معلومة

كيف يمكن الاحتفاظ بالأجسام المضادة في اختبارات الأجسام المضادة السريعة في درجة حرارة الغرفة دون تغيير طبيعة الجسم؟

كيف يمكن الاحتفاظ بالأجسام المضادة في اختبارات الأجسام المضادة السريعة في درجة حرارة الغرفة دون تغيير طبيعة الجسم؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تبلغ درجة الحرارة الطبيعية لتخزين الأجسام المضادة على المدى الطويل حوالي -20 درجة مئوية. ومع ذلك ، عند تطويرها إلى اختبارات الأجسام المضادة السريعة ، يمكن الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة. كيف يعقل ذلك؟


لا تواجه الأجسام المضادة مشكلة في درجة حرارة الغرفة. بطبيعة الحال ، تتوقع الأجسام المضادة البقاء على قيد الحياة لعدة أيام أو أسابيع عند درجة حرارة الجسم ، وهي أعلى بكثير من درجة حرارة الغرفة (على الأقل ، أنا كذلك).

يُنصح باستخدام -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد (عدة أشهر أو سنوات) من الأجسام المضادة ، لكنها عادةً بروتينات مستقرة جدًا ولا تتعطل بسهولة على الإطلاق. يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة - بالتأكيد أسابيع ، من واقع خبرتي ، مع القلق الحقيقي الوحيد هو إمكانية نمو البكتيريا أو الفطريات إذا لم تكن الأجسام المضادة معقمة.


دليل تخزين الجسم المضاد

يرجى دائمًا التحقق من أوراق البيانات للحصول على توصيات تخزين محددة. لا يمكننا ضمان عدم تخزين الأجسام المضادة بشكل صحيح. مع التخزين والتداول المناسبين ، يجب أن تحتفظ معظم الأجسام المضادة بالنشاط لأشهر ، إن لم يكن لسنوات.

يمكنك أيضًا الوصول إلى البروتوكولات الأكثر شيوعًا الخاصة بنا مباشرةً من هاتفك باستخدام تطبيق Abcam ، والذي يتميز بالبروتوكولات والدعم العلمي ومجموعة من الأدوات المفيدة التي يسهل استخدامها لأي عالم مقاعد البدلاء. يتعلم أكثر.

درجات حرارة التخزين

بالنسبة للعديد من أجسامنا المضادة ، فإن التجميد عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية في أجزاء صغيرة هو حالة التخزين المثلى. يقلل Aliquotting الضرر الناجم عن التجميد والذوبان ، فضلاً عن التلوث الناتج عن الماص من قنينة واحدة عدة مرات. يجب تجميد القسامات وإذابتها مرة واحدة ، مع الاحتفاظ بالباقي عند 4 درجات مئوية.

عند تلقي الجسم المضاد ، تقوم أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 20 ثانية بسحب المحلول المحاصر في خيوط القارورة ، ونقل القسامات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة البروتين. سيعتمد حجم القسامات على المقدار الذي تستخدمه عادةً في التجربة. يجب ألا تقل القسمة عن 10 ميكرولتر كلما كانت القسمة أصغر ، كلما تأثر تركيز المخزون بالتبخر وامتصاص الجسم المضاد على سطح قارورة التخزين.

في معظم الحالات ، يُسمح بالتخزين عند 4 درجات مئوية عند استلام الجسم المضاد لمدة أسبوع إلى أسبوعين. من المهم اتباع التوصيات الواردة في ورقة البيانات.

يجب عدم تجميد الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم على الإطلاق ، وبدلاً من ذلك يجب حفظها عند 4 درجات مئوية. سيقلل التجميد والذوبان من النشاط الأنزيمي بالإضافة إلى التأثير على قدرة ربط الجسم المضاد.

يجب تخزين الأجسام المضادة المقترنة - سواء كانت مترافقة مع الفلوروكرومات أو الإنزيمات أو البيوتين - في قوارير داكنة أو ملفوفة في رقائق معدنية. التعرض للضوء سيعرض نشاط الاتحادات للخطر. المقارنات الفلورية على وجه الخصوص عرضة للتبييض الضوئي ويجب حمايتها من الضوء خلال جميع مراحل التجربة.

تعتبر الأجسام المضادة لـ IgG3 فريدة من نوعها في ميلها لتكوين تكتلات عند الذوبان ويجب تخزينها دائمًا عند 4 درجات مئوية.

قد يحتوي سائل الاستسقاء على البروتياز ، ويجب تجميده في أقرب وقت ممكن بعد الاستلام.

تلوث

لمنع التلوث الجرثومي ، يمكن إضافة أزيد الصوديوم إلى مستحضر جسم مضاد لتركيز نهائي قدره 0.02٪ (وزن / حجم). تحتوي العديد من أجسامنا المضادة بالفعل على هذه المادة الحافظة بتركيزات تتراوح من 0.02 إلى 0.05٪. سيتم الإشارة إلى ذلك في أوراق البيانات في قسم المخزن المؤقت.

متى لا تستخدم أزيد الصوديوم

في حالة تلطيخ الخلايا الحية أو علاجها بأجسام مضادة ، أو إذا كنت تستخدم أجسامًا مضادة لإجراء دراسات في الجسم الحي ، فتأكد من استخدام المستحضرات التي لا تحتوي على أزيد الصوديوم. هذا العامل المضاد للميكروبات سام لمعظم الكائنات الحية الأخرى أيضًا: فهو يمنع نظام نقل الإلكترون السيتوكروم.

سيتداخل أزيد الصوديوم مع أي اقتران يتضمن مجموعة أمين ، ويجب إزالته قبل متابعة الاقتران. بعد الاقتران ، يمكن تخزين الأجسام المضادة في أزيد الصوديوم. الاستثناء هو الأجسام المضادة المرتبطة بـ HRP والتي لا ينبغي تخزينها في مخازن تحتوي على أزيد الصوديوم ، لأن نفس الشيء يثبط HRP. البديل المقبول هو 0.01٪ ثيميروسال (ميرثيولات) ، والذي لا يحتوي على أمين أولي.

يمكن إزالة أزيد الصوديوم من محاليل الأجسام المضادة عن طريق غسيل الكلى أو الترشيح الهلامي. الوزن الجزيئي لـ IgG هو 150000 دالتون (IgM هو

600000) الوزن الجزيئي لأزيد الصوديوم 65 دالتون. ستحتفظ وحدة غسيل الكلى الدقيقة بقطع 14000 دالتون بالجسم المضاد أثناء انتشار الأزيد.

في دورق على محرك مغناطيسي محفوظ عند 4 درجات مئوية ، استخدم على الأقل لترًا من PBS باردًا لكل مل من الجسم المضاد وحرك وحدة غسيل الكلى لمدة 6 ساعات. قم بتغيير برنامج تلفزيوني مرتين ، مع التحريك لمدة 6 ساعات على الأقل لكل تغيير. إذا أمكن ، يجب تعقيم جميع المواد ويجب التعامل مع المستحضر الناتج بطريقة معقمة.

تلف التجميد / الذوبان

يمكن لدورات التجميد / الذوبان المتكررة أن تفسد الجسم المضاد ، مما يتسبب في تكوين كتل تقلل من قدرته على الارتباط.

يجب أن يكون التخزين عند -20 درجة مئوية مناسبًا لمعظم الأجسام المضادة ، ولا توجد ميزة ملحوظة للتخزين عند -80 درجة مئوية. يجب ألا يكون الفريزر من النوع الخالي من الصقيع. هذه الدورة بين التجميد والذوبان (لتقليل تراكم الصقيع) ، وهو بالضبط ما يجب تجنبه. للسبب نفسه ، يجب وضع قوارير الأجسام المضادة في منطقة من الفريزر بها أدنى تقلبات في درجات الحرارة ، على سبيل المثال باتجاه الخلف بدلاً من رف الباب.

