذي قد يتداخل مع التعبير أو وظيفة الجين. بهذه الطريقة ، قد يؤدي lncRNA الذي يتداخل مع المروج إلى قمع هذا المروج (Carrozza et al. ، 2005 Fang et al. ، 2010 Wagner and Carpenter ، 2012). في هذه الحالة ، يكون نسخ الموضع وليس lncRNA نفسه مهمًا وظيفيًا. ومع ذلك ، يبدو أن آلية العمل الأساسية لـ lncRNAs مرتبطة بالعامل إما في موقع نسخها أو في المناطق القريبة من الحمض النووي (Kotake et al. ، 2011 Monnier et al. ، 2013 Nagano et al. ، 2008 Wang وآخرون ، 2011 Yang et al. ، 2014 ياب وآخرون ، 2010). يمكن لعامل الربط إما نقله إلى موضعه المستهدف (Sigova et al. ، 2015) أو عزله بعيدًا (Krawczyk and Emerson ، 2014). بالإضافة إلى رابطة الدول المستقلة التأثيرات ، تم اقتراح lncRNAs للعمل فيها عبر لتجنيد البروتينات المعدلة للكروماتين لتسلسلات مستهدفة محددة ، على غرار TFs (Koziol and Rinn ، 2010) ، لكن الآلية الجزيئية للتعرف على التسلسل غير معروفة ، وهناك جدل حول ما إذا كانت الوفرة المنخفضة نموذجيًا للـ lncRNAs يمكن أن تعمل بكفاءة على المواقع في عبر بسبب مخاوف متكافئة (بيري وأوليتسكي ، 2016). عبر- قد يكون لتفاعل lncRNAs أدوار أكثر أهمية في الحفاظ على البنية النووية (Batista and Chang ، 2013) وفي تنظيم الترجمة في السيتوبلازم (Lee and Bartolomei، 2013 Memczak et al.، 2013 Tichon et al.، 2016).

بغض النظر عن الآلية ، يبدو أن بعض الحمض النووي الريبي النووي الريبي (lncRNAs) يلعب دورًا حيويًا في نمو الدماغ ويساهم في مسببات أمراض النمو العصبي. خطر هو lncRNA أساسي يتم التعبير عنه في الخلايا الجذعية العصبية والدماغ البالغ. خطر تظهر الفئران KO سوء تنظيم جينات دورة الخلية المهمة لتمايز السلف العصبي ويموت نصف هذه الفئران بعد يومين إلى 20 يومًا من الولادة (جوف وآخرون ، 2015 Sauvageau وآخرون ، 2013). ومع ذلك ، فإن التعبير عن Sox2، أقرب جين إلى خطر وعامل تعدد القدرات الحرج لم يتأثر (Sauvageau وآخرون ، 2013). Evf2 هو lncRNA يقع بين ملف dlx5 و دلكس 6 الجينات ، وهما TFs مهمان لتطوير الخلايا العصبية في الدماغ الأمامي ، و Evf2 ينظم النص التعبير عن هذه TFs جزئيًا عن طريق تعديل مثيلة لـ دي إل إكس 5/6 مُحسِّن (Berghoff et al. ، 2013 Bond et al. ، 2009). Evf2 خفضت الفئران KO عدد الخلايا العصبية GABAergic في قرن آمون بعد الولادة بفترة وجيزة والعجز المستمر في تثبيط التشابك عند البالغين (Bond et al. ، 2009). LncND هو lncRNA الذي اكتسب في الرئيسيات النزلية (قرود العالم القديم ، القردة ، والبشر) 16 عنصر استجابة ميرنا تربط وتثبط بشكل تنافسي عمل ميرنا المتورط في تكاثر الخلايا الدبقية الشعاعية والتمايز (راني وآخرون ، 2016). من المحتمل أن يكون تثبيط عمل هذا الميرنا ، الذي يؤدي إلى توسع تجمع السلف العصبي ، أحد أسباب تضخم القشرة الدماغية في هذه الرئيسيات. أخيرًا ، هناك أدلة من دراسات متعددة على تورط lncRNAs في SCZ ، وتأخر النمو ، و ASD (Barry et al.، 2014 Meng et al.، 2018 Millar et al.، 2004 Talkowski et al.، 2012 Ziats and Rennert، 2014).


نتائج

تحديد lncRNA973 في القطن

تتعلق دراستنا السابقة بـ lncRNA المرتبط بالملح ، lncRNA973 [31] ، والذي تم اختياره لمزيد من التحليلات. تم تحديده على أنه lncRNA حاسة بين الجينات ، بين الجينات Gh_D04G0659 و Gh_D04G0660. يبدو أنه منسوخ من RNA Pol II ، ويحتوي على 3 نهاية متعدد الأدينيلات. قمنا بتحليل بنية lncRNA973 ، الذي يحتوي على إنترونات وإكسونات (الشكل 1 أ) ، على غرار mRNA. بالإضافة إلى ذلك ، كان lncRNA973 موجودًا على سلسلة الإحساس للكروموسوم 4 في جينوم D وله نسختان (lncRNA973 X1 و lncRNA973 X2). كانت المنطقة الجينومية المقابلة

