معلومة

ما هو المروج المنظم؟ وكيف ينظمها المرء؟

ما هو المروج المنظم؟ وكيف ينظمها المرء؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقرأ براءة اختراع حيث (في سلالة S. cerevisae YNP5):

قم بتعديل الجين ERG9 عن طريق استبدال محفز ERG9 الأصلي بمروج MET3 الخاضع للتنظيم

ما هو المروج الخاضع للتنظيم وكيف يتم تنظيمه؟ هل يجب على المرء أن يضيف شيئًا إلى المرق لتقليل التعبير؟

لا أرى أي شيء مميز في الوسط الثقافي.


المروج القابل للتنظيم يعني أن التعبير عن الجين في اتجاه مجرى هذا المحفز يمكن إما تحريضه أو كبته. Met3 هو مثال على مثل هذه المروجين الخاضعة للتنظيم ويتم تنظيمه من خلال إضافة الميثيونين إلى الوسائط. في الخميرة ، يشفر الجين Met3 لـ ATP sulphurylase ، وهو إنزيم في مسار الميثيونين الحيوي. عند إضافة الميثيونين ، يتم قمع الجين الذي يحركه مروج Met3 ، حيث يرتبط مستوى تعبيره بشكل عكسي بتركيز الميثيونين المضاف إلى الوسائط (الشكل من هذه الورقة):


ما هو المروج المنظم؟ وكيف ينظمها المرء؟ - مادة الاحياء

في البكتيريا والعتائق ، عادةً ما يتم ترميز البروتينات الهيكلية ذات الوظائف ذات الصلة - مثل الجينات التي تشفر الإنزيمات التي تحفز العديد من الخطوات في مسار كيميائي حيوي واحد - معًا داخل الجينوم في كتلة تسمى أوبرون ويتم نسخها معًا تحت سيطرة شخص واحد المروجين. هذا يشكل نسخة متعددة السلاسل (الشكل 1). بعد ذلك ، يتمتع المروج بالتحكم المتزامن في تنظيم نسخ هذه الجينات الهيكلية لأنها إما ستكون مطلوبة جميعًا في نفس الوقت ، أو لن تكون هناك حاجة إلى أي منها.

الشكل 1. في بدائيات النوى ، غالبًا ما يتم تنظيم الجينات الهيكلية للوظيفة ذات الصلة معًا على الجينوم ويتم نسخها معًا تحت سيطرة مروج واحد. تشمل المنطقة التنظيمية للمشغل كلا من المروج والمشغل. إذا ارتبط القامع بالمشغل ، فلن يتم نسخ الجينات الهيكلية. بدلاً من ذلك ، قد ترتبط المنشطات بالمنطقة التنظيمية ، مما يعزز النسخ.

العلماء الفرنسيون فرانسوا يعقوب (1920-2013) وجاك مونود في معهد باستير كانوا أول من أظهر تنظيم الجينات البكتيرية في أوبرا ، من خلال دراساتهم حول لاك أوبرون من بكتريا قولونية. وجدوا ذلك في بكتريا قولونية، جميع الجينات الهيكلية التي تشفر الإنزيمات اللازمة لاستخدام اللاكتوز كمصدر للطاقة تقع بجانب بعضها البعض في اللاكتوز (أو لاك) مشغل تحت سيطرة مروج واحد ، و لاك المروجين. لهذا العمل ، حصلوا على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 1965.

على الرغم من أن الجينات حقيقية النواة ليست منظمة في مشغلات ، إلا أن عوامل التشغيل بدائية النواة هي نماذج ممتازة للتعرف على تنظيم الجينات بشكل عام. هناك بعض المجموعات الجينية في حقيقيات النوى التي تعمل بشكل مشابه للأوبراونات. يمكن تطبيق العديد من المبادئ على أنظمة حقيقية النواة والمساهمة في فهمنا للتغييرات في التعبير الجيني في حقيقيات النوى التي يمكن أن تؤدي إلى تغيرات مرضية مثل السرطان.

يتضمن كل أوبرون تسلسلات الحمض النووي التي تؤثر على النسخ الخاص بها ، وتقع في منطقة تسمى المنطقة التنظيمية. تشمل المنطقة التنظيمية المروج والمنطقة المحيطة بالمروج الذي عوامل النسخيمكن للبروتينات المشفرة بواسطة جينات تنظيمية الارتباط. تؤثر عوامل النسخ على ارتباط ملفات بوليميراز الحمض النووي الريبي المروج والسماح لتقدمها لنسخ الجينات الهيكلية. أ كاظمة هو عامل نسخ يمنع نسخ الجين استجابة لمحفز خارجي من خلال الارتباط بتسلسل DNA داخل المنطقة التنظيمية التي تسمى المشغل أو العامل، والذي يقع بين موقع ربط RNA polymerase للمروج وموقع البدء النسخي للجين الهيكلي الأول. يمنع ربط القامع فعليًا بوليميراز الحمض النووي الريبي من نسخ الجينات الهيكلية. على العكس من ذلك ، فإن ملف المنشط هو عامل نسخ يزيد من نسخ الجين استجابة لمحفز خارجي عن طريق تسهيل ارتباط بوليميراز الحمض النووي الريبي بالمحفز. ان محفزهو نوع ثالث من الجزيئات المنظمة ، وهو جزيء صغير ينشط النسخ أو يثبطه من خلال التفاعل مع مثبط أو منشط.

في بدائيات النوى ، هناك أمثلة على العوامل التي تتطلب منتجاتها الجينية بشكل متسق إلى حد ما ، وبالتالي ، فإن تعبيرها غير منظم. هذه الأوبرا هي معبر عنها بشكل جوهري، مما يعني أنه يتم نسخها وترجمتها بشكل مستمر لتزويد الخلية بمستويات وسيطة ثابتة من منتجات البروتين. تقوم هذه الجينات بترميز الإنزيمات المشاركة في وظائف التدبير المنزلي المطلوبة للصيانة الخلوية ، بما في ذلك تكرار الحمض النووي ، والإصلاح ، والتعبير ، وكذلك الإنزيمات المشاركة في التمثيل الغذائي الأساسي. على النقيض من ذلك ، هناك عوامل أخرى بدائية النواة يتم التعبير عنها فقط عند الحاجة ويتم تنظيمها بواسطة الكابتات والمنشطات والمحفزات.


13.1: تنظيم مروج GAL1

  • بمساهمة من Clare M. O & rsquoConnor
  • أستاذ مشارك فخري (علم الأحياء) في كلية بوسطن

في الخميرة ، يلعب تحلل الجلوكوز دورًا رئيسيًا في إنتاج الطاقة ، ويعتبر الجلوكوز مصدر الكربون المفضل. عادة ما يتم قمع الجينات المشاركة في استقلاب مصادر الكربون الأخرى عند توفر الجلوكوز. عندما لا يتوفر الجلوكوز ، تقوم الخميرة بتنشيط الجينات التي تستقلب مصادر الطاقة الأخرى المتاحة ، مثل الجالاكتوز. يزيد الجالاكتوز من نسخ العديد من الجينات للإنزيمات التي تنقل الجالاكتوز إلى خلايا وتحوله في النهاية إلى جلوكوز 6 فوسفات (G6P) ، وهو وسيط في تحلل السكر. الجين الأول في المسار الناجم عن الجالاكتوز ، GAL1، يشفر الجالاكتوكيناز ، الذي يفسفر الجالاكتوز إلى الجالاكتوز -1 الفوسفات. (تفحص ال GAL1 مسارات الارتباط في SGD.) GAL1 تم دمج المروج في الجزء العلوي من موقع ORF في كل من البلازميدات pBG1805 و pYES2.1 ، وبالتالي يتحكم في نسخ البلازميد المشفر ميت / ميت و لاكز الجينات في الخلايا المحولة.