يضيف بعض الباحثين الجلسرين الواقي من التجمد إلى تركيز نهائي بنسبة 50٪ لمنع تلف التجميد / الذوبان ، سيخفض الجلسرين نقطة التجمد إلى أقل من -20 درجة مئوية. على الرغم من أن هذا قد يكون مقبولاً للعديد من الأجسام المضادة ، إلا أنه تم اختبار نسبة صغيرة فقط من الأجسام المضادة التي نقدمها للتأكد من ثباتها في حالة التخزين هذه ، ولا ينطبق ضماننا إلا على الأجسام المضادة المخزنة على النحو الموصى به في ورقة البيانات. لا ينصح بتخزين المحاليل المحتوية على الجلسرين عند -80 درجة مئوية لأن هذا أقل من نقطة تجمد الجلسرين. يرجى العلم أن الجلسرين يمكن أن يكون ملوثًا بالبكتيريا. في حالة إضافة الجلسرين أو أي مادة واقية من التجمد ، يجب توخي الحذر للحصول على مستحضر معقم.

تركيز البروتين وثباته

يجب تجنب تمييع الأجسام المضادة لتركيز العمل وتخزينها في 4 درجات مئوية لأكثر من يوم. تكون البروتينات بشكل عام أقل عرضة للتحلل عند تخزينها بتركيزات أعلى ، من الناحية المثالية 1 مجم / مل أو أعلى. هذا هو الأساس المنطقي لتضمين البروتينات مثل BSA إلى محلول الجسم المضاد كمثبتات. يعمل البروتين المضاف أيضًا على تقليل فقد الجسم المضاد بسبب الارتباط بجدار الوعاء الدموي. لا تضف بروتينًا مثبتًا إلى الأجسام المضادة التي تنوي اقترانها ، لأنها ستنافس الجسم المضاد وتقلل من كفاءة الاقتران.


مقدمة

يدخل فيروس كورونا 2 المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2) ، الذي تسبب في انتشار جائحة COVID-19 ، إلى الخلايا المستهدفة من خلال تفاعل البروتين المغلف مع الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 (ACE2). والتي يتم بعد ذلك شقها بواسطة بروتين سيرين (TMPRSS2) للسماح بالاندماج الفيروسي والدخول عبر غشاء الخلية 1. تمتلك الأجسام المضادة التي يمكن أن ترتبط ببروتين السنبلة القدرة على تحييد دخول الفيروس إلى الخلايا ويُعتقد أنها تلعب دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية الوقائية لعدوى السارس 2،3،4،5،6،7،8 ، 9،10،11.

للتنبؤ بالحماية من SARS-CoV-2 ، من الضروري فهم كمية ونوعية ومدة استجابة الجسم المضاد خلال المراحل المختلفة لـ COVID-19 وفي فترة النقاهة. في هذا الصدد ، يمكن أن يكون تقييم مستوى الأجسام المضادة المعادلة (NAbs) التي تمنع دخول الفيروس إلى الخلايا معلمة حاسمة في تحديد الحماية من SARS-CoV-2 وإدارة علاجات بلازما النقاهة ، والتي يتم اختبارها كعلاج لـ COVID-19 الخيار 12،13،14،15. سيكون تحديد العلاقة بين شدة المرض وحالات الاعتلال المشترك الأخرى الخاصة بالفرد واستجابة NAb أمرًا بالغ الأهمية في فهمنا لـ COVID-19 وفي تصميم علاجات فعالة.

تفتقر اختبارات الأجسام المضادة لـ SARS-CoV-2 المتوفرة حاليًا في الغالب إلى النطاق الديناميكي الكافي والحساسية للسماح بالكشف الدقيق أو تحديد حجم استجابة الجسم المضاد 16. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون التفاعل التبادلي المحتمل بين الأجسام المضادة المحددة لـ SARS-CoV-2 تجاه فيروسات كورونا المستوطنة الأخرى مربكًا في هذه الاختبارات 17،18،19،20 ، مما يجعلها أقل موثوقية. إن تحديد نشاط التعادل في بلازما المريض يواجه أيضًا تحديات ، حيث تعتمد هذه المقايسات عمومًا على تكرار الفيروس الحي ، مما يتطلب مختبرًا عالي المستوى للأمن البيولوجي BSL-3. لذلك ، هناك حاجة غير ملباة لتطوير فحوصات الأجسام المضادة الحساسة ومعادلة الفيروسات التي تكون قوية بما يكفي لفحص ومراقبة أعداد كبيرة من الأشخاص المصابين بفيروس SARS-CoV-2 أو الأشخاص الذين يقضون فترة النقاهة.

للتغلب على هذه التحديات التجريبية ، قمنا هنا بتطوير ما يلي: (1) مقايسة مناعية فلورية عالية الحساسية تعتمد على الخرز لقياس مستويات الأجسام المضادة الخاصة بـ SARS-CoV-2 وأنماطه ، و (2) الفيروس الكاذب القوي لـ SARS-CoV-2 spike البروتين لقياس مستويات NAb في بلازما مرضى COVID-19. لقد وجدنا فروقًا مذهلة في مستويات الأجسام المضادة الكلية وتتر المعادلة بين مرضى COVID-19 في المستشفى أو مرضى COVID-19 الحادة بالنسبة إلى المتبرعين بالبلازما في العيادات الخارجية أو المتبرعين بالبلازما في فترة النقاهة ، والتي تم الحصول عليها بغرض النقل إلى المرضى وعلاجهم. كما لوحظت ارتباطات كبيرة بين مستويات الأجسام المضادة وتتر المعادلة والعمر و NAbs إلى SARS-CoV. هذه الاختبارات والنتائج لها آثار مهمة لتقييم اتساع وعمق الاستجابة المناعية الخلطية أثناء عدوى SARS-CoV-2 ولتطوير علاجات أو لقاحات فعالة تعتمد على الأجسام المضادة.


مقدمة

يُشتق هذا البروتوكول من الاستراتيجيات التي تم تطويرها في دراستنا الأخيرة التي تميز استجابة الخلايا البائية البشرية للإنفلونزا 1. من خلال هذه التقنية ، من الممكن للمختبر ذي الخبرة في العملية أن ينتج ملليجرامات من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة البشرية (hmAbs) في أقل من 28 يومًا. هذه القدرة على التعبير عن hmAbs الخاصة بالمستضد وتوصيفها مفيدة للغاية لمجموعة متنوعة من التطبيقات. تتراوح هذه من توضيح تفاعلات الأجسام المضادة ومستضدات معينة لاستكشاف مناعة الخلايا البائية الأساسية أو لإنتاج علاجات قيمة. نظرًا لخصوصية الحاتمة الواسعة للأجسام المضادة التي تنتجها هذه الطريقة ، يمكن إنتاج أعداد كبيرة من الأجسام المضادة عالية الانجذاب بسرعة ، مما ينتج عنه لوحات تشخيص لشاشات المستضد السريع.

طرق إنتاج hmAbs

يمكن إنتاج HmAbs بعدة طرق ، بما في ذلك تخليد الخلايا البائية بفيروس Epstein-Barr 2،3 ، وإنتاج الأورام الهجينة B-cell 4 ، وإضفاء الطابع البشري على الأجسام المضادة من الأنواع الأخرى 5 ، باستخدام مكتبات عرض الملتهمة 6 أو توليد الأجسام المضادة بشكل متجانس من عزل خلايا ب واحدة 7،8. ومع ذلك ، فإن التقنية الموصوفة هنا هي أكثر ملاءمة للتطوير السريع لمكتبة كبيرة من الأجسام المضادة مع مجموعة من الخصائص ضد أحد مناعي معين. في الأساليب التي تتطلب سلالات خلوية من الخلايا البائية ، فإن نهج الاستنساخ الفرعي الشامل ونهج البندقية الشامل يحد من عدد الأجسام المضادة المفيدة التي يمكن إنتاجها حتى على مدى فترات زمنية طويلة 9. يقضي عرض الملتهمة الحالية والأنظمة ذات الصلة وقتًا طويلاً في تحديد عدد قليل من الأجسام المضادة المرشحة الموجودة ويتضح أن جزءًا كبيرًا منها منخفض التقارب 9. على الرغم من أن تقنية عرض الملتهمة تستخدم جينات متغيرة ثقيلة وسلسلة خفيفة بشرية بالكامل ، يتم إقران السلاسل الثقيلة والخفيفة بشكل عشوائي في المختبر، وبالتالي من المرجح أن تحفز الاستجابات التأقية كبروتينات أجنبية أو تكون ذاتية التفاعل إذا كانت الاستخدامات العلاجية هي الهدف. تم إنشاء mAbs بواسطة في المختبر لا تقدم الأساليب أو الأنواع الأخرى تقييمًا حقيقيًا لخصائص الحاتمة التي يولدها البشر في الجسم الحي، والحد من استخدام هذه التقنيات لتطبيقات مثل اكتشاف حاتمة وتطوير اللقاح أو التقييم. تم إعاقة هذه التطبيقات نفسها من خلال التقنيات التي تستخدم خطوط الخلايا البائية الخالدة بسبب عدد الأجسام المضادة المعزولة القليلة نسبيًا المعزولة التي يمكن توليدها. أخيرًا ، بالنسبة للتطبيقات العلاجية المحتملة ، يجب استنساخ Fab الذي يتم إنتاجه بواسطة مكتبات عرض الملتهمة أو في الأنواع الأخرى (الفئران) ودمجها في العمود الفقري Fc البشري والتعبير عنها في خط خلية بشرية. هذه الأساليب الإنسانية تمثل إنفاقًا كبيرًا للوقت والموارد 9.