3.2 كيلو بايت ، مع lncRNA973 X1 و lncRNA973 X2 يجري 2134 نقطة أساس و 2888 نقطة أساس في الطول ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، lncRNA973 X2 كان exon أطول من lncRNA973 X1 لذلك ، فإن الاشعال للكشف عن التعبير عن lncRNA973 X2 تم تصميم البرايمرات لهذا exon ، وتم تصميمها في موقع exon هذا لتمييزها عن lncRNA973 X1. مستويات التعبير عن lncRNA973 X1 و X2 في الجذع والجذر والنبتة باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) ، ومستويات التعبير عن lncRNA973 X1 في الجذور والنبتات كانت أعلى نسبيًا ، بينما كانت تلك الموجودة في lncRNA973 X2 كانت أقل نسبيًا في هذه الأنسجة (الشكل 1 ب). بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا أيضًا مستويات التعبير عن نسختين من lncRNA973 في أوراق القطن الحقيقية المعالجة بـ NaCl (250 مليمول / لتر) في نقاط زمنية مختلفة (0 ، 1 ، 3 ، 6 ، 12 و 24 ساعة). التعبير عن lncRNA 973 X1 بلغ ذروته في 6 و 24 ساعة ، بينما التعبير عن lncRNA973 X2 كانت منخفضة في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 1 ج). وهكذا ، اخترنا lncRNA973 X1 لمزيد من الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تحليل حفظ التسلسل. مثل العديد من lncRNAs الأخرى ، لا يحتوي lncRNA973 على متماثلات في النباتات الأخرى. للتحقيق في أصل lncRNA973 ، قمنا بتحليل تطوره وتماثله في الأنواع الأخرى ووجدنا أنه جين جديد نشأ أساسًا من ج. ريموندي. محاذاة التسلسل في G. هيرسوتوم لم يكشف عن أي مناطق متماثلة على الكروموسوم 4 من جينوم A ، وهو ما يتوافق مع أصله التطوري.

خصائص lncRNA973. أ. رسم تخطيطي لموقع lncRNA973 في كروموسوم. تظهر المربعات الصفراء exon لـ lncRNA973. أشار P1 و P2 إلى البادئات المستخدمة في qRT-PCR للكشف عن مستوى التعبير عن lncRNA973 X1 و lncRNA973 X2، على التوالى. ب. مستويات التعبير لنصوص lncRNA973 في جذع القطن والجذر والنبتة ، التي يحددها qPCR. ج. مستويات التعبير عن lncRNA973 X1 و X2 في أوراق القطن الحقيقية المعالجة بـ 250 ملي مول كلوريد الصوديوم في نقاط زمنية مختلفة ، يحددها qPCR. تم تطبيع مستوى التعبير lncRNA973 بواسطة ملف غب Q7 مستوى التعبير. تم تعيين مستويات التعبير النسبي لـ lncRNA973 في الجذع و NaCl-0 h بقيمة 1 ، على التوالي. تشير أشرطة الخطأ إلى ± SD لثلاث مكررات بيولوجية ، مع قياس كل منها في ثلاث نسخ. تظهر العينات المميزة بأحرف مختلفة اختلافًا كبيرًا في ص & lt 0.05. د. تحليل إمكانات الترميز لـ lncRNA973. تم إنشاء الدرجات المحتملة للترميز باستخدام برنامج CPC. PHO2 و GhActin يتم توفيرها كأمثلة على الترميز ، هواء بارد و زيست تمثل أمثلة غير مشفرة

كشف تحليل المعلوماتية الحيوية (http://cpc.cbi.pku.edu.cn/) أن lncRNA973 ليس لديه قدرة تشفير (الشكل 1 د). تم استخدام أداة ORF Finder عبر الإنترنت للتنبؤ بخمسة ORFs على lncRNA973 X1 (ملف إضافي 1: الشكل S1a) ، والتي تراوحت بين 29 إلى 107 من الأحماض الأمينية. علاوة على ذلك ، وفقًا لبحوث التماثل لعائلات البروتين الكبيرة وقواعد بيانات المجال (Pfam و SMART ، على التوالي) ، لم يتم العثور على مجالات وظيفية تطابق أي من الببتيدات.

التوطين الخلوي لـ lncRNA973

ترتبط وظيفة lncRNAs بتوطينها دون الخلوي [32]. للتحقيق في التوطين الخلوي لـ lncRNA973 ، تم إجراء مضان في التهجين في الموقع في الجذور باستخدام مسبار مزدوج يسمى DIG خاص بـ lncRNA973. لتأكيد التوطين الخلوي لـ lncRNA973 ، كانت النوى ملطخة بـ DAPI ، و mRNA التدبير المنزلي (غب Q7) كعنصر تحكم إيجابي. بالنسبة إلى lncRNA973 و غب Q7 المجسات ، تم إجراء تحليل خصوصية التسلسل في جينوم القطن ، وتم اختيار مجسات محددة للتهجين. يمكن رؤية إشارة التألق لـ lncRNA973 بشكل رئيسي في نوى الخلايا الجذرية التي تم تهجينها باستخدام المسبار المسمى DIG ، وكانت أيضًا إشارات ضعيفة في السيتوبلازم (الشكل 2). إشارة التألق للتحكم الإيجابي غب Q7 يمكن رؤيتها في النوى والسيتوبلازم. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا أيضًا بعزل وتنقية الحمض النووي الريبي من السيتوبلازم والنواة ، على التوالي ، واستخدمنا في RT-PCR. U6 تم التعبير عنها بشكل رئيسي في النواة ، بينما تم التعبير عن الحمض النووي الريبي بشكل رئيسي في السيتوبلازم. وهكذا ، كان فصل النوى عن السيتوبلازم متميزًا. أظهرت نتيجة RT-PCR أن lncRNA973 كان غنيًا بدرجة عالية في النوى (ملف إضافي 1: الشكل S1b). أشارت هذه البيانات إلى أن نصوص lncRNA973 كانت مترجمة بشكل رئيسي في النوى ولها إشارة قليلة في السيتوبلازم.