يوفر الشكل الموجود في الصفحة المقابلة نظرة عامة بسيطة على التعبير الجيني منGAL1 محفز بوجود الجلوكوز والرافينوز والجلاكتوز. يحتوي المروج على مواقع تنظيمية سلبية وإيجابية مشفرة ضمن تسلسل الحمض النووي الخاص به. في وجود الجلوكوز ، ترتبط البروتينات المثبطة بالمواقع التنظيمية السلبية وتثبط النسخ. يرتبط المنشط النسخي Gal4p بالمواقع التنظيمية الإيجابية. Gal4p هو عامل نسخ يرتبط بالحمض النووي باعتباره ديمر. (يوضح الشكل في بداية هذا الفصل التركيب البلوري لنطاقات ربط الحمض النووي وثنائياته في Gal4p المركب بالحمض النووي). في وجود الجلوكوز ، يكون Gal4p غير نشط ، لأنه مرتبط ببروتين الكابح ، Gal80p.

يمكن التخفيف من كبت الجلوكوز عن طريق نمو الخلايا في مصدر كربون فقير ، مثل رافينوز. رافينوز هو ثلاثي السكاريد يتكون من الجالاكتوز والفركتوز والجلوكوز. رافينوز غير قادر على إحداث مستويات عالية من GAL1 التعبير الذي يتطلب الجالاكتوز. في وجود الجالاكتوز ، والتعبير عن GAL1 يزيد الجين

1000 ضعف فوق المستوى الذي لوحظ في وجود الجلوكوز. يرجع هذا التحفيز في المقام الأول إلى نشاط Gal4p ، الذي لم يعد مرتبطًا ببروتين Gal80p المثبط. يعمل Gal4p كمنظم رئيسي لعملية التمثيل الغذائي للجالاكتوز. بالإضافة إلى التنشيط GAL1 النسخ ، يرتبط Gal4p أيضًا بمروجين GAL7 و جال 10 الجينات التي تقع بجوار GAL1 الجين على كروموسوم الخميرة 2. مثل GAL1، ال GAL7 و جال 10 تقوم الجينات بترميز البروتينات المشاركة في استقلاب الجالاكتوز.

تنظيم GAL1المروجين. في حالة وجود الجلوكوز ، يتم قمع النسخ لأن البروتينات المثبطة ترتبط بالمواقع التنظيمية
في الحمض النووي ومنشط النسخ Gal4p. يتم تخفيف قمع الجلوكوز في وجود رافينوز ، لكن Gal4p يظل غير نشط.
ينشط Gal4p النسخ في وجود الجالاكتوز بسبب إزالة بروتين Gal80p.


التعبير باستخدام نظام البوليميراز / المروج T7 RNA

تصف هذه الوحدة التعبير عن الجينات عن طريق وضعها تحت سيطرة البلمرة T7 RNA. إن إنزيم T7 RNA polymerase هو إنزيم نشط للغاية: فهو يصنع الحمض النووي الريبي بمعدل عدة مرات من E. coli RNA polymerase وينهي النسخ بشكل أقل في الواقع ، ويمكن لنسخه أن يبحر حول البلازميد ، مما ينتج عنه RNA عدة أضعاف طول البلازميد . إن بوليميراز T7 RNA انتقائي للغاية أيضًا عند البدء في تسلسل المحفز الخاص به وهو مقاوم للمضادات الحيوية مثل ريفامبيسين الذي يثبط E. coli RNA polymerase. وبالتالي ، فإن إضافة ريفامبيسين إلى الخلايا التي تنتج بوليميراز T7 RNA ينتج عنه التعبير الحصري عن الجينات الخاضعة لسيطرة محفز بوليميريز T7 RNA (p (T7)). في البروتوكول الأساسي ، يتم الحفاظ على اثنين من البلازميدات داخل نفس خلية الإشريكية القولونية. يحتوي واحد (ناقل التعبير) على p (T7) منبع الجين المراد التعبير عنه. والثاني يحتوي على جين بوليميريز T7 RNA تحت سيطرة محفز الإشريكية القولونية المحفز بالحرارة. عند تحريض الحرارة ، يتم إنتاج بوليميراز T7 RNA ويبدأ النسخ على ناقل التعبير ، مما يؤدي بدوره إلى التعبير عن الجين (الجينات) الخاضعة لسيطرة p (T7). إذا رغبت في ذلك ، يمكن تمييز المنتجات الجينية بشكل فريد عن طريق تنفيذ الإجراء في أقل وسط ، وإضافة ريفامبيسين لتثبيط إي كولاي بوليميريز إي كولاي ، ثم توسيم البروتينات بـ [35S] ميثيونين.


مراجع

جراي WM: التنظيم الهرموني لنمو النبات وتطوره. بلوس بيول. 2004 ، 2: E311-10.1371 / journal.pbio.0020311.

Lumba S، Tsuchiro T، Delmas F، Hazky J، Provart N، Lu QSM، McCourt P، Gazzarrini S: ينظم جين هوية الورقة الجنينية FUSCA3 تحولات الطور الخضري عن طريق التعديل السلبي للتعبير الجيني المنظم للإيثيلين في نبات الأرابيدوبسيس. بيول بيول. 2012 ، 10: 8-10.1186 / 1741-7007-10-8.

Gazzarrini S و Tsuchiya Y و Lumba S و Okamoto M و McCourt P: يتحكم عامل النسخ FUSCA3 في توقيت النمو في نبات الأرابيدوبسيس من خلال هرمونات gibberellin و abscisic acid. خلية التطوير. 2004 ، 7: 373-385. 10.1016 / j.devcel.2004.06.017.

Abeles FB ، Morgan PW ، Saltveit ME: الإيثيلين في بيولوجيا النبات. 1992 ، سان دييغو: مطبعة أكاديمية ، 2

Chen YF، Etheridge N، Schaller GE: نقل إشارة الإيثيلين. آن بوت (لوند). 2005 ، 95: 901-915. 10.1093 / aob / mci100.

Zhu Z و An F و Feng Y و Li P و Xue L و AM و Jiang Z و Kim JM و TK و Li W و Zhang X و Yu Q و Dong Z و Chen WQ و Seki M و Zhou JM و Guo H: يؤدي إلغاء ضغط عوامل النسخ المستقرة بالإيثيلين (EIN3 / EIL1) إلى تآزر إشارات الجاسمونيت والإيثيلين في نبات الأرابيدوبسيس. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية. 2011 ، 108: 12539-12544. 10.1073 / pnas.1103959108.

Lingam S و Mohrbacher J و Brumbarova T و Potuschak T و Fink-Straube C و Blondet E و Genschik P و Bauer P: التفاعل بين عامل النسخ bHLH FIT و ETHYLENE INSENSITIVE3 / ETHYLENE INSENSITIVE3-LIKE1 يكشف عن تنظيم الارتباط الجزيئي للحديد وإشارات الإيثيلين في نبات الأرابيدوبسيس. الخلية النباتية. 2011 ، 23: 1815-1829. 10.1105 / tpc .111.084715.

يتعاون كل من Zhong S و Zhao M و Shi T و Shi H و An F و Zhao Q و Guo H: EIN3 / EIL1 مع PIF1 لمنع الأكسدة الضوئية ولتعزيز خضرة شتلات نبات الأرابيدوبسيس. بروك ناتل أكاد علوم الولايات المتحدة الأمريكية. 2009 ، 106: 21431-21436. 10.1073 / pnas.0907670106.

Chen MK، Hsu WH، Lee PF، Thiruvengadam M، Chen HI، Yang CH: يعمل جين صندوق MADS ، FOREVER YOUNG FLOWER ، كمثبط للتحكم في شيخوخة الأعضاء الزهرية وانفصالها في نبات الأرابيدوبسيس. مصنع J. 2011 ، 68: 168-185. 10.1111 / j.1365-313X.2011.04677.x.