مقارنة بالطرق الحالية لإنتاج hmAbs

هناك قيود على هذه الطريقة يتم موازنتها بالمزايا. الأساليب الأخرى الموصوفة أعلاه (تحويل فيروس إبشتاين - بار ، عرض الملتهمة ، إلخ) هي تقنيات hmAb القائمة على الذاكرة B والتي تسمح بإجراء تقييم بأثر رجعي للتاريخ الكامل لتعرضات المستضد السابقة. يسمح هذا بعزل mAbs حتى 80 عامًا بعد التعرض للعامل الممرض كما يتضح مؤخرًا من استنساخ الأجسام المضادة ضد سلالة جائحة إنفلونزا 1918 من متبرع يبلغ من العمر 95 عامًا 10. تلغي هذه الأساليب الحاجة إلى الحصول على عينات جديدة (الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المجمدة (PBMCs) مناسبة للاستخدام) وتتجنب الصعوبات اللوجستية للحصول على الخلايا البائية من الأشخاص الذين لديهم استجابات مناعية نشطة. على العكس من ذلك ، تنبع قوة نهج hmAb المستند إلى ASC من هذا القيد بالذات: يعتمد النهج على عزل البلازما المنشطة في ذروة الاستجابة المناعية بحيث تكون غالبية hmAbs المعزولة خاصة بالمستضد. وبالتالي ، على الرغم من ضرورة توفر لقاح بشري ، بالإضافة إلى متبرع لتلقي التطعيم والتبرع بالدم ، فإن هذا يسمح بكفاءة غير مسبوقة لتوليد العديد من mAbs محددة. بالإضافة إلى ذلك ، توفر العملية نافذة مباشرة على الاستجابات المناعية المستمرة. على سبيل المثال ، لاحظنا توسعات في عدد السكان ASC أثناء العدوى الطبيعية (ملاحظات غير منشورة). لذلك ، من المحتمل أن يتم استخدام الإجراء لتصنيع الأجسام المضادة من الخلايا الجذعية السرطانية التي يتم تحفيزها أثناء العدوى الطبيعية أو بعدها بفترة وجيزة ، أو لصنع أجسام مضادة للذات من المرضى الذين يعانون من بعض اضطرابات المناعة الذاتية. أخيرًا ، تعتمد طريقتنا كما هو موصوف هنا على تعداء عابر لإنتاج الأجسام المضادة ، مما يسمح بالفحص السريع للعديد من الأجسام المضادة ولكن يجعل تحضير الأجسام المضادة على نطاق واسع أمرًا صعبًا. ومع ذلك ، في حالة الحاجة إلى زيادة الإنتاج ، يمكن بسهولة تكييف طرق إنتاج مواد نقل العدوى المستقرة والتلاعب بخطوط خلايا الإنتاج.

الخطوات الجوهرية في عمليتنا لإنتاج hmAbs المؤتلف هي تعديل لنظام تم استخدامه لتوضيح الآليات الأساسية لمناعة الخلايا البائية والمناعة الذاتية من قبل كل مننا 11،12 والآخرين 7،8. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموصوف هنا هو التكامل الأول لهذه العملية التي تنتج hmAbs عالية التقارب خاصة بمستضد محل الاهتمام بسرعة نسبيًا وبشكل حاسم ، بغض النظر عن أي تلطيخ محدد للمستضد. حتى الآن ، أنتجت هذه التقنية أجسامًا مضادة للإنفلونزا ومضادة لسم الجمرة الخبيثة ومضادة للالتهاب الرئوي hmAbs ويمكن تكييفها بسهولة مع أي جهاز مناعي يتم تطعيم البشر به. على سبيل المثال ، أنتجت مجموعة أخرى أجسامًا مضادة للكزاز باستخدام جينات متغيرة من ASCs تم التعبير عنها في الإشريكية القولونية 13. يمكن أن يوفر هذا التنوع مكتبة من الأجسام المضادة البشرية ضد الأهداف التي تتطلب استجابة سريعة ، مثل عوامل الإرهاب البيولوجي أو الأوبئة الفيروسية ، أو مكتبات كبيرة من hmAbs كما هو الحال في تقييم اللقاح.

التطبيقات المحتملة لـ hmAbs الناتجة عن تلقيح المستضدات

هناك اعتقاد خاطئ شائع بأن التمنيع النشط يستبعد الحاجة إلى التمنيع السلبي. على الرغم من أن اللقاح ضروري لإنتاج الأجسام المضادة بالطريقة التي نصفها ، يمكن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي ينتجها نظامنا كعلاج مناعي سلبي في مجموعة كبيرة ومتنوعة من الحالات. يُستخدم الغلوبولين المناعي البشري المُجمَّع حاليًا كعلاج لعدة عوامل ، بما في ذلك التهاب الكبد B والكزاز وداء الكلب 14. تحمل الأمصال المجمعة مخاطر ، بما في ذلك الاستجابات التأقية المحتملة أو تفاعلات المناعة الذاتية ، والتي يمكن تجنبها عن طريق جسم مضاد وحيد النسيلة فعال معادل. علاوة على ذلك ، في حالات الهجوم الإرهابي البيولوجي مع أحد مسببات الأمراض مثل الجمرة الخبيثة التي لا يتم تطعيم عامة الناس ضدها ، يمكن أن توفر hmAbs حماية سريعة ضد العامل الممرض بينما تبدأ المضادات الحيوية في تقليل الحمل البكتيري. وبالمثل ، يمكن أن تساعد وحيدة النسيلة ضد السموم مثل السموم العصبية البوتولينوم في علاج أولئك المعرضين ، لأن التحصين الفعال باللقاح سيستغرق أسبوعين على الأقل لمنح الحماية. أخيرًا ، هناك العديد من السكان الذين يعانون من نقص المناعة حيث تكون اللقاحات غير فعالة 15. في هذه الحالات ، بما في ذلك كبار السن وصغار السن ، يمكن أن تكون العلاجات المناعية السلبية أحادية النسيلة حاسمة في علاج الأمراض المعدية. التطبيق النهائي المحتمل هو تطوير الأجسام المضادة العلاجية لعلاج الأمراض المعدية المزمنة أو المقاومة للمضادات الحيوية. تتضمن بعض الأمثلة الرئيسية الجهود الكبيرة التي يتم استثمارها الآن لعزل الأجسام المضادة النادرة التي يمكن تحييدها على نطاق واسع والتي يمكنها التحكم في سلالات مختلفة من فيروس نقص المناعة البشرية 16. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الكواشف بشكل مباشر كعامل مساعد للأدوية المضادة للفيروسات في السيطرة على الفيروس ، فقد يكون التطبيق الأكثر أهمية هو القدرة على تقييم العديد من هذه الأجسام المضادة لفهم كيف يمكن للقاح أن يستخرجها. والمثال الثاني هو إمكانية إنتاج علاجات ضد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية مباشرة من المرضى الذين يتخلصون من العدوى: المضادات الحيوية الجديدة نادرة ، لكن الأجسام المضادة يمكنها القضاء على هذه العدوى على الرغم من مقاومة الأدوية 17. يمكن استخدام الأجسام المضادة المعادلة من هؤلاء المرضى بشكل مباشر أو يمكن أن يؤدي الاستهداف الصيدلاني للحلقات المعادلة المكتشفة إلى زيادة خيارات العلاج لدينا بشكل كبير. في كل هذه الحالات ، من خلال القدرة بشكل أساسي على عزل العديد من hmAbs المحددة بسرعة ، تزيد تقنيتنا بشكل كبير من إمكانية استخدام علاجات الأجسام المضادة أحادية النسيلة لمجموعة واسعة من الأمراض المعدية وعوامل الإرهاب البيولوجي.