التوطين الخلوي لـ lncRNA973. تم إجراء تهجين في الموقع باستخدام مجسات lncRNA973 المضادة للتأثير المسمى DIG في جذور قطنية عمرها 10 د. A التدبير المنزلي مرنا (غب Q7) كعنصر تحكم إيجابي. شريط = 20 ميكرومتر

يزيد التعبير المفرط عن lncRNA973 من استجابات الإجهاد الملحي في أرابيدوبسيس

لتحديد دور lncRNA973 في استجابات النبات لإجهاد الملح ، تم استنساخ الطول الكامل لنسخة lncRNA973 (ملف إضافي 2: الشكل S2a) ، ناقل التعبير المفرط الذي يحتوي على محفز بروتين يوبيكويتين Ubi (ملف إضافي 2: الشكل S2b) ، ثم أغروباكتريوم توميفاسيانز (GV3101) بوساطة التحول من النوع البري (WT) أرابيدوبسيس تم تنفيذ (Col-0 ecotype). تم الحصول على خمسة خطوط معدلة وراثيًا مستقلة ، وتم اختيار ثلاثة تعبيرات مفرطة (OX-) (OX-lncRNA973–2 و OX-lncRNA973–3 و OX-lncRNA973-5) لمزيد من الدراسة (ملف إضافي 2: الشكل S2c). لم تكن الخطوط المعدلة وراثيا مختلفة ظاهريا عن السيطرة عند عدم معالجتها. تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي للتحقق من تعبير نسخة lncRNA973 في المعدلة وراثيا أرابيدوبسيس. كانت مستويات التعبير عن lncRNA973 في النباتات المعدلة وراثيًا أكبر بكثير منها في WT (ملف إضافي 2: الشكل S2d). للتحقيق في قدرة النباتات المعدلة وراثيًا على تنظيم الاستجابات لإجهاد الملح ، والنوع البري (WT) والمعدّل وراثيًا أرابيدوبسيس تم وضع البذور (OX-lncRNA973) على وسط صلب 1/2 MS مكمل بـ 0 ملي مولار ، 100 ملي مولار و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. ثم حددنا معدلات إنبات البذور المعالجة بتركيزات ملح مختلفة من 1 إلى 7 أيام والأنماط الظاهرية بعد إنبات البذور. لم تعرض خطوط OX-lncRNA973 أي أنماط ظاهرية غير طبيعية في ظل الظروف العادية (0 مم). أدت معدلات إنبات سلالات OX-lncRNA973 التي نمت في ظل ظروف طبيعية (0 ملي مولار) إلى عدم وجود أنماط ظاهرية غير طبيعية مقارنة بتلك الموجودة في WT (الشكل 3 أ). في 3 أيام بعد العلاج بـ 100 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، كانت معدلات إنبات البذور لخطوط OX-lncRNA973 تتراوح من 55 إلى 60٪ وهي أكبر من تلك الخاصة بـ WT. في معالجة الملح لمدة 7 أيام ، كان متوسط ​​معدل إنبات البذور لخطوط OX-lncRNA973 هو

95٪ ، والتي كانت أعلى من تلك الخاصة بـ WT (

80٪) (الشكل 3 ب). بالإضافة إلى ذلك ، تغيرت الأوزان الطازجة وأطوال الجذور وخضرة الفلقة لخطوط WT و OX-lncRNA973 في ظل ظروف معالجة كلوريد الصوديوم. كما أدى التعرض إلى 100-150 ملي مول كلوريد الصوديوم إلى تثبيط تخضير الفلقة في شتلات OX-lncRNA973 ، لكن التأثير كان أقل حدة منه في WT (الشكل 3 ج). كان لشتلات OX-lncRNA973 أوزان طازجة أكبر من مجموعة التحكم (الشكل 3 ج). تم تثبيط استطالة الجذر بشكل كبير بواسطة 100-150 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، بينما كانت شتلات OX-lncRNA973 تتمتع بمستويات تحمل أكبر للإجهاد الملحي كما يتضح من نمو الجذر (الشكل 3 هـ-و). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بفحص العديد من المؤشرات الفسيولوجية لمناقشة تحمل نباتات OX-lncRNA973 مع إجهاد الملوحة ، على سبيل المثال ، malondialdehyde (MDA) ، البرولين (Pro) ، محتوى الكلوروفيل ونشاط الكاتلاز (CAT). في ظل ظروف النمو العادية ، كانت محتويات الكلوروفيل و MDA و Pro ونشاط CAT في خطوط WT و OX-lncRNA973 متشابهة. ومع ذلك ، بعد المعالجة بـ 200 ملي مول كلوريد الصوديوم ، انخفض محتوى الكلوروفيل الكلي ، وانخفض محتوى الكلوروفيل في نباتات WT أكثر من نباتات OX-lncRNA973 (الشكل 3g). تم رفع محتويات MDA والبرولين في كل من نباتات WT و OX-lncRNA973 ، وزادت نباتات WT أكثر من نباتات OX-lncRNA973 (الشكل 3h-i). تم تثبيط نشاط CAT لنباتات WT بعد المعالجة بـ NaCl ، وكان نشاط CAT لنباتات OX-lncRNA973 أعلى (الشكل 3 ي). لذلك ، أظهر تحليل النمط الظاهري والمؤشرات الفسيولوجية لنباتات WT و OX-lncRNA973 أن نباتات OX-lncRNA973 كانت أكثر تحملاً للإجهاد الملحي من نباتات التحكم.