تشاك جي ، هاك S: تنظيم التحولات التنموية. Biol النبات بالعملة. 2005 ، 8: 67-70. 10.1016 / j.pbi.2004.11.002.


ما هو المروج

المروج هو أحد العناصر التنظيمية الرئيسية للجين الذي يبدأ النسخ. يقع بالقرب من الجين ، في المنبع لتسلسل الكودون. يمكن أن يكون حجم المروج 100-1000 نقطة أساس. توفر تسلسلات DNA المحددة التي تسمى عناصر الاستجابة مواقع ربط أولية لكل من RNA polymerase وعوامل النسخ التي توظف RNA polymerase. بوليميراز RNA هو الإنزيم المسؤول عن النسخ ، بلمرة نيوكليوتيدات RNA التكميلية لتكوين جزيء mRNA.

الشكل 2: المروج

يمكن أن يرتبط بوليميراز الحمض النووي الريبي البكتيري المرتبط بعامل سيغما بالمحفز. عامل سيجما هو عامل بدء النسخ الجرثومي. في حقيقيات النوى ، يجب ربط حوالي 7 عوامل نسخ قاعدية مختلفة بالمحفز لتجنيد بوليميريز الحمض النووي الريبي.


العلاقة بين تسلسل المحفز وقوته في التعبير الجيني

قوة المروج ، أو النشاط ، مهم في الهندسة الوراثية والبيولوجيا التركيبية. يمكن إعادة استخدام المحفز التأسيسي الذي يتمتع بقوة معينة لواحد معين من الحمض النووي الريبي (RNA) في أنواع أخرى من الحمض النووي الريبي (RNA). لذلك ، يتم تحديد قوة مروج واحد بشكل أساسي من خلال تسلسل النيوكليوتيدات. تتمثل إحدى الصعوبات الرئيسية في الهندسة الوراثية والبيولوجيا التركيبية في كيفية التحكم في التعبير عن بروتين معين عند مستوى معين. تتمثل إحدى الطرق المستخدمة عادةً لتحقيق هذا الهدف في اختيار مروج واحد بقوة مناسبة يمكن استخدامها لتنظيم معدل النسخ ، مما يؤدي بعد ذلك إلى المستوى المطلوب من التعبير البروتيني. لهذا الغرض ، تم حتى الآن إنشاء العديد من مكتبات المروجين تجريبياً. ومع ذلك ، فإن الطرق النظرية للتنبؤ بقوة مروج واحد من تسلسل النيوكليوتيدات الخاصة به مرغوبة. هذه الأساليب ليست فقط ذات قيمة في تصميم المروج بقوة محددة ، ولكنها مفيدة أيضًا لفهم آلية المحفز في النسخ الجيني. في هذه الدراسة ، من خلال اختبارات مختلفة ، تم تقديم نموذج نظري لوصف العلاقة بين قوة المروج وتسلسل النيوكليوتيدات. يوضح تحليلنا أن قوة المروج تتأثر بشكل كبير بمجموعات النيوكليوتيدات مع ثلاثة نيوكليوتيدات متجاورة في تسلسلها. وفي الوقت نفسه ، فإن النيوكليوتيدات في مناطق مختلفة من تسلسل المحفز لها تأثيرات مختلفة على قوة المروج. بناءً على البيانات التجريبية لـ بكتريا قولونية المروجين ، تشير حساباتنا إلى أن النيوكليوتيدات في المنطقة 10 والمنطقة 35 والمنطقة المميزة لتسلسل المروج أكثر أهمية في تحديد قوة المروج من تلك الموجودة في منطقة التباعد. مع قيم معلمات النموذج التي تم الحصول عليها عن طريق الملاءمة للبيانات التجريبية ، تم بناء أربع مكتبات مروج نظريًا للبيئات التجريبية المقابلة التي تم بموجبها قياس بيانات قوة المروج في التعبير الجيني مسبقًا.

مجردة رسومية

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


نتائج

استنفاد مشروط Lhx8 بواسطة Gdf9Cre يسبب تنشيط الجريب البدائي الهائل

أبلغنا سابقًا أن الضربة القاضية العالمية لـ Lhx8 يسبب العقم وفقدان البويضات بحلول اليوم السابع بعد الولادة (PD7) [14]. في الضربة القاضية العالمية Lhx8، الجريبات الشبيهة بالبدائية (البويضات التي يقل قطرها عن 20 ميكرومتر وتحيط بها الخلايا الحبيبية المسطحة) ، لكن البويضات لا تنمو. حيث Lhx8 يتم التعبير عنها في كل من الخلايا الجرثومية الأنثوية الجنينية وبعد الولادة ، فمن الممكن أن يكون الضربة القاضية العالمية Lhx8 يعطل المسارات الجنينية المبكرة التي تؤدي إلى نضوب البويضات بعد الولادة. لذلك قمنا بالتحقيق في وظائف ما بعد الولادة Lhx8 عن طريق توليد فأرة بالضربة القاضية مشروطة ، باستخدام floxed Lhx8 أليل (Lhx8 flx/flx ) [15] وأ Gdf9Cre الماوس المعدلة وراثيا [16]. ال Gdf9Cre سوف يتم تعطيل الجينات المعدلة وراثيا Lhx8 على وجه التحديد في البويضات البدائية. Gdf9Cre كفاءة عالية في البويضات ، وعندما تكون موجودة في أي منهما Lhx8 flx/flx أو Lhx8 flx/ - الحيوانات ، عرضت نفس النمط الظاهري للمبيض. كنا Lhx8 flx/flx Gdf9Cre لدراسة آثار Lhx8 نقص مشروط في البصيلات البدائية على نمو المبيض.

في PD7 و PD14 ، تم استنفاد بروتين LHX8 في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre حدث تنشيط المبيض والبويضات الهائل في الجريبات البدائية ، كما يتجلى في البويضات التي يصل قطرها إلى أكثر من 20 ميكرومتر دون حدوث تحول كبير في الخلايا الحبيبية المسطحة المحيطة (الشكل 1 أ-و). في PD7 ، Lhx8 flx/flx Gdf9Cre كان لدى الفئران 398 ± 53 بصيلة بدائية نشطة لكل مبيض مقارنة بـ 16 ± 2 لكل مبيض في Lhx8 flx/flx ضوابط. كان عدد البصيلات البدائية 1917 ± 23 لكل مبيض في Lhx8 flx/flx الضوابط وتم تخفيضها بشكل كبير إلى 1043 ± 119 لكل مبيض في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre الفئران (الشكل 1 ج). اكتشفنا انخفاضًا في البصيلات الأولية في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre الفئران ، مما يعني وجود كتلة في الانتقال من بصيلات بدائية نشطة إلى بصيلات أولية. كان هناك عدد ضئيل من أنواع البصيلات المتقدمة (البويضات المحاطة بطبقات متعددة من الخلايا الحبيبية) في PD7 Lhx8 flx/flx Gdf9Cre المبايض ، مقارنة مع Lhx8 flx/flx ضوابط.