تصميم تجريبي

يظهر مخطط تدفق يصف بإيجاز جميع المراحل في هذا البروتوكول في الشكل 1.

في ظل الظروف المثلى ، يمكن للمختبر المتمرس إكمال الإجراء بأكمله من التطعيم إلى الجسم المضاد في أقل من 28 يومًا.

في هذا البروتوكول ، يتم عزل الخلايا المفرزة للأجسام المضادة (ASCs) أولاً من الدم الكامل الذي تم جمعه بعد 7 أيام من التطعيم بالمناعة. لقد نجحنا في صنع أجسام مضادة بعد التطعيم بـ Fluvirin (2005-2006 ، 2006-2007 و2007-2008) ، Pneumovax23 و Biothrax. يتم عزل PBMCs باستخدام بروتوكول فصل الخلايا الليمفاوية القياسية. يتم تحليل تواتر ASCs الخاص بالمستضد باستخدام بروتوكول ELISpot القياسي 18 (انظر الإطار 1). يعدد هذا الاختبار عدد ASCs المنتجة لـ IgG ، بالإضافة إلى ASCs الخاصة بمستضد. تُعد النسبة المئوية من ASCs الخاصة بالمستضد والمنتجة لـ IgG مقياسًا مفيدًا لاستجابة المتبرع للقاح وبالتالي الكمية التقريبية للأجسام المضادة عالية الانجذاب المنتجة.

ثم يتم فرز الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. أولاً ، يتم ضبط بوابة الخلية الحية ، بما في ذلك خلايا التفجير الأكبر ، باستخدام التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي. يتم فرز ASCs بشكل كبير عن طريق البوابات الأولى على CD19 مرتفع / CD20 منخفض إلى Neg / CD3 Neg ثم على خلايا CD27 عالية / CD38 عالية كما هو موضح في الشكل 2. تم تعيين بوابات IgG و IgM و IgD المناسبة للحصول على ASCs المنتجة لـ IgG ، على الرغم من أنه من الممكن أيضًا استخدام هذه الطريقة لعزل ASCs المنتجة لـ IgM أيضًا. أخيرًا ، فإن ASCs المنقى عبارة عن خلية مفردة مصنفة في لوحات PCR أحادية الخلية محملة بمخزن مؤقت يحتوي على مثبط RNase.

أولاً ، يتم تعيين بوابة الخلية الحية ، بما في ذلك خلايا التفجير ، ثم CD19 مرتفع / CD20 منخفض إلى neg / CD3 neg و CD27 مرتفع / CD38 مرتفع. أخيرًا ، تم تعيين بوابات IgG IgM و IgD المناسبة للحصول على السكان الدقيقين المعنيين ، مما يؤدي إلى تحسين كفاءة فتيلة الغلوبولين المناعي الثابتة الخاصة بالمنطقة.

باستخدام كل من RT-PCR و PCR المتداخلة ، يتم تضخيم جينات الجسم المضاد في كل خلية على أساس كل خلية. يتم إنجاز RT-PCR باستخدام مزيج من تسعة بادئات ، مصممة لتغطية جميع عائلات الجينات المتغيرة (V) الممكنة (الجدول 1). يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل لتضخيم الحمض النووي بدرجة كافية للحصول على متواليات من الجينات الثقيلة والخفيفة السلسلة V. هذا ضروري لاستنساخ PCR. في هذه الخطوة ، يتم استخدام بادئات محددة للغاية لكل عائلة من الجينات V لتضخيم الحمض النووي للاستنساخ. تم تصميم بادئات "استنساخ PCR" لدمج مواقع تقييد الاستنساخ ووضع جينات السلسلة الخفيفة VDJ الثقيلة أو VJ في إطار مع متواليات ببتيد الإشارة وجينات المنطقة الثابتة داخل نواقل الاستنساخ المعنية. تم دمج مواقع الاستنساخ في النواقل الخاصة بناقلات سلسلة ثقيلة أو خفيفة معينة للسماح بدمج مناسب داخل الإطار لإدخالات الجينات المتغيرة. يتم بعد ذلك هضم المواد المتساقطة والناقلات وتنقيتها للاستنساخ. ثم يتم استنساخ سلسلة الحمض النووي الثقيلة والخفيفة من كل خلية مفردة إلى نواقل منفصلة وتحويلها. تمت زراعة أربع مستعمرات على الأقل من التحول ، وتهيئتها وتسلسلها. تتم مقارنة التسلسلات من كل مستعمرة ثم يتم اختيار المستعمرة الأكثر مطابقة للإجماع لمزيد من التضخيم إلى النطاق الأقصى.

تُستخدم الخلايا الظهارية للكلية البشرية المنقولة بشكل عابر (خط خلية HEK293 19) لإنتاج الجسم المضاد. يتم استخدام تعداء البولي إيثيلينيمين مع كميات متساوية من ناقل السلسلة الثقيلة والخفيفة وفقًا للبروتوكولات القياسية 20. يسمح للخلايا بإنتاج الجسم المضاد لمدة 5 د. يتم بعد ذلك تنقية وسائط تعداء التي تحتوي على hmAbs باستخدام خرزات بروتين A agarose وتركيزها باستخدام مركّزات البروتين التجارية. خلال المرحلة النهائية ، يتم تحليل hmAbs للتركيز والنقاء والتفاعل.


تحلل الخلايا والترسيب المناعي باستخدام منظف CHAPS

تمت صياغة المخزن المؤقت للترسيب المناعي CHAPS (CIB-1) للحفاظ على التفاعلات بين الجزيئات بعد استخراج البروتين عبر الغشاء والخلوي. يعد المخزن المؤقت CHAPS مثاليًا لسحب تحليل الترسيب المناعي المشترك (أي Co-IP) ، لأنه يحافظ على تكوين البروتين بالإضافة إلى تجميع معقد البروتين.

بعد تحلل الخلية وإذابة البروتين الخلوي في المخزن المؤقت لـ CHAPS ، يمكن عزل البروتينات المجمعة معًا باستخدام تقنية الترسيب المناعي. يضاف الجسم المضاد المناعي للارتباط بأحد أهداف البروتين المجمعة. يتم بعد ذلك إضافة دعامة صلبة ، مثل Protein-G Sepharose ، للربط غير التساهمي والارتباط بمركب البروتين والأجسام المضادة وتجعله غير قابل للذوبان. بعد سرعة منخفضة للطرد المركزي والترسيب والغسيل ، يتم عزل مركب البروتين والأجسام المضادة الصلبة معًا.

البروتينات التي يتم تجميعها مع البروتين الذي يستهدفه الجسم المضاد المناعي تصبح مناعية مشتركة. من خلال تطوير لطخات غربية بجسم مضاد مختلف يستهدف بروتينًا مشتركًا ، يمكن للباحث توصيف وتحديد التفاعل بين نوعين أو أكثر من أنواع البروتين. يمكن أيضًا استخدام فحوصات النشاط الكيميائي الحيوي الوظيفي لتوصيف الجزيئات الحيوية المُجمَّعة والمُترسَّب بالمناعة.

عناصر

  • جهاز الطرد المركزي الدقيق عند 4 درجات مئوية
  • طاولة هزازة
  • غرفة باردة أو علبة مبردة
  • جسم مضاد مناسب للترسيب المناعي كما هو محدد من قبل البائع. بشكل عام ، يجب أن يتعرف الجسم المضاد المسبب للمناعة على التشكل الأصلي.
  • تطبيقات اللطخة الغربية: جسم مضاد مناسب لاكتشاف اللطخة الغربية كما هو محدد من قبل البائع. يجب أن يتعرف هذا الجسم المضاد على حالة DENATURED للبروتين المستهدف.

ضوابط وعينات مقترحة للمقارنات

  • أداء بروتوكول الترسيب المناعي مع جسم مضاد غير ذي صلة للتحكم في ظهور العصابات البروتينية الزائفة.
  • حل في اللطخات الغربية محللة الخلية الأصلية غير المجزأة ، والجزء غير المنضم (على سبيل المثال ، الجزء الذي يحتوي على بروتينات غير مرتبطة بالدعم الصلب للبروتين A أو G) والمواد المثبطة للمناعة لتأكيد التجزئة والإثراء.
  • تطوير لطخة غربية تكتشف البروتين المستهدف مباشرة من قبل الجسم المضاد المناعي. يؤكد هذا الإجراء حدوث الترسيب المناعي.