الإفراط في التعبير عن خطوط lncRNA973 أكثر تحملاً لإجهاد الملح. أ-ب. تم إنبات البذور على وسط MS MS يحتوي على 0 و 100 ملي كلوريد الصوديوم. تم قياس معدلات الإنبات خلال أسبوع واحد. ج-ه. تخضير الفلقة ، والأوزان الطازجة واستطالة الجذر الأولي للشتلات التي يبلغ عمرها 7 د مع 0-150 ملي كلوريد الصوديوم. F. النمط الظاهري لنمو الجذر الأولي لشتلات عمرها 7 د معرضة لـ 0-150 ملي مول كلوريد الصوديوم. ز-أنا. إجمالي محتويات الكلوروفيل و MDA و Pro في الأوراق تحت ضغط الملح. ي. أنشطة الكاتلاز (CAT) بعد العلاج بالملح والزخارف. وهمية مع معالجة المياه. كلوريد الصوديوم: 200 ملي كلوريد الصوديوم العلاج. تمثل القضبان العمودية ± SD للمتوسط ​​بثلاث مكررات. تشير العلامات النجمية إلى أن القيم المتوسطة تختلف اختلافًا كبيرًا بين النباتات المعدلة وراثيًا و WT (ص & lt 0.05)

يؤدي إسكات lncRNA973 إلى القابلية للإجهاد الملحي

لمزيد من استكشاف الأدوار المحتملة لـ lncRNA973 في مقاومة القطن ضد إجهاد الملح ، قمنا بإسكات lncRNA973 في G. هيرسوتوم "SN91–11" باستخدام إسكات الجينات الناجم عن الفيروسات (VIGS) ، والذي يستخدم كثيرًا لتحليل وظائف الجينات. تسلسل VIGS من lncRNA973 و CLOROPLASTOS ALTERADOS 1 (CLA1) تم استنساخ الجينات بشكل مستقل في ناقل TRV2 (الشكل 4 أ) ، مما أدى إلى إنتاج TRV2: lncRNA973 و TRV2:CLA1، على التوالى. TRV2:CLA1 تم استخدام ناقل TRV2 الفارغ (TRV2) كعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي. ما يقرب من 490 نقطة أساس جزء من lncRNA973 و 465 نقطة أساس من CLA1 تم استخدامها في نظام VIGS. في حوالي أسبوعين بعد التسلل ، فإن الجين الواسم TRV2:CLA1- بدأت النباتات المحتوية في إظهار النمط الظاهري للألبينو في أوراقها الحقيقية (الشكل 4 ج). تم تقييم مستويات التعبير عن lncRNA973 في TRV2: lncRNA973- (VIGS) ونباتات القطن المحتوية على TRV2 (ناقل فارغ) باستخدام qRT-PCR. كما هو مبين في الشكل 4 ب ، أظهر الانخفاض الشديد في التعبير عن lncRNA973 في نباتات VIGS أنه قد تم التخلص منه بنجاح. لم يتأثر تعبير الجين المجاور lncRNA973 Gh_D04G0660 في الجينوم بشكل كبير (ملف إضافي 3: الشكل S3). اخترنا اثنين من مصانع VIGS ومحطة TRV2 (التحكم الفارغ) لمعالجة الإجهاد الملحي. تم ري النباتات بـ 250 ملي مول كلوريد الصوديوم ، وعند 3 أيام بعد معالجة الملح ، أظهرت نباتات VIGS أنماطًا ذبولًا وتساقط أوراق أكثر شدة من نباتات التحكم ، وكانت السيقان المجففة لنبات VIGS بنية شديدة ، في حين أن سيقان TRV2 كانت النباتات لا تزال خضراء (الشكل 4 ج). وبالتالي ، كانت خطوط VIGS شديدة الحساسية لظروف الإجهاد الملحي.

تحديد وظيفي لـ lncRNA973 تجاه الإجهاد الملحي باستخدام طريقة إسكات الجينات التي يسببها الفيروس (VIGS). أ. بناء TRV2:GhCLA1 وناقلات lncRNA973 VIGS. NOS ، تستخدم لاختيار المقاومة. ب. مستويات نسخ lncRNA973 النسبية في أوراق TRV2: lncRNA973 ونباتات التحكم (TRV2: 00). غب Q7 تم استخدامه كعنصر تحكم داخلي. تمثل كل قيمة شريطية متوسط ​​± SD لثلاث تجارب مستقلة. ج. الأنماط الظاهرية لنباتات lncRNA973 الصامتة في معالجة الملح ثلاثية الأبعاد ، والتي تُظهر النمط الظاهري الذبول ، والأوراق المهتزة. موك: يعني سكب نفس الكمية من الماء. إسكات الذاتية كلوروبلاستوس ألترادوس 1 (CLA1) في القطن من خلال VIGS بوساطة TRV كعنصر تحكم إيجابي. شتلات قطنية عمرها 10 د (G. هيرسوتوم L. ، السيرة الذاتية. SN91-11) مع فلقتين تم اختراقهما بـ TRV2:CLA1، وبدأت النباتات في عرض النمط الظاهري للألبينو في أوراقها الحقيقية بعد أسبوعين تقريبًا. د-و. MDA والماء النسبي ومحتويات Pro في الأوراق تحت ضغط الملح. ز-ط. أنشطة إنزيمات الكسب ROS بعد العلاج بالملح: ز: الكاتلاز (CAT)، ح: ديسموتاز الفائق (SOD) ، أنا: بيروكسيداز (POD) ، على التوالي. ي-ل. تراكم الصوديوم (Na +) والبوتاسيوم (K +) ونسبة K + / Na + في TRV2: 00 ونباتات TRV2: lncRNA973 تحت الماء وحالة كلوريد الصوديوم. وهمية مع معالجة المياه. كلوريد الصوديوم: 250 ملي كلوريد الصوديوم العلاج. * ، ص & lt 0.05 و ** ، ص & lt 0.01 بواسطة Student’s ر-اختبار مقارنة مع شتلات TRV2 غير المعالجة (Mock) أو المعالجة بالملح. البيانات تمثل يعني ± SD