تعطيل ما بعد الولادة Lhx8 يسبب التنشيط المبكر للبصيلات البدائية وفشل المبيض. أ و ب تم استخدام الأجسام المضادة لـ LHX8 للكشف عن البويضات في المبايض المثبتة لامتصاص العرق والهيماتوكسيلين والتي تم أخذها في يوم ما بعد الولادة 7 (PD7). تم اشتقاق المبايض من السيطرة (Lhx8 flx/flx ، أ) و Lhx8 الضربة القاضية المشروطة (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre، ب) الفئران. رؤوس الأسهم في ال أقحم من اللوحة A تشير إلى الجريبات البدائية التي تلطخ بالأجسام المضادة لـ LHX8 (إشارة بنية). رؤوس الأسهم في ال أقحم في اللوحة B تظهر بصيلات بدائية نشطة (بويضات أكبر من 20 ميكرومتر بدون خلايا حبيبية مكعبة). د, ه, ز و ح تلطيخ الحمض الدوري - شيف (PAS) للمبيضين PD14 (D و E) و PD21 (G و H) المشتق من التحكم (D و G) و Lhx8 الفئران بالضربة القاضية المشروطة (E و H). رؤوس الأسهم في ال أقحم تشير اللوحات D و E إلى بصيلات بدائية نشطة بدائية. ج, F و أنا التحديد الكمي لأنواع بصيلات المبيض في Lhx8 flx/flx و Lhx8 flx/flx Gdf9Cre الفئران. تم تضمين خمسة أزواج من المبايض من PD7 (C) و PD14 (F) و PD21 (I) في البارافين وتم تقسيمها بشكل متسلسل بسمك 5 ميكرون ، وتم حساب البصيلات. تقوم الأجسام المضادة لـ NOBOX بتلطيخ نوى البويضات طوال عملية تكوين الجريبات ، وقد تم استخدامها لتحديد البويضات في حساباتنا. تم عد كل قسم خامس. سجلنا الجريبات البدائية (PF) ، والبصيلات البدائية النشطة (Act. PF ، قطر البويضة أكبر من 20 ميكرومتر بدون الخلايا الحبيبية المكعبة) ، والبصيلات الأولية (PrF) والبصيلات الثانوية / الغارية (SF / AF). *ص & lt 0.05 **ص & لتر 0.01. أشرطة مقياس: 100 ميكرومتر (A ، B ، D ، E ، G و H) 20 ميكرومتر (أقحم في A و B و D و E)

في PD14 ، Lhx8 flx/flx Gdf9Cre احتوت المبايض على 847 ± 82 بصيلة بدائية نشطة لكل مبيض ، مقارنة بـ 15 ± 7 لكل مبيض في Lhx8 flx/flx ضوابط. انخفض عدد البصيلات البدائية بشكل كبير من 1753 ± 204 بوصة Lhx8 flx/flx ضوابط 353 ± 58 بوصة Lhx8 flx/flx Gdf9Cre المبايض (الشكل 1f). بحلول PD21 ، انخفض العدد الإجمالي للبصيلات من البدائية إلى الثانوية بشكل كبير في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre المبيض (الشكل 1 ز -1). بحلول PD35 ، بالكاد كان هناك أي بويضات وبصيلات تم اكتشافها في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre المبيض (انظر الملف الإضافي 1: الشكل S1C) و Lhx8 flx/flx Gdf9Cre كانت الإناث عقيمة (انظر الملف الإضافي 2: الشكل S2A). تظهر دراساتنا أن تعطيل ما بعد الولادة Lhx8 داخل بويضات الجريبات البدائية يؤدي إلى تنشيط هائل للبويضات ، وفصل تنشيط البويضات عن تحول الخلايا الجسدية ، وموت البويضات ، والعقم.

يتفاعل LHX8 مع مسار PI3K-AKT

قمنا بفحص تعبير الحمض النووي الريبي للجينات التي تشفر أعضاء مهمين في مسارات PI3K-AKT-mTOR في PD7 Lhx8 flx/flx Gdf9Cre البويضات. تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الحقيقي (PCR) لم يكشف عن تغييرات كبيرة في التعبير عن Pten, أكت, Foxo3, PDK1, متور, روبية 6, Deptor, ريكتور، أو Tsc1/2 (بعضها موضّح في الشكل 2). تشير هذه النتائج إلى أن LHX8 لا يؤثر بشكل مباشر على نسخ مجموعة فرعية من الجينات المعروفة بتشفير البروتينات في مسارات PI3K-AKT-mTOR. ثم قمنا بتقييم ما إذا كان مسار PI3K-AKT قد تم تنشيطه على مستوى البروتين في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre البويضات. AKT هو بروتين كيناز سيرين / ثريونين المحدد الذي يلعب دورًا رئيسيًا في موت الخلايا المبرمج و PFA. ينشط AKT الفسفوري مسارات متعددة في اتجاه مجرى النهر ، بما في ذلك فسفرة FOXO3 ، مما يؤدي إلى تنشيط البويضات [8]. أظهرت تحليلات اللطخة الغربية على البويضات من مبيض PD7 أن فسفرة AKT في موقعين ، S473 و T308 ، كانت أعلى في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre البويضات من الضوابط (الشكل 2 ح). ولكن من المثير للاهتمام ، أنه تم اكتشاف p-AKT (T308) فقط في البصيلات البدائية المنشطة (انظر الملف الإضافي 3: الشكل S3).

يتم تنشيط AKT في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre البويضات. أز تم عزل البويضات من سيطرة PD7 (Lhx8 flx/flx و Ctrl) و Lhx8 flx/flx Gdf9Cre (G9cKO) تم استخراج مبيض الفأر والحمض النووي الريبي لتحويل (كدنا) وتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR). تم تطبيع البيانات ل جابده التعبير وتعطى كمتوسط ​​الكمية النسبية (مقارنة بالتحكم) ، مع أشرطة الخطأ التي تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. تلاميذ ر- تم استخدام الاختبار لحساب ص القيم. لوحظ الاختلاف الوحيد المهم في التعبير عن Lhx8، كما هو متوقع. ** ص & لتر 0.01. ح تم عزل البويضات من سيطرة PD7 و Lhx8 flx/flx Gdf9Cre تم استخلاص المبيضين والبروتين وأجري اختبار لطخة غربية على ثلاث عينات مستقلة ، باستخدام الأجسام المضادة ضد AKT وشكليها الفسفوري (S473 و T308). تم استخدام نشاط المناعة هيستون H3 كعنصر تحكم

أظهرت الدراسات السابقة ارتباط FOXO3 بالانتقال الخلوي النووي و rpS6 الفسفرة عبر مسارات PI3K-AKT-mTOR مع PFA [5 ، 6 ، 8]. قمنا بفحص FOXO3 الإزاحة النووية و rpS6 الفسفرة في PD7 Pten و Lhx8 الضربات القاضية الشرطية (الشكل 3 وملف إضافي 4: الشكل S4). كان الإزاحة FOXO3 nucleocytoplasmic بارزة في البويضات التي يزيد حجمها عن 30 ميكرومتر ولكنها لم تظهر انتقالًا واضحًا بين البويضات بين 20 و 30 ميكرومتر في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre الفئران (الشكل 3d – f، f '، p). بويضات الجريبات البدائية في Pten و Lhx8 الضربات القاضية المفردة الشرطية وكذلك الضوابط المقابلة لم تُظهر إزفاء FOXO3 nucleocytoplasmic. ومع ذلك ، تم إحداث إزاحة FOXO3 nucleocytoplasmic بشكل كبير في البويضات البدائية (& lt20 ميكرومتر) (الشكل 3j – l ، l '، p) من PD7 مزدوج Lhx8/Pten الضربات القاضية المشروطة (Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre). تشير هذه البيانات إلى عمل تآزري لبروتينات LHX8 و PTEN على الانتقال FOXO3 nucleocytoplasmic.