ألف بروتوكول لثقافة الخلية

يوصى بتربية الخلايا حتى 80-90٪ من الالتقاء قبل إجراء تحلل الخلايا والترسيب المناعي. يجب غسل الخلايا خالية من بروتينات المصل باستخدام PBP قبل إجراء الترسيب المناعي لمنع ظهور عصابات بروتين مصل غير محددة في البقع الغربية في اتجاه مجرى النهر.

B. بروتوكول تحلل الخلية بمنظف CHAPS

نوصي باستخدام 300 ميكرولتر من محلول CHAPS لأطباق زراعة الخلايا من 1 إلى 3 10 سم من الخلايا المتحللة. مقياس وفقًا للأرقام أو الأحجام الأخرى لأطباق زراعة الخلايا وفقًا لمساحة سطح الطبق. قبل التحلل ، اجعل ثلج CHAPS Buffer باردًا وأضف مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز.

يجب غسل الخلايا خالية من بروتينات المصل باستخدام PBS قبل إجراء الترسيب المناعي لمنع ظهور عصابات بروتين مصل غير محددة في البقع الغربية المصب. إزالة المتوسطة ثقافة الخلية وغسل طبق ثقافة الخلية 10 سم بلطف مع 5 مل برنامج تلفزيوني ، ثلاث مرات. استخدم دفقًا لطيفًا من برنامج تلفزيوني لمنع الخسارة المفرطة للخلايا من اللوحة. بعد الغسل ، قم بتغطية طبق زراعة الخلايا بالغطاء وضع طبق زراعة الخلايا على سرير من الثلج

  • خلايا ليز وتنتج جزءًا طافًا بسرعة على النحو التالي: الاستغناء عن 300 وحدة ثلجية باردة من مثبطات الأنزيم البروتيني / الفوسفاتيز فوق طبقة الخلية ، وقم بتدوير اللوحة يدويًا لتغطية الخلايا بغشاء من CHAPS ، ثم قم بإخراج الخلايا فورًا باستخدام مكشطة الخلية . استخدام ماصة نقل مع فتحة واسعة لشفط الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل. يمكن أيضًا نقل محلول 300 uL Chaps بالتتابع إلى ما يصل إلى ثلاث لوحات منفصلة بحجم 10 سم من الخلايا قبل وضع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل.
  • ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل مع تعليق الخلية على الجليد لمدة 10 دقائق: اضغط بقوة على الأنبوب عدة مرات خلال هذه الفترة التي تبلغ 10 دقائق لتسهيل انحلال غشاء الخلية. يمكنك أيضًا استخدام طاولة متأرجحة لتدوير تعليق الخلية لزيادة تسهيل انحلال غشاء الخلية. لا تقم بتدوير محلول الخلية إذا تم التخطيط للترسيب المناعي.
  • الطرد المركزي المحللة الخلية في ميكروسينتريفوجي تبريد بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة لتقسيم طاف وبيليه. اجمع الجزء الطاف ، الذي يحتوي على الغشاء المستخرج وبروتينات العصارة الخلوية ، وقم بتوزيع هذا الطاف في أنبوب آخر للطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل يتم وضعه في الجليد. يتوافق هذا الطاف المنقول مع جزء طاف غير مجزأ. وضع جانبا قسامة صغيرة لإجراء مقارنات بالمواد المناعية التي تم إنشاؤها لاحقًا في البروتوكول. يمكن تخزين المادة الطافية غير المجزأة عند -20 درجة مئوية ، أو -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

جيم بروتوكول الترسيب المناعي مع المنظفات CHAPS

  • إضافة الجسم المضاد المناعي إلى جزء طاف غير مجزأ ، باستخدام عيار الجسم المضاد الموصى به من قبل الشركة المصنعة. ضع الأنبوب مع تفاعل الترسيب المناعي على طاولة متأرجحة تحت التبريد (مثل غرفة باردة ، أو علبة مبردة) لمدة 15-30 دقيقة لخلط خليط طاف الأجسام المضادة. قد تختار في البداية تجربة فترة 15 دقيقة الأقصر للترسيب المناعي ، وهي فترة زمنية أكثر ملاءمة للحفاظ على تفاعلات تقارب منخفضة.
  • قم بالاستغناء مباشرة عن 60 ميكرولتر من حبات الترسيب المناعي (مثل خرز Sepharose-G ، أو حبات البروتين A) في كل 300 ميكرو لتر إلى 2 مل من المادة الطافية غير المجزأة مع الجسم المضاد المناعي. ضع هذا الأنبوب على طاولة متأرجحة لمدة 30 دقيقة أخرى إلى ساعة واحدة تحت التبريد لتوليد مركب صلب غير قابل للذوبان - معقد بروتين جسم مضاد.
  • استخدم جهاز طرد مركزي صغير مبرد عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لترسيب حبات الترسيب المناعي. الناتج الطاف هو الكسر غير المنضم. جمع الكسر غير منضم دون إزعاج بيليه حبة الراسب المناعي. تخزين الجزء غير منضم عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية.
  • إضافة قسامة إضافية من 300 UL الجليد الباردة CHAPS مع مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز إلى حبات الترسيب المناعي. قم بتدوير الأنبوب 180 درجة يدويًا ثلاث مرات وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. إزالة والتخلص من غسل طاف. كرر إجراء الغسيل هذا مرتين أخريين. بعد الغسل الأخير ، استخدم جهاز الطرد المركزي الصغير لترسيب حبات الترسيب المناعي عند 14000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول الغسيل باستخدام ماصة بلاستيكية مدببة باستور. الجزء المترسب مناعيا ، المرتبط بالخرز ، يصبح مترسبا في قاع الأنبوب.

د- بروتوكول شطف الكسر المناعي من الحبيبات والبقعة الغربية بمنظف CHAPS

  • هناك عدة طرق لاستخراج البروتينات المثبطة للمناعة من الدعامة الصلبة لإطلاق جزء قابل للذوبان من الراسب المناعي. إن أبسط طريقة قابلة للتطبيق على النشاف الغربي اللاحق هي تطبيق Laemmli Sample Buffer (LSB مع mercaptoethanol) مباشرة على حبات التحلل المناعي: أضف 100l LSB إلى كل 60 ميكرولتر من حبات الترسيب المناعي. دوامة LSB - محلول الراسب المناعي بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية ، ثم تسخينها عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الآن قم بترسيب الحبيبات باستخدام الطرد المركزي منخفض السرعة (3000 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق. اجمع المادة الطافية سيتم إطلاق البروتينات المثبطة للمناعة (جنبًا إلى جنب مع الجسم المضاد المناعي) في المادة الطافية.
  • يمكن حل المادة الطافية في اللطخات الغربية اللاحقة. بدلاً من ذلك ، إذا كان البروتين الذي تريده يتجمع بسهولة عند تسخينه عند درجة حرارة عالية في LSB ، قم بالتسخين بدلاً من ذلك عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. واتبع نفس الخطوات المذكورة أعلاه. حل في الممرات الهلامية المتتالية والبقع الغربية ، 1) الكسر غير المجزأ ، 2) الكسر غير المنضم و 3) الكسر المناعي. مع الترسيب المناعي الناجح ، يجب أن تلاحظ إثراء البروتين الذي تريده ، جنبًا إلى جنب مع أي بروتينات مُجمَّعة بشكل مشترك في الكسر المناعي.

هـ- بروتوكول تجانس الأنسجة قبل التبويض المناعي بمنظف CHAPS

يجب إجراء هذه العملية على الجليد.