بالإضافة إلى ذلك ، لفحص تحمل قطن VIGS لإجهاد الملوحة ، قمنا بفحص بعض المؤشرات الفسيولوجية ، مثل MDA ، ومحتوى Pro ، ومحتوى الماء النسبي ، ونشاط إنزيم ROS-scavning ومحتويات Na + و K +. لم تكن هناك فروق في المؤشرات الفسيولوجية بين نباتات VIGS و TRV2 في ظل ظروف النمو العادية. كان محتوى MDA ، وهو مؤشر على الإجهاد التأكسدي ، أكبر بشكل ملحوظ في نباتات VIGS منه في نباتات TRV2 تحت ظروف الإجهاد الملحي (الشكل 4 د). يعد المحتوى المائي المؤيد والنسبي مؤشرين مهمين لمقاومة الإجهاد. تمت زيادة تراكم Pro في كل من نباتات TRV2 و VIGS المعالجة بالملح ، لكن التراكم كان أكثر أهمية في نباتات VIGS (الشكل 4 هـ). كان محتوى الماء النسبي في نباتات VIGS أقل بكثير من نباتات TRV2 تحت ظروف الإجهاد الملحي ، مما يشير إلى أن فقد الماء في نباتات VIGS كان أكبر ، والذي كان متسقًا مع النمط الظاهري (الشكل 4f).

تلعب أنشطة إنزيمات الكسح ROS ، مثل ديسموتاز الفائق (SOD) ، والبيروكسيديز (POD) والكاتلاز (CAT) ، أدوارًا مهمة في استجابات الإجهاد للشدائد. انخفضت أنشطة إنزيمات الكسح ROS في كل من نباتات TRV2 و VIGS المعالجة بالملح ، ومع ذلك ، أظهر قطن VIGS انخفاضًا أكثر أهمية مقارنة بنباتات TRV2 (الشكل 4g). الصوديوم الزائد سام للنباتات ، في حين أن K + مضاد لـ Na + تحت ظروف إجهاد الملح [33]. لم تكن هناك فروق في تركيزات الصوديوم والبوتاسيوم في محطات TRV2 و VIGS في ظل الظروف العادية. ومع ذلك ، عند التعرض لضغط الملح ، تراكمت نباتات VIGS أكثر من Na + على العكس ، كان تركيز Na أقل في نباتات TRV2 مقارنة بنباتات VIGS (الشكل 4 ح).تم تحديد مستويات أقل من K + في نباتات VIGS ومستويات أعلى في نباتات TRV2 (الشكل 4i). أدى عدم التوازن بين مستويات الصوديوم والبوتاسيوم إلى انخفاض في نسبة البوتاسيوم / الصوديوم في نباتات VIGS (الشكل 4 ي). بالإضافة إلى ذلك ، اكتشفنا أيضًا محتوى الكلوروفيل و MDA والبرولين ونشاط CAT لشتلات القطن WT في نفس فترة النمو دون ناقلات VIGS المحقونة (ملف إضافي 4: الشكل S4) ، ووجدنا أن المؤشرات الفسيولوجية لم تكن مختلفة بشكل كبير في شتلات القطن WT ونباتات TRV2 ، وبالتالي استبعاد تأثير ناقلات الفيروس. أشارت هذه النتائج إلى أن إسكات lncRNA973 في القطن زاد من محتويات MDA و Pro ، ويقلل من محتوى الماء النسبي وأنشطة إنزيم الكسح ROS. بالإضافة إلى ذلك ، فقد شجعت على تصدير K + وتدفق Na + الداخلي ، مما أدى إلى عدم توازن محتويات K + و Na + ، وتقليل تحمل الملح لمصانع VIGS. وهكذا ، كانت نباتات ضربة قاضية lncRNA973 حساسة للإجهاد الملحي ، وكشفت أن lncRNA973 يمكن أن تستجيب لإجهاد الملح من خلال تنظيم تراكم بعض المؤشرات الفسيولوجية ذات الصلة.