Lhx8 و Pten تأثيرات الضربة القاضية المشروطة على توطين FOXO3. أج الفئران في السيطرة (Lhx8 flx/flx ) ، يتم التعبير عن FOXO3 في النواة والسيتوبلازم للبويضات البدائية (PF ، السهام في ج'). دF في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre الفئران ، لم يتم ملاحظة الانتقال الواسع النطاق للنيوكليوتوبلازم في بصيلات بدائية نشطة بين 20 و 30 ميكرومتر (aPF ، سهم في F') ولكن لوحظ في بصيلات بدائية نشطة أكبر من 30 ميكرومتر (aPF ، سهم في F '). دأنا يوجد نمط تعبير مشابه لتعريب FOXO3 في Pten الضربة القاضية المشروطة (Pten flx/flx Gdf9Cre) الفئران. ال السهام في أنا'تمثل الجريبات البدائية (PF) مع كل من التعبير النووي والسيتوبلازم عن FOXO3 وتعبير السيتوبلازم عن FOXO3 في بصيلات بدائية نشطة (aPF) أقل من 30 ميكرومتر. يل ومع ذلك ، في الفئران التي تعاني من نقص مشروط في كليهما Lhx8 و Pten (Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre) ، FOXO3 الإزاحة النوى هي موجودة في البويضات البدائية والمنشطة والأولية. التحكم السلبي هو التألق المناعي في وجود الأجسام المضادة الثانوية ويظهر في ما. ال مناطق محاصر تظهر في C و F و I و L و O مكبرة في C 'و F' و I 'و L' و O '. ص تمثيل رسومي لتوزيع FOXO3 (السيتوبلازم فقط أو النواة والسيتوبلازم). تم تجميع البويضات حسب الحجم (القطر) على أنها أقل من 20 ميكرومتر ، بين 20 و 30 ميكرومتر ، وأكبر من 30 ميكرومتر. تم حساب البويضات التي تحتوي على تلطيخ نووي واضح DAPI فقط. أشرطة المقياس: 50 ميكرومتر (A – C ، D – F ، G – I ، J – L ، M – O) 20 ميكرومتر (C '، F' ، I '، L' ، O ')

قمنا أيضًا بفحص تأثيرات مضاعفة Pten و Lhx8 نقص في rpS6. يعزز mTORC1 ترجمة البروتين ونمو الخلايا ، جزئيًا ، من خلال تنشيط S6K1 (عن طريق فسفرة ثريونين 389) ومن خلال الفسفرة وتعطيل البروتينات المرتبطة بـ eIF4E. S6K1 مسؤول عن الفسفرة وتفعيل rpS6 ، مما يؤدي إلى تحسين ترجمة البروتين والتكوين الحيوي للريبوسوم. تحت السيطرة، Lhx8 flx/flx Gdf9Cre، و Pten flx/flx Gdf9Cre المبايض ، تم تنشيط rpS6 بشكل كبير فقط في بصيلات النمو في PD7 (انظر الملف الإضافي 4: الشكل S4). ومع ذلك ، فإن PD7 Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre أظهر المبايض تنشيطًا كبيرًا لـ rpS6 في البويضات البدائية (& lt20 ميكرومتر) (انظر الملف الإضافي 4: الشكل S4D ، D '). تشير هذه النتائج كذلك إلى أن Lhx8 و Pten تتفاعل المسارات بشكل تآزري لتسريع حدثين مرتبطين بـ PFA - إزفاء FOXO3 nucleocytoplasmic و فسفرة rpS6.

لين 28 أ يتم تنظيم تعبير الحمض النووي الريبي والبروتين في البويضات Lhx8flx / flxGdf9Cre

LHX8 هو عامل نسخ ، ونتوقع أن يكون تأثيره الرئيسي على مستوى RNA. لذلك قمنا بتحليل نسخة Lhx8 flx/flx Gdf9Cre المبايض عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية (RNA-seq). قمنا بتسلسل 180 مليون علامة في كل عينة وقارننا الوفرة النسبية لعلامات RNA المشفرة بواسطة الجينات في مسارات PI3K-AKT-mTOR المستمدة من PD7 Lhx8 flx/flx Gdf9Cre والتحكم في المبايض. لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في تعبير RNA لجينات مسار PI3K-AKT-mTOR (Pik3r1, Pik3ca, عدة, كيتل, Gsk3b, سدند 1, Wee1, كدكن 1 أ/ب, راب, Mlst8, Mapkap1, برنامج Prr5، و Eif4ebp1) واضحًا في تجربة RNA-seq (انظر الملف الإضافي 5: الجدول S1).

بالإضافة إلى تحليل التعبير عن جينات PI3K-AKT-mTOR المعروفة ، درسنا الاختلافات العالمية في نسخة من Lhx8 flx/flx Gdf9Cre والتحكم في المبايض. اكتشفنا زيادة ستة أضعاف في لين 28 أ نصوص RNA بتنسيق Lhx8 flx/flx Gdf9Cre مقارنة بمبايض التحكم (الشكل 4 ب والملف الإضافي 5: الجدول S1). أظهر التألق المناعي وتحليل اللطخة الغربية باستخدام الأجسام المضادة لـ LIN28A أنه تم التعبير عن بروتين LIN28A بمستوى أعلى بشكل ملحوظ في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre البويضات مقارنة بالضوابط (الشكل 4 أ ، ج).

Lhx8 يقمع لين 28 أ التعبير. أ يُظهر التألق المناعي مع الأجسام المضادة لـ LIN28A أنه يتم التعبير عن LIN28A بشكل تفضيلي في البويضات داخل المبيض. الوفرة LIN28A أعلى في Lhx8 البويضات الناقصة مشروطًا (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre) مقارنة بالضوابط (Lhx8 flx/flx ). ب و ج لين 28 أ يتم التعبير عن النصوص والبروتين بدرجة أكبر بشكل ملحوظ في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre البويضات (G9cKO) على عكس الضوابط (Ctrl). أF مقايسات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) مع الأجسام المضادة المنقاة ذات التقارب LHX8 على البويضات. د تم تحديد موقع ربط LHX8 DNA المفترض ، TGATTG [22] ، والذي يناسب تمامًا تسلسل إجماع ربط LHX8 ، في الموضع −536 إلى −531 بالنسبة إلى لين 28 أ موقع بدء النسخ. ه ترسب الأجسام المضادة لـ LHX8 الحمض النووي الجيني الذي يحتوي على تسلسل ربط TGATTG من لين 28 أ منطقة المروج كما هو موضح بواسطة ChIP-Quantitative PCR (qPCR). تم استخدام الأجسام المضادة للجلوبيولين المناعي G (IgG) كعنصر تحكم. يتم استخدام طريقة إدخال النسبة المئوية لتحليل بيانات qPCR. "الإدخال" هو منتج PCR من كريات الكروماتين قبل الترسيب المناعي. متوسط ​​ثلاث نسخ ط تم تطبيعه لمدخل معدل تم استخدامه لحساب النسبة المئوية للمدخلات. تم استخدام مجموعتين من البادئات (F1 و R1) و (F2 و R2) لأداء ChIP-qPCR. F تضخيم PCR لدنا إدخال البويضة ، وكذلك الحمض النووي المترسب بواسطة IgG لخنزير غينيا الطبيعي والأجسام المضادة لـ LHX8 بواسطة مجموعات التمهيدي F1 / R1 و F2 / R2. أشرطة مقياس: 50 ميكرومتر (أ)

LIN28A هو بروتين مرتبط بالـ RNA يمنع التكوُّن الحيوي لـ يترك-7 microRNAs ومنظم معروف لحجم الجسم والتمثيل الغذائي في الثدييات ، بما في ذلك بداية الحيض [17 ، 18]. لين 28 أ يتم التعبير عنها بشكل تفضيلي في البويضات والخلايا الجذعية الجنينية [19 ، 20]. علاوة على ذلك ، يمكن تنشيط مسارات PI3K-AKT-mTOR بواسطة LIN28A [21]. لذلك ، قد يلعب LIN28A دورًا في تنشيط البويضات ونموها.