  • يطحن ما يقرب من 90 ميكروليتر من الأنسجة. ضع الأنسجة في أنبوب دائري دقيق للطرد المركزي سعة 1.5 مل.
  • أضف كوكتيلات مثبطات الفوسفاتاز والبروتياز العامة إلى 500 ميكرولتر من تحلل CHAPS المثلج ومانع الترسيب المناعي
  • إضافة 500 UL CHAPS عازلة مع مثبطات للأنسجة المسحوقة.
  • قم بتجانس الأنسجة باستخدام أداة تجانس مدقة صغيرة باستخدام 15 ضربة ، 3 ثوان / ضربة على الجليد.
  • جهاز طرد مركزي 12000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية
  • إزالة المادة طافية (بدون طبقة دهنية) ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل آخر
  • الطرد المركزي مرة أخرى عند 12000 جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية
  • نقل طاف لأنبوب آخر. يحتوي الجزء الطاف على البروتينات المستخرجة التي يمكن استخدامها للترسيب المناعي.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

  • لم يحدث الترسيب المناعي. Resolution: 1) You may have to empirically identify an antibody for immunoprecipitation that recognizes the native conformation of the epitope. 2) The protein complex is not maintained outside of a live-intact cell. Cross-linking procedures using membrane permeable cross-linking reagents and live cells may be required to capture the interaction and assembly among proteins.
  • The IgG heavy chain of the immunoprecipitating antibody (that was dispensed in the immunoprecipitation solution) migrates in gels at the same position as a protein of interest, and therefore masks its appearance in a Western blot. Resolution: For Western blot development, use an antibody derived from an animal host different from the immunoprecipitating antibody. In this case, the appropriate secondary-HRP conjugated antibody will not bind appreciably to the immunoprecipitating antibody that was transferred to the Western blot, preventing the appearance of an overlaying Western blot band.

Animal efficacy data shows robust immune response and safety

Researchers tested two vaccine candidates of AAVCOVID that were qualitatively different in how they would elicit an immune response. They tested each candidate in mouse and nonhuman primate models at different doses to determine safety and immunogenicity (the ability to produce an immune response).

The immunogenicity following a single intramuscular injection was shown to be potent in inducing neutralizing antibodies in two mouse strains and both genders, a mouse model for aging and an obese mouse model. Both vaccine candidates demonstrated durable responses from a single dose administration for at least three months. Early onset of antibody responses were seen by day 14 and rates increased over time.

In non-human primates, AAVCOVID candidates were shown to retain peak immunogenicity for at least five months following a single-dose injection. Responses in both animal models were complemented by functional memory T-cell responses, important to confer durable immunity.

Mice and nonhuman primates tolerated the vaccine candidates well with no adverse safety events observed. While these results need to be confirmed in human studies in healthy volunteers, the researchers hope the favorable safety profile of established AAV-based gene therapies already approved for use in Europe and the U.S. -- which are often given at much higher doses in patients -- will translate to the vaccine.


Analysis of Results: Fluorescent vs. Light Microscopy

Fluorescent Microscopy

Both immunofluorescent ICC and IHC require an understanding of the configuration of epifluorescence or confocal microscope that will be used to analyze the sample. The best results will be obtained when spectral characteristics of the fluorophores conjugated to the primary or secondary antibody are matched to the excitation source (usually a laser) and emission filters of the available microscope. For more about designing a fluorescence microscopy analysis experiment, visit this page.

Light Microscopy

White light or brightfield microscopy may be more accessible to researchers as the necessary equipment is available in most labs, but is limited by the number of targets which may be simultaneously detected in the same tissue section. This is because deposition of the chromogen at the site of antibody binding to antigen in the tissue is dependent on enzyme-substrate activity, and the most common, reliable reagents (such as diaminobenzidine, or DAB, and alkaline phosphatase, or AP) do not offer multispectral colorimetric detection that would permit simultaneous detection of multiple targets.


ACKNOWLEDGMENTS

We thank Prof. H. Eric Xu (Shanghai Institute of Materia Medica) for providing RdRp protein. We also thank Healthcode Co., Ltd., Hangzhou Bioeast biotech Co., Ltd. and Vacure Biotechnology Co.,Ltd. for providing the proteins. This work was supported by grants from the National Mega-Projects of Science Research for the 13th Five-year Plan of China (No. 2018ZX10302302002-001), the Natural Science Foundation of China (No. 81971909), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (HUST COVID-19 Rapid Response Call No. 2020kfyXGYJ040) to X-L Fan. This work was also partially supported by National Key Research and Development Program of China Grant (No. 2016YFA0500600), Interdisciplinary Program of Shanghai Jiao Tong University (No. YG2020YQ10), National Natural Science Foundation of China (No. 31900112, 21907065, 31970130 and 31670831) to S-C Tao.


Product Details

Preservative Stabilisers
0.09%Sodium Azide (NaN3)
1%Bovine Serum Albumin
Preservative Stabilisers
0.09%Sodium Azide (NaN3)
1%Bovine Serum Albumin
Reagents in the Kit
Annexin V:APC200 tests
Propidium Iodide Staining Solution2X 100 tests
10X Binding Buffer100 ml
Reagents in the Kit
Annexin V:PE200 tests
7-AAD Viability Staining Solution2X 100 tests
10X Binding Buffer100 ml

Interim Guidance for Antigen Testing for SARS-CoV-2

Antigen tests are commonly used in the diagnosis of respiratory pathogens, including influenza viruses and respiratory syncytial virus. The U.S. Food and Drug Administration (FDA) has granted emergency use authorization (EUA) for antigen tests that can identify SARS-CoV-2. See FDA&rsquos list of In Vitro Diagnostics EUAs external icon .

Antigen tests are immunoassays that detect the presence of a specific viral antigen, which implies current viral infection. Antigen tests are currently authorized to be performed on nasopharyngeal or nasal swab specimens placed directly into the assay&rsquos extraction buffer or reagent. The currently authorized antigen tests include point-of-care, laboratory-based, and self-tests, and they are applicable to people of any age. See Table 1 for additional information about antigen tests.

Antigen tests are relatively inexpensive, and most can be used at the point of care. Most of the currently authorized tests return results in approximately 15&ndash30 minutes. Antigen tests for SARS-CoV-2 are generally less sensitive than real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and other nucleic acid amplification tests (NAATs) for detecting the presence of viral nucleic acid. However, NAATs can remain positive for weeks to months after initial infection and can detect levels of viral nucleic acid even when virus cannot be cultured, suggesting that the presence of viral nucleic acid may not always indicate contagiousness.

Proper interpretation of both antigen test results and NAATs (when indicated) is important for accurate clinical management of patients or people with suspected COVID-19, or for identification of infected people when used for screening.

The clinical performance of diagnostic tests largely depends on the circumstances in which they are used. Both antigen tests and NAATs perform best if the person is tested when their viral load is generally highest. Because antigen tests perform best in symptomatic people and within a certain number of days since symptom onset, antigen tests are used frequently on people who are symptomatic. Antigen tests also may be informative in diagnostic testing situations in which the person has a known exposure to a person with COVID-19.

Accumulation of data on the performance of antigen tests in different situations has helped guide the use of these tests as screening tests in asymptomatic people to detect or exclude SARS-CoV-2 infection. See FDA&rsquos Recommendations for healthcare providers using SARS-CoV-2 diagnostic tests for screening asymptomatic individuals for COVID-19 external icon . Also see information from the Centers for Medicare & Medicaid Services (CMS) on Updated CLIA SARS-CoV-2 Molecular and Antigen Point of Care Test Enforcement Discretion external icon .

Antigen tests have been used for screening testing in high-risk congregate housing settings, such as nursing homes, in which repeat testing has quickly identified people with COVID-19, informing infection prevention and control measures, thus preventing transmission. In this case, and where rapid test turnaround time is critical, there is value in providing immediate results with antigen tests, even though they may have lower sensitivity than NAATs.

Healthcare providers and public health practitioners should understand test performance characteristics to recognize potentially false negative or false positive test results and to guide additional confirmatory testing and management of the patient or person. Laboratory and testing professionals who perform antigen tests should understand the factors that affect the accuracy of antigen testing, as described in this guidance. Healthcare providers, laboratory and testing professionals, and public health practitioners should also understand the differences among diagnostic, screening, and surveillance testing. See CDC&rsquos Overview of Testing for SARS-CoV-2, and Testing Strategies for SARS-CoV-2. Also see FDA&rsquos FAQs on Testing for SARS-CoV-2 external icon .