ينظم LncRNA973 التعبير عن الجينات المشاركة في استجابة الإجهاد الملحي في القطن

بناءً على بيانات النسخ السابقة ، تم حساب علاقة التعبير المشترك والطاقة الحرة الملزمة بين lncRNA973 وجينات الترميز بواسطة RNAplex للتنبؤ بجينات التعبير المشترك ، والتي تضمنت عوامل النسخ والجينات المرتبطة بالإجهاد (ملف إضافي 6: الجدول S1). لتحليل الوظائف المحتملة لـ lncRNA973 ، اخترنا جينات ترميز البروتين مع معاملات التعبير المشترك أعلى من 0.95 مع lncRNA973 للتحليل. لمزيد من التحقق من صحة التعبير عن الجينات المعروفة الحاسمة لاستجابات إجهاد الملح في النبات ، تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أوراق شتلات الإجهاد الملحي TRV2 و VIGS وأوراق الشتلات غير المعالجة ، ثم تحليلها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. انخفضت مستويات التعبير عن أكاسيدازات الجهاز التنفسي B (ROBHB) و D (ROBHD) ، وهما جينات NADPH أوكسيديز ، بأكثر من 30 و 50 ٪ ، على التوالي ، في نباتات VIGS المعالجة بالملح ، ومع ذلك ، لم تكن هناك تغييرات كبيرة في مستويات التعبير في غير المعالجة النباتات (الشكل 5 أ ، ب). التعبير المستحث عن Δ 1 -بيرولين -5-كربوكسيلات تخليق (P5CS) تحت ظروف الإجهاد الملحي يمكن أن يعزز تراكم برو [34]. التعبير عن P5CS، زيادة مضاعفة في نباتات VIGS المعالجة بالملح مقارنة بخطوط TRV2 (الشكل 5 ج). كانت هذه النتائج متوافقة مع نتائج مؤشر برو الفسيولوجي. قمنا كذلك بتقييم الجينات المرتبطة بأيون الصوديوم والبوتاسيوم استجابة لإجهاد الملح. مبادل هيدروجين الصوديوم 7 (NHX7) يشفر مضادًا للحامض Na + / H + فجوي مشارك في مقاومة الملح الذي يعمل في التبادل المحايد للإلكترون للبروتونات للكاتيونات ، مثل Na ، عبر غشاء البلازما [35]. NHX7 تم التعبير عنها بدرجة أكبر في نباتات VIGS مقارنة بنباتات TRV2 تحت ظروف الإجهاد الملحي (الشكل 5 د). استجابة للجفاف 22 (RD22) بواسطة إشارات حمض الأبسيسيك (ABA) المرتبطة باستجابات إجهاد الملح [36]. انخفض تعبيره أيضًا في نباتات VIGS المعالجة بالملح (الشكل 5 هـ). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتحليل مستويات التعبير عن الجينات المرتبطة بـ ROS ، SOD, جراب و قط. تم تثبيط مستويات تعبيرهم بشكل كبير في نباتات VIGS المعرضة لضغط الملح ولكنها زادت في النباتات الضابطة (الشكل 5f-h). في غضون ذلك ، قمنا بفحص مستويات التعبير عن الجينات المتماثلة لهذه الجينات في WT و OX-lncRNA973-2 / 5 أرابيدوبسيس النباتات. في ظل الظروف غير المعالجة ، كانت مستويات التعبير عن هذه الجينات المرتبطة بإجهاد الملح في نباتات OX-lncRNA973 مماثلة لتلك الموجودة في WT. أرابيدوبسيس (ملف إضافي 5: الشكل S5) ، باستثناء ذلك AtPOD أظهر الجين تعبيرًا منظمًا بشكل كبير. ومع ذلك ، زاد التعبير عن هذه الجينات في كل من نباتات WT و OX-lncRNA973 بعد إجهاد الملح. ال أتربوهب, AtRBOHD، AtPOD, أتكات, AtRD22, AtRD29A، و AtRD29B (ملف إضافي 5: الشكل S5a ، b ، f-j) كانت مستويات التعبير في نباتات OX-lncRNA973 أعلى بكثير من تلك الموجودة في WT بعد معالجة الملح ، خاصةً ، AtPOD, AtRD29A، و AtRD29B. التعبير عن AtP5CS1 و AtNHX7 في نباتات OX-lncRNA973 كانت أقل من تلك الموجودة في WT (ملف إضافي 5: الشكل S5c-d). أشارت هذه البيانات إلى أن lncRNA973 يمكن أن ينظم تحمل النبات للإجهاد الملحي عن طريق تعديل تعبير الجينات المشاركة في استجابات إجهاد الملح.

مستويات التعبير النسبي للجينات المختارة في شتلات القطن المعالجة بالملح. تم استخلاص الحمض النووي الريبي من أوراق شتلات القطن VIGS و TRV2 ، وتم قياس مستويات التعبير الجيني بواسطة RT-qPCR التي تم تطبيعها مقابل غب Q7 الجين. يتم عرض مستويات التعبير النسبي لـ أ. RBOHB, ب. RBOHD, ج. P5CS, د. NHX7, ه. RD22, F. SOD, ز. قط, ح. جراب, أنا. MYB5, ي. WRKY46, ك. NAC29, ل. ERF62. وهمية ، بدون معالجة الملح ، كلوريد الصوديوم: 250 ملي مول كلوريد الصوديوم. * ، ص & lt 0.05 و ** ، ص & lt 0.01 بواسطة Student’s ر-اختبار مقارنة مع شتلات TRV2 غير المعالجة (Mock) أو المعالجة بالملح. البيانات تمثل يعني ± SD

بالإضافة إلى ذلك ، قد تشارك عوامل النسخ في تنظيم lncRNA973. تتضمن عوامل النسخ هذه ، عوامل النسخ MYB5 و WRKY46 و NAC29 وعوامل النسخ المستجيبة للإيثيلين 62 (ERF62). كانت معاملات التعبير المشترك بين عوامل النسخ و lncRNA973 أكبر بشكل عام من 0.99 ، مما يشير إلى العلاقات التنظيمية المحتملة بينهما. تم استخدام RT-qPCR لاكتشاف التعبير عن عوامل النسخ هذه في النباتات المعالجة بالملح وغير المعالجة. كانت مستويات التعبير عن MYB5 و WRKY46 أقل في نباتات VIGS من نباتات التحكم في ظروف الإجهاد الملحي (الشكل 5i-j). تم التعبير عن NAC29 و ERF62 بدرجة عالية في النباتات المعالجة بالملح مقارنة بالنباتات غير المعالجة (الشكل 5 كيلو لتر). وبالمثل ، قمنا أيضًا بفحص مستويات التعبير عن الجينات المتماثلة لعوامل النسخ هذه في نباتات OX-lncRNA973 و WT ، ووجدنا أن عوامل النسخ AtERF و AtMYB5 لم تتغير بشكل كبير قبل العلاج وبعده (ملف إضافي 5: الشكل S5k-l) . زاد تعبير AtWRKY46 في نباتات OX-lncRNA973 المتنامية بشكل طبيعي ، ومن الواضح أنه تم تنظيمه في نباتات OX-lncRNA973 بعد معالجة الملح (ملف إضافي 5: الشكل S5 م). لم يتغير تعبير AtNAC3 في النباتات الطبيعية النامية. مقارنةً بـ WT ، تم تحفيز التعبير عن NAC3 في نباتات OX-lncRNA973 بشكل كبير بعد معالجة الملح ، وكان التعبير أعلى بكثير من WT (ملف إضافي 5: الشكل S5n). وهكذا ، يبدو أن lncRNA973 يستجيب لإجهاد الملح من خلال تنظيم جينات متعددة وآليات معقدة متعددة.