يمكن أن يرتبط LHX8 مباشرة بعنصر ربط الحمض النووي LHX8 في لين 28 أ المروجين

اختبرنا ما إذا كان LHX8 يمكنه الارتباط بملف لين 28 أ المروجين. LHX8 عبارة عن منظم نسبي LIM خاص بالبويضات ومن المتوقع أن يربط الحمض النووي. أظهرت دراسة سابقة أن المجال المنزلي LHX8 يربط بشكل تفضيلي عنصر TGATTG DNA [22]. حددنا عزر DNA واحد TGATTG −531 إلى −536 نقطة أساس في المنبع لموقع بدء النسخ المفترض في لين 28 أ الجين (الشكل 4 د). ال لين 28 أ يتم حفظ شكل TGATTG في الثدييات الأخرى ، بما في ذلك البشر. أجرينا تجربة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) على البويضات من النوع البري ، وذلك باستخدام أجسامنا المضادة شديدة التحديد والمتقاربة المضادة لـ LHX8 [13]. الأجسام المضادة لـ LHX8 تفضي إلى مناعة لين 28 أ جزء من DNA المروج الذي يحتوي على عزر TGATTG (الشكل 4 هـ ، و). تشير هذه البيانات كذلك إلى أن LHX8 يقمع لين 28 أ التعبير عن طريق الارتباط المباشر بـ لين 28 أ المروجين.

لين 28 أ ينقذ نقص جزئيًا Lhx8 flx/flx Gdf9Cre النمط الظاهري

تشير بياناتنا إلى أن LHX8 يقمع لين 28 أ التعبير. نظرًا لأن LIN28A عامل معزز للنمو [17 ، 23] يتم التعبير عنه بشكل تفضيلي في البويضات ، فقد افترضنا أن لين 28 أ نقص سوف ينقذ Lhx8 flx/flx Gdf9Creالناجم عن PFA. تربينا لين 28 أ و Lhx8 الفئران مع floxed Gdf9Cre لتوليد Lhx8/لين 28 أ الضربات القاضية المزدوجة الشرطية (Lhx8 flx/flx لين 28 أ flx/flx Gdf9Cre).

أجرينا تحليلات مورفومترية المبيض لتحديد آثار الضربة القاضية المزدوجة على PFA. لم يلاحظ أي اختلاف شكلي بين لين 28 أ flx/flx Gdf9Cre وإناث التحكم في PD7 (الشكل 5 أ ، ج ، هـ). كما هو متوقع ، لاحظنا عددًا أقل بكثير من البصيلات البدائية النشطة في Lhx8 flx/flx لين 28 أ flx/flx Gdf9Cre مقارنة ب Lhx8 flx/flx Gdf9Cre المبايض ، لكنها لم تكن طبيعية تمامًا مقارنةً بمجموعة التحكم (الشكل 5 أ ، ب ، د ، و).

لين 28 أ عمليات إنقاذ النقص Lhx8 flx/flx Gdf9Creالناجم عن PFA. أد الأنسجة التمثيلية للسيطرة (Lhx8 flx/flx ), Lhx8 الضربة القاضية المشروطة (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre), لين 28 أ الضربة القاضية المشروطة (لين 28 flx/flx Gdf9Cre) ومضاعفة Lhx8/لين 28 أ الضربة القاضية المشروطة (Lhx8 flx/flx لين 28 flx/flx Gdf9Cre) المبايض. مزدوج Lhx8/لين 28 أ تظهر الضربة القاضية الشرطية عددًا أقل من البصيلات البدائية النشطة. تم استخدام الأجسام المضادة لـ Nobox لتسمية نوى البويضات (بني غامق). PF: الجريب البدائي aPF: الجريب البدائي المنشط. ه ال لين 28 flx/flx Gdf9Cre تمتلك الفئران (Lin28G9cKO) نمطًا ظاهريًا مشابهًا للفئران الضابطة (Ctrl) ويتم التعبير عن عدد البصيلات البدائي كنسبة مئوية من إجمالي البصيلات. F التحكم الكمي للبصيلات البدائية المنشطة في السيطرة ، Lhx8 شرطي ومزدوج Lhx8/لين 28 أ الضربات القاضية المشروطة. يتم عرض النسبة المئوية للبصيلات البدائية (PF) والبصيلات البدائية المنشطة (aPF). ثلاثة أزواج من المبايض من Lhx8 الضربة القاضية الشرطية والمزدوجة Lhx8/لين 28 أ تم تقسيم الفئران بالضربة القاضية الشرطية بشكل متسلسل ، وتم حساب كل قسم خامس. ز تتضاءل فسفرة AKT في الضعف Lhx8/لين 28 أ الضربات القاضية المشروطة. قمنا بتحديد الكمية بواسطة تعبير p-AKT (T308) الفلوري في البصيلات البدائية البدائية والمنشطة Lhx8 flx/flx Gdf9Cre (G9cKO) و Lhx8 flx/flx لين 28 أ flx/flx Gdf9Cre (G9dKO) المبايض عند PD7. كان هناك انخفاض كبير في فسفرة AKT في Lhx8 flx/flx لين 28 أ flx/flx Gdf9Cre الجريبات البدائية البدائية والمنشطة مقارنة بـ Lhx8 flx/flx Gdf9Cre. تلاميذ ر- تم استخدام الاختبار لحساب ص القيم. *ص & lt 0.05 **ص & لتر 0.01. أشرطة مقياس: 50 ميكرومتر (A – D)

الإنقاذ الجزئي لـ Lhx8 flx/flx Gdf9Creالناجم عن PFA بواسطة لين 28 أ نقص يقول ذلك لين 28 أ هو منظم لنمو البويضات. تناقص عدد البصيلات البدائية النشطة في Lhx8 flx/flx لين 28 أ flx/flx Gdf9Cre تشير المبايض إلى أن تنشيط مسار AKT يتضاءل أيضًا. قمنا بتقييم إشارة p-AKT (T308) في البصيلات البدائية البدائية والمنشطة لـ Lhx8 flx/flx لين 28 أ flx/flx Gdf9Cre و Lhx8 flx/flx Gdf9Cre المبيضين (الشكل 5 ز) ووجدوا أن تعبيره انخفض بشكل ملحوظ في Lhx8 flx/flx لين 28 أ flx/flx Gdf9Cre المبيض مقارنة بمبيضي Lhx8 flx/flx Gdf9Cre الفئران.