Regulatory Requirements for Using Antigen Tests for SARS-CoV-2

FDA regulates in vitro diagnostic devices and has provided recommendations and information regarding EUA requests for COVID-19 diagnostic tests in the Policy for Coronavirus Disease-2019 Tests During the Public Health Emergency (Revised) (&ldquoPolicy for COVID-19 Tests&rdquo) external icon and the EUA templates referenced in that policy. COVID-19 tests and test systems used for diagnostic or screening testing, including those for antigen testing, must have received an EUA from FDA or be offered under the policies in FDA&rsquos Policy for COVID-19 Tests external icon . Every antigen test for SARS-CoV-2 authorized for use by FDA is included on FDA&rsquos list of In Vitro Diagnostics EUAs external icon . The intended use of each test, available in the Instructions for Use and in the Letter of Authorization, defines the population in which the test is intended to be used, the acceptable specimen types, and how the results should be used.

Laboratory and testing professionals who conduct diagnostic or screening testing for SARS-CoV-2 with antigen tests must also comply with Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) regulations. Any laboratory or testing site that intends to report patient-specific test results to a person or healthcare provider must first obtain a CLIA certificate and meet all requirements to perform that testing. For more information, see CMS&rsquo How to Obtain a CLIA Certificate external icon . CMS has provided additional information on Enforcement discretion for the use of SARS-CoV-2 point-of-care testing on asymptomatic individuals external icon .

Performance of Antigen Tests for SARS-CoV-2

It is important for healthcare providers and testing personnel to understand the performance characteristics, including sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values, of the particular antigen test being used, and to follow the manufacturer&rsquos instructions for use, which summarize performance characteristics. See FDA&rsquos In Vitro Diagnostics EUAs external icon for detailed information about specific authorized tests.

The &ldquogold standard&rdquo for clinical diagnostic detection of SARS-CoV-2 remains laboratory-based (moderate- and high-complexity) NAATs. Thus, it may be necessary to confirm an antigen test result with a laboratory-based NAAT, especially if the result of the antigen test is inconsistent with the clinical context. Table 1 summarizes the differences between NAATs and antigen tests. Clinical performance of NAATs and antigen tests may differ from clinical utility when considering issues of test availability, quality of specimen collection and transport, and turnaround times of results. Based on their instructions for use, some point-of-care NAATs may not be used for confirmatory testing. NAATs that generate presumptive results are not appropriate for use in confirmatory testing.

The sensitivity of antigen tests varies but is generally lower than most laboratory-based NAATs. The antigen level in specimens collected either before symptom onset, or late in the course of infection, may be below the tests&rsquo limit of detection. This may result in a negative antigen test result, while a more sensitive test, such as most NAATs, may return a positive result. Studies external icon have shown that antigen tests have comparable sensitivity to laboratory-based NAATs when viral load in the specimen is high and the person is likely to be most contagious.

The specificity of antigen tests is generally as high as most NAATs, which means that false positive test results are unlikely when an antigen test is used according to the manufacturer&rsquos instructions. Despite the high specificity of antigen tests, false positive results will occur, especially when used in communities where the prevalence of infection is low &ndash a circumstance that is true for all in vitro diagnostic tests. In general, for all diagnostic tests, the lower the prevalence of infection in the community, the higher the proportion of false positive test results.

Positive and negative predictive values of all in vitro diagnostic tests (e.g., NAAT and antigen tests) vary depending upon the pretest probability. Pretest probability considers both the prevalence of the target infection in the population that is being tested as well as the clinical context of the individual being tested. If the prevalence of infection in the community is high, and the person being tested is symptomatic, then the pretest probability is generally considered high. If the prevalence of infection in the community is low, and the person being tested is asymptomatic and has not had any known contact to a person with COVID-19, then the pretest probability is generally considered low. See CDC&rsquos Interpreting Results of Diagnostic Tests for additional information on the relationship between pretest probability and the likelihood of positive and negative predictive values.

To help estimate pretest probability, CDC recommends that laboratory and testing professionals who perform antigen testing determine infection prevalence based on a rolling average of the positivity rate of their own SARS-CoV-2 testing over the previous 7&ndash10 days. Alternatively, state health departments generally publish COVID-19 data on testing positivity rates and case rates for their communities.

Processing of Antigen Tests for SARS-CoV-2

The Conditions of Authorization in the antigen EUAs specify that CLIA-certified laboratories and testing sites are to follow the manufacturer&rsquos instructions for use, typically found in the package insert, when performing the test and reading test results. The authorized instructions for use for each test can also be found at FDA&rsquos In Vitro Diagnostics EUAs external icon .

For example, the performance of antigen tests can be affected if the test components are not stored and handled properly. They should never be frozen and should always be allowed to reach room temperature (15-30°C) before use. The package insert for these tests includes instructions for handling of the test cartridge/card, such as ensuring it remains in its sealed pouch until immediately before use.

The package insert for antigen tests also includes instructions about how to read the test results, including the appropriate time to read the results and whether the results should be interpreted visually or with an instrument analyzer. Reading the test before or after the specified time could result in false positive or false negative test results.

Processing multiple specimens successively or in batch mode may increase the risk of contamination and may make it more challenging to ensure that each specimen is incubated for the correct amount of time before the result is read. Refer to the package insert for the correct incubation time for that test, and then monitor and ensure proper timing for each specimen during testing and when reading results.

All testing for SARS-CoV-2, including antigen testing, depends on the integrity of the specimen, which is affected by procedures for both specimen collection and handling. Improper specimen collection, such as swabbing the nostril too quickly, may cause insufficient specimen collection, resulting in limited amounts of viral genetic or antigenic material for detection. Time from specimen collection to testing should be minimized, and the temperature of the specimen during this time must be controlled. See CDC&rsquos Interim Guidelines for Collecting, Handling, and Testing Clinical Specimens for COVID-19.

Quality assurance procedures should be followed to prevent cross-contamination and inaccurate test results. For example, users should follow the manufacturer&rsquos instructions, as well as state and local guidance, for when and how often to perform testing on control specimens. If antigen testing returns multiple unexpected positive results, it may be appropriate to stop testing patient specimens, review all procedures, disinfect all surfaces, change gloves, and run control specimens before restarting the testing of patient specimens. In such circumstances, confirmatory testing should be considered for people who received unexpected results, regardless of pretest probabilities.

Decontaminate work surfaces and equipment with appropriate disinfectants by using an EPA-approved disinfectant for SARS-CoV-2, following the manufacturer&rsquos recommendations for use, such as dilution, contact time, and safe handling. See EPA&rsquos List of Disinfectants for COVID-19 external icon . Gloves should be changed before collecting, handling, and processing a new specimen in the antigen test system. Failing to change gloves can increase the risk of cross-contamination and false antigen test results. See CDC&rsquos guidance on Point-of-Care Testing, and Interim Laboratory Biosafety Guidelines for Handling and Processing Specimens Associated with Coronavirus Disease 2019 (COVID-19).

Some antigen tests have explored the use of viral transport medium (VTM) during specimen collection, but the use of VTM may cause false test results from either cross-reactivity with the capture antibodies or dilution of the specimen that decreases the sensitivity of the test. Laboratories and testing sites should refer to the instructions for use and the package insert that are specific for the test that they are using regarding the use of VTM.

Also see FDA&rsquos Letter to Clinical Laboratory Staff and Health Care Providers external icon on the potential for false positive results with antigen tests, and CDC&rsquos guidance on Point-of-Care Testing.

Evaluating the Results of Antigen Testing for SARS-CoV-2

Evaluating the results of an antigen test for SARS-CoV-2 depends primarily on the clinical and epidemiological context of the person who has been tested (e.g., symptoms, exposure to others with COVID-19, vaccination status, previous infection status, or setting in which they live). For additional details on testing recommendations see guidance for fully vaccinated people. A particularly important aspect of epidemiological context is whether the person to be tested is a resident or an employee of a congregate living facility. In addition, evaluating the results of an antigen test for SARS-CoV-2 should consider the performance characteristics (e.g., sensitivity, specificity) and the instructions for use of the FDA-authorized test, and the prevalence of SARS-CoV-2 infection in that particular community (percent positivity rate over the previous 7&ndash10 days or the number of cases in the community relative to the population size).

The evaluation of an antigen test result should consider whether the person has experienced symptoms, and if so for how long. Generally, healthcare providers can rely upon a positive antigen test result for a symptomatic patient because the specificity of current FDA-authorized antigen tests is high.

The sensitivity of current FDA-authorized antigen tests varies, and thus negative diagnostic testing results should be handled depending on the circumstances. In most circumstances, the manufacturers&rsquo instructions for use of antigen tests indicate that negative test results should be considered &ldquopresumptive,&rdquo meaning that they are preliminary results. See FDA&rsquos In Vitro Diagnostics EUAs external icon .