يؤثر LncRNA973 على miR399 وتعبير PHO2 المستهدف

سابقًا ، توقعنا أن lncRNA973 قد يكون له تأثير تنظيمي باستخدام miR399 [31]. تقع منطقة التفاعل بين lncRNA973 و miR399 في exon الثاني (الشكل 6 أ). هنا ، من أجل تحديد التأثير التنظيمي لـ lncRNA973 على miR399 ، تم اكتشاف miR399 وتعبير الجين المستهدف PHO2 في OX-lncRNA973 أرابيدوبسيس و TRV2: نباتات القطن lncRNA973 ، على التوالي. اكتشفنا تعبير ghr-miR399 في جذور شتلة القطن lncRNA973 بالضربة القاضية. عندما كانت كفاءة ضربة قاضية لـ lncRNA973 60٪ أو أكثر ، زاد مستوى التعبير ghr-miR399 بشكل ملحوظ ، بينما كان هدفه GhPHO2 تم منع التعبير بشكل كبير. وعندما كانت كفاءة الضربة القاضية أقل من 60٪ ، فإن ghr-miR399 و GhPHO2 لم تتأثر مستويات التعبير بشكل كبير (الشكل 6 ب). ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن lncRNA973 لم يثبط بشكل كبير التعبير عن ath-miR399 ، ولا التعبير عن في PHO2 تغيير كبير في OX-lncRNA973 أرابيدوبسيس نباتات (الشكل 6 ج). وهكذا ، ينظم lncRNA973 التعبير عن ghr-miR399 والجين المستهدف GhPHO2 في القطن ، بينما لا توجد علاقة بينهما أرابيدوبسيس.

مستويات التعبير النسبي لـ miRNA399 و lncRNA973 في شتلات VIGS و overexpression. أ. رسم تخطيطي لموقع التفاعل بين نسخة ghr-miR399 و lncRNA973. ب. مستويات تعبير lncRNA973 و ghr-miR399 و GhPHO2 في TRV2: 00 و TRV2: جذور شتلة القطن lncRNA973. ج. مستويات تعبير lncRNA973 و ath-miR399 و في PHO2 في مصانع WT و OX-lncRNA973. * ، ص & lt 0.05 و ** ، ص & lt 0.01 بواسطة Student’s ر-اختبار مقارنة مع محطات TRV2. البيانات تمثل يعني ± SD


مقدمة

ازداد معدل الإصابة بسرطان الجلد في جميع أنحاء العالم ، وهو أكثر أشكال سرطان الجلد عدوانية ، بسرعة في العقود الأخيرة. من المتوقع أن يصل عدد حالات سرطان الجلد الجديدة في الولايات المتحدة إلى 76380 ، مع 10130 حالة وفاة ، بحلول نهاية عام 2016 [1]. الورم الميلانيني الأولي (PM) قابل للشفاء عن طريق الجراحة. ومع ذلك ، إذا لم يتم اكتشافه مبكرًا وتم إزالته جراحيًا ، فمن المرجح جدًا أن ينتشر سرطان الجلد. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى تحديد الآليات التي تدفع كلاً من تكون الأورام والورم الخبيث وتطوير استراتيجيات جديدة وفعالة لعلاج سرطان الجلد.

RNAs الطويلة غير المشفرة (lncRNAs) ، التي يتجاوز طولها 200 نيوكليوتيد ، هي عبارة عن نسخ تشبه الرنا المرسال (mRNA) ولا تشفر البروتينات [2 ، 3]. على عكس microRNAs الأصغر ، التي تلعب أدوارًا حاسمة في التسرطن البشري ، فإن فهمنا للوظائف البيولوجية للـ lncRNA لا يزال في مهده. تم اكتشاف أول lncRNA وظيفي ، XIST ، في أوائل التسعينيات من القرن الماضي ، يعمل XIST على تعطيل التعبير الجيني من الكروموسوم X عن طريق معادلة الجرعة [4 ، 5]. أظهرت تقارير متعددة أن lncRNAs تنظم وظائف معقدة ومتنوعة ، بما في ذلك تعدد القدرات للخلايا الجذعية الجنينية [6] ، وتنظيم الجينات اللاجينية [7] ، واستجابة تلف الحمض النووي [8] ، وإعادة تشكيل الكروماتين [9]. علاوة على ذلك ، تشارك lncRNAs في عمليات خلوية واسعة النطاق ، بما في ذلك دورة الخلية ، والتكاثر ، والاستماتة ، والغزو [10].