Lhx8 ينظم انتقال الجريب الأولي إلى الثانوي

أظهرت الدراسات السابقة أن المسارات التي تنظمها PTEN مهمة في تنشيط البويضات البدائية ، ولكن ليس في البويضات الأولية [24]. درسنا دور Lhx8 في البويضات الأولية عن طريق توليد Lhx8 flx/flx Zp3Cre الفئران. Zp3Cre يتم التعبير عنها على وجه التحديد في البويضات الأولية ، و Lhx8 flx/flx Zp3Cre تستمر المبايض في التعبير عن LHX8 في البويضات البدائية ، ولكن ليس الأولية. كشفت التحليلات المورفومترية أن Lhx8 flx/flx Zp3Cre لم تختلف المبيضين بالضربة القاضية المشروطة اختلافًا كبيرًا عن Lhx8 flx/flx (التحكم) الفئران عند PD0 و PD7 (الشكل 6 أ-و). ومع ذلك ، في PD14 ، أحصينا 159 ± 23 جريبًا أوليًا و 29 ± 7 بصيلات ثانوية / غارية لكل مبيض في Lhx8 flx/flx Zp3Cre الفئران ، مقارنة بـ 79 ± 6 بصيلات أولية و 108 ± 7 بصيلات ثانوية / غارية لكل مبيض في الفئران الضابطة (الشكل 6 ز -1). الزيادة النسبية للبصيلات الأولية في PD14 والانخفاض النسبي للبصيلات متعددة الطبقات في Lhx8 flx/flx Zp3Cre أشار المبيض إلى أن الانتقال من البصيلات الأولية إلى البصيلات الثانوية كان مسدودًا ، وهو ما يتوافق مع الملاحظة في Lhx8 flx/flx Gdf9Cre الفئران (الشكل 1f). في PD21 و PD30 ، لاحظنا أن العديد من البصيلات الأولية كانت خالية من البويضات (الشكل 6 ك ، ن). لقد قمنا بتلوين LIN28A في PD21 المبايض ووجدنا أن LIN28A تم التعبير عنه بقوة في Lhx8 البويضات الناقصة في Lhx8 flx/flx Zp3Cre المبيض ، ولكن لم يتم الكشف عن أي تعبير في البصيلات الفارغة (انظر الملف الإضافي 6: الشكل S5). ومع ذلك ، باستثناء هذه البصيلات الأولية الفارغة ، فإن عدد البصيلات الأولية بين مجموعة التحكم و Lhx8 flx/flx Zp3Cre لم يكن هناك اختلاف كبير في المبايض عند PD21 أو PD30 (الشكل 6 لتر ، س). بالنسبة للبصيلات الثانوية / الغارية ، انخفض الرقم بشكل حاد إلى 17 ± 3 في PD21 وإلى 2 ± 1 عند PD30 في Lhx8 flx/flx Zp3Cre المبايض ، مقارنة بـ 170 ± 2 و 104 ± 4 ، على التوالي ، في الفئران الضابطة. تشير هذه النتائج إلى أن تجمع البصيلات المتنامي استمر في القضاء عليه من Lhx8 flx/flx Zp3Cre الفئران. Lhx8 flx/flx Zp3Cre كانت الفئران عقيمة (انظر الملف الإضافي 2: الشكل S2A) وعلاج الإباضة Lhx8 flx/flx Zp3Cre لم تنتج الفئران البويضات (انظر الملف الإضافي 2: الشكل S2B). كانت هذه النتيجة متوافقة مع الانخفاض الحاد في البصيلات الثانوية / الغارية في Lhx8 flx/flx Zp3Cre المبيض في PD21. مجتمعة ، تظهر هذه البيانات أن تكوّن الجريبات من Lhx8 flx/flx Zp3Cre يتم حظر الفئران في الانتقال من مرحلة الجريب الابتدائية إلى المرحلة الثانوية وينتج عن ذلك موت البويضات الأولية والعقم. The relative stability of the primordial follicle pool from PD14 to PD30 suggests that the PFA into primary follicles was not affected by the diminution in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries.

Lhx8 inactivation in primary follicles (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) abolishes follicle growth. Histomorphological analysis was done on control (Lhx8 flx/flx ) و Lhx8 deficient ovaries (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) at various stages of postnatal ovarian development ranging from newborn (PD0) to postnatal day 30 (PD30). أF Periodic acid–Schiff (PAS) staining and counting of different follicle types in the newborn and PD7 ovaries showed no significant differences between control and Lhx8 deficient ovaries. زا Anti-NOBOX antibodies were used to stain oocytes (brown immunoreactivity) in ovaries from PD14 (G and H), PD21 (J and K), and PD30 (M and N) mice. At PD14, the Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries showed a significantly higher number of primary follicles (PrF) and significantly diminished number of secondary/preantral (SF/AF) follicles characterized by two or more layers of granulosa cells. At PD21 and PD30, the primary follicle pool did not differ significantly between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries however, there was a marked decrease in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in conditional knockouts including degenerating follicles without oocytes (marked by asterisks في insets in K and N). The primordial follicle (PF) pool remained relatively stable between PD14 and PD30, with no significant difference between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries. **ص & لتر 0.01. Scale bars: 100 μm (A, B, D, and E) 200 μm (G, H, J, K, M, and N) 50 μm (insets of K and N)


Tetracycline-inducible Empty Backbones

Find a construct that will allow you to insert and induce your gene of interest.

هوية شخصية بلازميد وصف Co-expressed tTA, rtTA, or TetR On or Off بي
21916 Tet-pLKO-neo 3rd generation lentiviral plasmid for inducible expression of shRNA neomycin selection plasmid 21915 has puromycin selection TetR تشغيل Wiederschain
41393 pCW57.1 Lentiviral vector for inducible expression for Gateway cloning selection cassette in format: PGK-rtTA-2A-puro see article for tagged insert options rtTA تشغيل جذر
11651 pLVUT-tTR-KRAB Lentiviral vector for inducible expression of transgene or shRNA see article for detailed information about cloning and additional plasmids tetR-KRAB تشغيل Aebischer & Trono
16542 pBI-MCS-EGFP Expression of your gene of interest (MCS with a &beta-globin poly A) & EGFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA لا أحد تشغيل Vogelstein
25735 pSLIK-Neo Lentiviral vector for inducible expression of a miR-shRNA selection cassette in format: rtTA3+IRES+Neo see article for additional selection options third-generation rtTA تشغيل فريزر
44012 pInducer20 Lentiviral vector for shRNA expression see article for additional tookit plasmids third-generation rtTA تشغيل Elledge
19407 pTREtight2 Promoter contains a modified TRE that is silent in absence of binding tTA or rTA has high copy E. coli origin لا أحد إما Ralser
64238 pTet-IRES-EGFP Lentiviral plasmid for inducible expression of transgene of interest and EGFP لا أحد إما رئة
11662 pPRIME-TET-GFP-FF3 Lentiviral, miRNA expression (PRIME) system for application in knockdown of gene expression at a single copy in mammalian cells Expresses firefly luciferase hairpin and GFP under pTREtight promoter لا أحد إما Elledge
35625 pAAV-Ptet-RFP-shR-rtTA AAV shRNA cloning vector for evaluation of shRNA efficacy using fluorescence use with pGFPns-reporter for cDNA target rtTA تشغيل قو
60495 pSBtet-GP Sleeping Beauty transposon system has luciferase in cloning site see article for additional selection and FP option rtTA تشغيل Kowarz
16623 pBI-GFP Expression of your gene of interest & GFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA لا أحد إما Vogelstein
100521 pCW57.1-MAT2A Lentiviral Tet-Off all in one plasmid derived from pCW57.1. rtTA was replaced with tTA, and Puromycin was replaced with Blasticidin selection. Please NOTE, this vector contains an insert (MAT2A) which would need to be replaced by the gene of interest. tTA اطفء Sabatini
92099 AAVS1_Puro_Tet3G_3xFLAG_Twin_Strep Bidirectional promoter controls expression of gene of interest with Strep-Tag and Tet-On 3G transactivator, creating an auto-regulated Tet-On 3G System. Contains homology arms for integration into AAVS1 Genomic Safe Harbor Locus. Tet-On 3G تشغيل Doyon
58245 pGLTR-X-GFP Single vector lentiviral Gateway RNAi system for conditional cell line generation contains expression cassette for TetR-P2A-GFP see article for additional constructs TetR تشغيل Geley


مثال 4

In experiments using بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية cells grown in culture, intracellularly expressed ssJT01ss bound to and inhibited a specific essential cellular target in a manner similar to that of an antimicrobial drug. Hence induction of expression of this peptide during an infection should have the effect of an antibiotic. An established animal infection model was used to test this concept (Onyegji, C. O. et al., عوامل مضادات الميكروبات والعلاج الكيميائي 38:112-117, 1994).