It may be appropriate to confirm antigen test results with a laboratory-based NAAT. For confirmatory testing, CDC recommends using a laboratory-based NAAT that has been evaluated against the FDA reference panel for analytical sensitivity. See FDA&rsquos SARS-CoV-2 Reference Panel Comparative Data external icon . NAATs that generate presumptive results are not appropriate for use in confirmatory testing.

CDC has developed two general antigen testing algorithms to accommodate two broad categories of use for antigen tests. CDC recommends following one of these two antigen testing algorithms to determine when confirmatory testing is recommended.

The first algorithm is designed for those who live in congregate settings, such as long-term care facilities, correctional and detention facilities, homeless shelters, and other group shelters. In these settings, correct case identification is particularly important because of the need to group isolated people together or in close proximity, so false positive test results can have significant negative consequences. See Figure 1, also available as a PDF. This algorithm is not designed for employees of congregate living facilities, who can quarantine and isolate outside of the facility if necessary.

The second algorithm is designed for community testing among people who do not live in congregate settings. The primary objective of this testing is to reduce the transmission of SARS-CoV-2 in the community, where there are concerns for introduction and widespread transmission, by quickly identifying and isolating people who are infected. See Figure 2, also available as a PDF.


How To Optimize Your ELISA Experiments

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is one of the most sensitive and reproducible technologies available. These assays are rapid, simple to perform, and easily automated. As with any assay, the reproducibility and reliability of ELISAs depend upon proper technique and attention to detail.

The ELISA technique is divided into:

Direct ELISA, where the antigen is immobilized on the ELISA plate, and the primary antibody carries the label (Figure 1 A)

Indirect ELISA, where the antigen is immobilized on the ELISA plate, and the secondary antibody carries the label (Figure 1 B)

Sandwich ELISA, where two primary antibodies (for capture and detection) embed the antigen, forming a "sandwich" and then the complex is recognized by a secondary labelled antibody (Figure 1 C).

Figure 1. Types of ELISA formats: A) direct, B) indirect and C) Sandwich ELISA.

Matched antibody pair in ELISA kit

Matched pair refers to sets of antibodies that are known to recognize different epitopes on the same protein antigen, so they can be used together for the capture and detection of a single antigen in a sandwich ELISA. The antibodies used in ELISA assays can be monoclonal, polyclonal, or a combination of both.

Monoclonal antibodies can be used for all antibody-containing steps in all types of ELISAs. They are commonly used in sets as matched pairs in sandwich ELISAs but can be used for capture or detection in conjunction with a polyclonal antibody to enhance signal or to provide a greater chance of capturing an antigen from a complex solution.

Due to the heterogeneity of antibodies present in polyclonal antibody solutions and the wide representation of epitopes present, polyclonal antibodies can be powerful tools for the detection of an antigen, often yielding higher signal levels than monoclonal antibodies. However, polyclonal antibodies are more likely to share one or more epitopes with closely related proteins, resulting in higher non-specific signal. One method of reducing this problem is to use affinity purified or cross-absorbed polyclonal antibodies. To increase assay sensitivity, the detection method for an ELISA can be switched from direct to indirect detection using a polyclonal antibody.

ELISA samples

A variety of samples can be tested in an ELISA, and the choice of assay conditions will depend upon the complexity of the sample and the expected amount of antigen present.

It is important to test all samples in duplicate or triplicate in conjunction with a known standard to ensure the accuracy of results and for quantitation.

It is better to test several dilutions of a sample to make sure the final results fall within the linear portion of the standard curve. Highly concentrated samples can underestimate concentration while highly diluted samples can overestimate concentrations.

ELISA blocking and washing steps

Blocking is often necessary to prevent non-specific binding of detection antibodies to the multi-well plate surface itself. When a plate is fully blocked, assay sensitivity will be enhanced since non-specific signal will be reduced.

A thorough washing procedure is essential for obtaining reliable ELISA results. It is important to completely aspirate liquid from all wells by gently lowering an aspiration tip into the bottom. Avoid scratching the inside of the well. When washing is complete, it is recommended to invert the plate and dry it on absorbent tissue.

How to optimize your ELISA experiment

Although each component is described separately, in many cases it is possible to optimize two components simultaneously by performing a checkerboard titration.

1) Capture Antibody Concentration

2) The Blocking Buffer

  • Prepare different blocking solutions. If the blocking solution is not preformulated (i.e., it is a single protein, such as BSA), try different concentrations of the protein.

3) The Standard Diluent

Try to match the standard diluent as closely as possible to the matrix of the sample.

If the matrix itself cannot be exactly duplicated then test different standard diluent solutions and check the standard curve and linearity of dilution for the sample. It may be necessary to choose a different diluent.

4) Sample Concentration

  • Prepare different concentrations of the sample, keeping in mind the detection limit of the substrate. To confirm that the biological sample matrix is not masking or enhancing the signal, spike-and-recovery and linearity-of dilution experiments should be performed.

5) The Detection Antibody Concentration

6) The Enzyme Conjugate Concentration

  • Prepare different concentrations of the enzyme conjugate according to the ELISA kit range described for the substrate.

7) Signal Detection

Select substrate(s) based on the amount of the antigen in the sample and ability to detect it with a plate reader.

If the antigen can clearly be detected then the substrate is appropriate.

If the antigen is below the threshold for detection then select a more sensitive substrate.

Common ELISA issues

1) Weak or no signal in ELISA

It is recommended that all reagents are at room temperature for 15–20 minutes before starting the assay.

Incorrect storage of components. Double-check storage conditions on the kit label. Most kits need to be stored at 2–8 o C.

Reagents added/prepared incorrectly. Check the protocol, ensure reagents were added in the proper order, and prepared to correct dilution.

Overexposure of fluorescent reagents. Intense light can cause photo-bleaching by decomposition of the fluorophore. Protection of the fluorophore from light is essential for effective signal generation at the end of the assay.

Components require further optimization. One of the components of the assay may be at a limiting concentration, resulting in lower overall signal.

Degradation of reagents. One of the reagents may have degraded or been contaminated, in which case it should be replaced.

Antibodies are an inefficient pair or lack sufficient affinity towards the target. The antibodies used may not bind effectively to the antigen or may not work in combination with each other. In such cases, alternative antibodies must be tested.

Detection system requires further optimization. The detection system (substrate) may not be sensitive enough to give the signal, or the standard curve may not be appropriate for the sample. It might be necessary to concentrate the sample or switch to a more sensitive substrate.

2) High background

Insufficient washing or blocking. High background signal is commonly the result of either insufficient washing or blocking, sample components or antibodies cross-reacting with the blocking buffer, or the use of too much enzyme conjugate.

It is important to balance the amount of enzyme giving specific signal versus that giving background signal. The most effective way to control this is by optimizing the enzyme conjugate, antibodies, and blocking solution.

3) Poor standard curve linearity

If the standard curve has a poor linearity, then samples must fall within a tight concentration range to be deemed accurate.

If the curve has good linearity but poor variation between replicates (i.e., standard error), there might be a technical problem such as inconsistent pipetting between samples or individual users.

All samples and standards should be measured at least in duplicate or triplicate to mitigate this issue.

4) Excessively high signal in ELISA

Insufficient washing. To avoid this issue, use the appropriate washing procedure, e.g., at the end of each washing step, invert the plate on absorbent tissue and allow to completely drain, tapping forcefully if necessary to remove any residual fluid.

Incubation time is too long. Excessive incubation time is also a reason for overly high signal in ELISA be sure to follow recommended incubation times.

Contamination. Avoid this issue using plate sealers, and use a fresh sealer each time the plate is opened. This will prevent wells from contaminating each other.


شاهد الفيديو: تحاليل بداية الحمل من اجل حمل سليم وجنين بصحة جيدة (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Shasho

    انا اظن، انك مخطأ. دعونا نناقشها. اكتب لي في رئيس الوزراء ، سوف نتحدث.

  2. Nedal

    ما هي العبارة ...

  3. Kenly

    ما زلت لا أسمع شيئًا عن هذا

  4. Etan

    لمعلوماتك ، لقد تمت مناقشة هذا بالفعل عدة مرات وتسبب دائمًا في مناقشات ساخنة ، ولكن لم يتم العثور على إجماع معقول. وضح أفكارك للقراء

  5. Roger

    هذا مكدس



اكتب رسالة