مع ظهور الجيل التالي من التسلسل ، حددت المشاريع الكبيرة عدة lncRNAs التي تشارك في التسرطن وتطور السرطان [11 ، 12] ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي [13] ، وسرطان المبيض [14] ، وسرطان الخلايا الكبدية [15] ، وسرطان المعدة [ 16] وسرطان القولون والمستقيم (CRC) [17] تقترح هذه المعرفة إمكانيات مثيرة للاهتمام لتطبيقات lncRNA التشخيصية والعلاجية. ومع ذلك ، لا يُعرف الكثير عن وظائف lncRNA في تكوين الأورام الميلانينية والورم الخبيث. حددت دراسات متعددة وظائف عديدة للـ lncRNAs في الورم الميلانيني. قد يلعب تنظيم SPRY4-IT1 دورًا مهمًا في الورم الميلانيني ويكون علامة حيوية مبكرة مفيدة في البشر [18 ، 19]. تانغ وآخرون. [20] أظهر تعبير HOTAIR الزائد في نقائل العقدة الليمفاوية مقارنةً بـ PMs وأظهر دورًا نشطًا في حركة الخلايا وغزوها ، مما يسلط الضوء على HOTAIR كهدف محتمل لعلاج سرطان الجلد الخبيث. يرتبط الحمض النووي الريبي طويل الأمد غير المشفر بين الجينات ، CASC15 ، بتطور الورم الميلانيني ويشارك في تنظيم تبديل النمط الظاهري [21]. يعزز lncRNA آخر ، SLNCR1 ، غزو الورم الميلانيني عن طريق الارتباط بمستقبلات الأندروجين وبروتين المثلية الخاصة بالدماغ 3 أ [22]. ومع ذلك ، فإن الخصائص المنخفضة والحساسيات للـ lncRNAs تشير إلى أن هدفًا واحدًا من غير المحتمل أن يوضح بشكل كامل آليات lncRNA في الورم الميلاني. لم يتم بعد استكشاف الأدوار المحتملة للـ lncRNAs أثناء تكوين ورم الميلانوما والورم الخبيث بشكل كامل.

بدأنا دراستنا بتحليل ملفات تعريف التعبير الجيني للورم الميلانيني المنشورة مسبقًا من قاعدة بيانات Gene Expression Omnibus (GEO) وأجرينا تنميط lncRNA لتحديد lncRNAs المهمة. ثم تم التحقق من ملفات تعريف lncRNA المحددة باستخدام مجموعة تحقق مستقلة أخرى. تم بعد ذلك إجراء تحليل علم الوجود الجيني (GO) ، وتحليل مسار موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) ، وتحليل شبكة التعبير المشترك lncRNA-mRNA. أجرينا تحليل البقاء على أساس قاعدة بيانات TCGA. قد تكشف النتائج التي توصلنا إليها عن ملفات تعريف التعبير lncRNA و mRNA المحتملة المرتبطة بتطور الورم الميلانيني والورم الخبيث وتوفر رؤى جديدة في التسبب الجزيئي للورم الميلانيني.


دور RNA PCA3 طويل الأمد غير المشفر في تطور ورم سرطان المبيض الظهاري

أهداف: يعتبر سرطان المبيض من أعلى معدلات الإصابة بالأورام لدى النساء ، ولا يزال تكوين سرطان المبيض الظهاري (EOC) وتطوره والتنبؤ به مجالًا مفتوحًا للدراسة. يعد دور الحمض النووي الريبي طويل الأمد غير المشفر (lncRNAs) في سرطان المبيض الظهاري مجالًا ناشئًا للبحث.

المواد والأساليب: تم تحديد تعبير LncRNA PCA3 في EOC وأنسجة المبيض الطبيعية بواسطة RT-PCR. تم تحليل الأنماط الظاهرية التي تشير إلى تطور الورم وعدوانيته ، بما في ذلك تكاثر الخلايا ، والهجرة ، والغزو ، والتعبير عن الجزيئات ذات الصلة ، في خلية EOC بعد ضربة قاضية لـ lncRNA PCA3 عن طريق تعداء مع RNA صغير متداخل (سيرنا).

نتائج: كان التعبير عن lncRNA PCA3 في أنسجة سرطان المبيض الظهارية أعلى من أنسجة المبيض الطبيعية. اكتشفنا أن ضربة قاضية لـ lncRNA PCA3 في خلايا EOC عن طريق تعداء siRNA قمعت بشكل كبير تكاثر الخلايا ، والهجرة ، والغزو. تشير تنبؤات المعلومات الحيوية وفحوصات مراسل لوسيفيراز المزدوج إلى أن 3'UTR من PCA3 لها مواقع ربط محتملة لـ miR-106b-5p. أدت ضربة قاضية لـ lncRNA PCA3 بواسطة siRNA إلى تعبير miR-106b منظم. بالإضافة إلى ذلك ، أدت ضربة قاضية لـ PCA3 أيضًا إلى تقليل التعبير البروتيني لعضو عائلة جينات Ras homolog C (RhoC) و Bcl / xl و P70 ribosomal S6 كيناز (P70S6K) و Matrix metallopeptidase 2 (MMP2) ، والتي يتم تنظيمها بواسطة miR-106b.

الاستنتاجات: تظهر نتائج البحث أن lncRNA PCA3 قد ينسق تكوين الأورام EOC من خلال تعطيل التعبير الجيني المنظم miR-106b. قد يكون PCA3 علامة بيولوجية تشخيصية جديدة ومهمة وعلامة قيمة للتنبؤ في الرعاية السريرية لسرطان المبيض الظهاري.

الكلمات الدالة: سرطان المبيض الظهاري LncRNA PCA3 تقدم الأورام.


شاهد الفيديو: كيف يتم نسخ الاحماض النووية الريبوزية mRNA - rRNA - tRNA وما اهميتها (أغسطس 2022).