Six groups of CD-1 female mice (5 mice per group, Charles River Laboratories, Wilmington, Ma.) weighing 20-24 grams were used in this experiment. The inoculum was prepared from CYL316tt/pC 3 883 (encoding a ssJT01ss peptide-GST fusion protein under the control of the tet operon) which was cultured at 37° C. for 17 hours in TS broth containing erythromycin and kanamycin. 1.6×10 10 cfu (colony-forming units) of بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية CYL316tt/pC 3 883 (OD 600 of 0.1=10 8 cfu/ml) from the overnight culture were diluted to 20 ml with 0.01 M PBS (Sigma P-0261) containing 8% hog gastric mucin (Sigma M-2378) as well as 50 μg/ml kanamycin and 10 μg/ml erythromycin. Each mouse of groups 1 through 4 was injected with 0.5 ml of the inoculum intraperitoneally (i.p.), equivalent to 4×10 8 cfu/mouse (lethal dose). Groups 5 and 6 served as vector controls. Each mouse of these two groups was injected with 4×10 8 cfu of CYL316tt/pC 3 875, which was cultured and processed the same way as CYL316tt/pC 3 883. One half hour and four hours after the inoculation, groups 1 and 5 received a saline injection i.p. at 10 ml/kg groups 2 and 6 received i.p. injections of tetracycline (Sigma T-3383) at 8 mg/kg group 3 received i.p. injections of tetracycline at 4 mg/kg group 4 received i.p. injections of ciprofloxacin (Bayer 851510, dissolved in water) at 50 mg/kg. The injection volume for all the animals was 10 ml/kg. Surviving mice were counted at 7 days post inoculation. Ciprofloxacin given at 50 mg/kg protected all infected animals from lethal infection.

The data summarized in Table 2 demonstrate that induction of intracellular expression of the ssJT01ss peptide can be achieved in an animal infection. تثبيط بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية MetRS by the intracellularly expressed ssJT01ss peptide cured a lethal infection in a mouse model.

TABLE 2
تثبيط بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية growth in mice by intracellular production
من بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية MetRS inhibitor
# of Mice# of Mice
Experimental ConditionTestedنجاة
M1 Peptide
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C255
Expression Control
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C250

The relevant teachings of all references cited herein are hereby incorporated by reference herein in their entirety.

While this invention has been particularly shown and described with references to preferred embodiments thereof, it will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.

28 1 33 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 1 acgggtcgac tcatatcttt tattcaataa tcg 33 2 32 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 2 ccggaaagct tacttattaa ataatttata gc 32 3 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 3 taagtaagct taaggaggaa ttaatgatgt ctag 34 4 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 4 acgggtcgac ttaagaccca ctttcacatt taag 34 5 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 5 ctcggtaccg agctaaaatt cggaggcata tcaaatgagc tctgg 45 6 44 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 6 ggcatatcaa atgagctctg gaggtggagg catgtcccct atac 44 7 31 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 7 aggcctaggt taatccgatt ttggaggatg g 31 8 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 8 ctgatccgaa tacgtggcag ttgcggtggc ctatgcatag ct 42 9 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 9 atgcataggc caccgcaact gccacgtatt cggatcagag ct 42 10 48 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 10 tcgagttcat gaaaaactaa aaaaaatatt gacatcccta tcagtgat 48 11 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 11 agagataatt aaaataatcc ctatcagtga tagagagctt gcatg 45 12 29 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 12 caagctctct atcactgata gggattatt 29 13 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 13 ttaattatct ctatcactga tagggatgtc aatatttttt ttagtttttc atgaac 56 14 58 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 14 aataaaaaac tagtttgaca aataactcta tcaatgatag agtgtcacaa aaaggagg 58 15 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 15 gatagagtgt caacaaaaag gaggaattaa tgatgtcccc tatactaggt tattgg 56 16 36 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 16 ggattaaggt aaccttaatc cgattttgga ggatgg 36 17 12 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 17 Asp Pro Asn Thr Trp Gln Leu Arg Trp Pro Met His 1 5 10 18 6 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 18 Gly Gly Arg Gly Gly Met 1 5 19 54 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 19 gatcctaata catggcagtt gaggtggcct atgcatggcg gccgcggagg tatg 54 20 66 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 20 agctctgatc ctaatacatg gcagttgagg tggcctatgc attcttcagg cggccgcgga 60 ggtatg 66 21 21 PRT Artificial Sequence peptide 21 Ser Arg Trp Glu Lys Tyr Ile Asn Ser Phe Glu Leu Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 22 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 22 tctagatggg aaaaatatat taattctttt gaattagatt ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 23 21 PRT Artificial Sequence peptide 23 Ser Ser Gln Gly Thr Met Arg Trp Phe Asp Trp Tyr Arg Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 24 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 24 agctctcaag gtactatgag atggtttgat tggtatagat ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 25 49 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 25 agcaccttgg cggccgcgga ggtgctagca aaggagaaga actcttcac 49 26 37 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 26 aactgaggta acctcagttg tacagttcat ccatgcc 37 27 52 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 27 tttaccttgg cggccgcgga ggtaaactga agaaggtaaa ctggtaatct gg 52 28 40 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 28 acttagggta accttaagtc tgcgcgtctt tcagggcttc 40


Identification of the Omega4514 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus that is transcribed in vitro by the major vegetative RNA polymerase

Omega4514 is the site of a Tn5 lac insertion in the Myxococcus xanthus genome that fuses lacZ expression to a developmentally regulated promoter. DNA upstream of the insertion site was cloned, and the promoter was localized. The promoter resembles vegetative promoters in sequence, and sigma(A) RNA polymerase, the major form of RNA polymerase in growing M. xanthus, initiated transcription from this promoter in vitro. Two complete open reading frames were identified downstream of the promoter and before the Omega4514 insertion. The first gene product (ORF1) has a putative helix-turn-helix DNA-binding motif and shows sequence similarity to transcriptional regulators. ORF2 is most similar to subunit A of glutaconate coenzyme A (CoA) transferase, which is involved in glutamate fermentation. Tn5 lac Omega4514 is inserted in the third codon of ORF3, which is similar to subunit B of glutaconate CoA-transferase. An orf1 disruption mutant exhibited a mild sporulation defect, whereas neither a disruption of orf2 nor insertion Omega4514 in orf3 caused a defect. Based on DNA sequence analysis, the three genes are likely to be cotranscribed with a fourth gene whose product is similar to alcohol dehydrogenases. ORF1 delays and reduces expression of the operon during development, but relief from this negative autoregulation does not fully explain the regulation of the operon, because expression from a small promoter-containing fragment is strongly induced during development of an orf1 mutant. Also, multiple upstream DNA elements are necessary for full developmental expression. These results suggest that transcriptional activation also regulates the operon. Omega4514 is the first example of a developmentally regulated M. xanthus operon that is transcribed by the major vegetative RNA polymerase, and its regulation appears to involve both negative autoregulation by ORF1 and positive regulation by one or more transcriptional activators.

الأرقام

Physical map of the Ω4514…

Physical map of the Ω4514 insertion region and summary of upstream segments tested…

Developmental expression of لاكز under…

Developmental expression of لاكز under the control of the Ω4514 promoter. Developmental β-galactosidase…

Localization of an mRNA 5′…

Localization of an mRNA 5′ end within the Ω4514 upstream region. Low-resolution S1…

Primer extension analysis of Ω4514…

Primer extension analysis of Ω4514 mRNA. RNA was isolated from wild-type DK1622 cells…

Developmental expression of لاكز from…

Developmental expression of لاكز from a small segment containing the Ω4514 promoter. Developmental…

In vitro transcription from the…

In vitro transcription from the Ω4514 promoter. DNA fragments containing the Ω4514 promoter…

Western blot analysis of σ…

Western blot analysis of σ A in growing and developing م. زانثوس cells.…

تأثير orf1 و orf2…

تأثير orf1 و orf2 mutations on developmental لاكز expression under the control…

Level of ORF1 protein and…

Level of ORF1 protein and β-galactosidase specific activity during growth and development. (A)…

Sequences of promoters transcribed in…

Sequences of promoters transcribed in vitro by م. زانثوس σ A RNAP. ال…