معلومة

تمديد جزء صغير من الحمض النووي

تمديد جزء صغير من الحمض النووي



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل هناك طريقة لتمديد جزء صغير من الحمض النووي ، على سبيل المثال 150 نقطة أساس ، عن طريق عمل نسخ من نفسه وإرفاق كل نسخة من ذلك الجزء الصغير بنهاية تسلسل 150 نقطة أساس؟

على سبيل المثال ، أريد قطعة من الحمض النووي 1 كيلو بايت + مكونة من نسخ من هذا التسلسل الدقيق البالغ 150 نقطة أساس.

أقوم بإجراء اختبارات بصرية على خيوط الحمض النووي ، لكن المشكلة هي أن شظايا الحمض النووي التي أستهدفها صغيرة جدًا.

ومع ذلك ، إذا كان جزء الحمض النووي هو مجرد تسلسل متكرر لجزء الحمض النووي الذي أقوم باختباره ، فإن الاختبارات ستعطي نفس النتائج. لهذا السبب ، أحاول إنشاء خيط طويل من الحمض النووي من جزء واحد فقط من الحمض النووي يتم نسخه مرارًا وتكرارًا.

هل هناك إجراء يمكنني اتباعه لإنجاز ذلك؟


إذا كان ما تحاول الحصول عليه هو 1 كيلو بايت في الثانية من التسلسلات المتكررة 150 نقطة أساس ، فقد يكون التجميع كقطعة كبيرة فكرة أفضل. يكلف حوالي 150-300 دولار ولكنه سيوفر الكثير من الوقت. (انظر gBlock من IDT في الولايات المتحدة)

تفاعل البوليميراز المتسلسل والربط مع التسلسلات المتكررة هو ألم المؤخرة. قد يكون صحيحًا أنك توفر المال ، لكن الوقت والإحباط قد يكونان أكثر تكلفة.


نظرًا للتكلفة أو تخليق الحمض النووي ، ربما يمكنك طلب الخيطين الفرديين وتثبيتهما معًا. مهندس اثنين من إنزيم التقييد التكميلي المتدلي على التسلسل. على سبيل المثال ، في أحد طرفي المهندس الجزئي بام مرحبا الموقع وعلى الطرف الآخر المهندس أ Bgl الثاني موقع. سوف تصلب تلك الأطراف اللاصقة ولكن لا يمكن قطع منتج الربط الناتج عن طريق أي من الإنزيمين.

من خلال دورات الربط ، والهضم ، والربط بالتناوب ، يمكنك تكوين مجموعات متتالية من جزء البداية. ثم يمكنك تنقية القطع الطويلة واستنساخها بشكل فرعي في ناقل مُعد بشكل مناسب.


أقترح عليك المحاولة ربط الاتجاه العودي. من المفترض أن تفعل بالضبط ما تهدف إليه ، أي "بلمرة" الحمض النووي القصير في DNA أطول. يمكنك العثور على البروتوكول هنا http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bm015630n


ما هو تسلسل استنساخ تلو الآخر؟

أثناء تسلسل استنساخ تلو الآخر ، يتم عمل خريطة لكل كروموسوم في الجينوم قبل تقسيم الحمض النووي إلى أجزاء جاهزة للتسلسل.

  • في تسلسل استنساخ تلو الآخر ، يتم تقسيم الجينوم إلى أجزاء كبيرة ، بطول 150 كيلو قاعدة (150.000 زوج قاعدي).
  • يتم تسجيل موقع هذه القطع على الكروموسومات (تعيينها) للمساعدة في تجميعها بالترتيب بعد التسلسل.
  • يتم بعد ذلك إدخال القطع في الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs) ووضعها داخل الخلايا البكتيرية لتنمو.
  • يتم نسخ قطع الحمض النووي في كل مرة تنقسم فيها البكتيريا لإنتاج الكثير من النسخ المتطابقة.
  • ثم يتم تقسيم الحمض النووي في الحيوانات المستنسخة البكتيرية الفردية إلى أجزاء أصغر متداخلة. يبلغ طول كل جزء 500 زوج أساسي بحيث يكون حجمها أكثر قابلية للإدارة للتسلسل.
  • يتم وضع هذه الأجزاء في ناقل له تسلسل DNA معروف.
  • يتم بعد ذلك تسلسل شظايا الحمض النووي ، بدءًا من التسلسل المعروف للناقل وتمتد إلى التسلسل غير المعروف للحمض النووي.
  • بعد التسلسل ، يتم تجميع الأجزاء الصغيرة من الحمض النووي معًا عن طريق تحديد مناطق التداخل لإصلاح القطع الكبيرة التي تم إدخالها في الأصل في BACs.
  • يتم تنفيذ هذا "التجميع" بواسطة أجهزة الكمبيوتر التي تحدد مناطق التداخل وتجمع تسلسل الحمض النووي معًا.
  • بعد ذلك ، باتباع الخريطة التي تم إنشاؤها في البداية ، يمكن تجميع القطع الكبيرة مرة أخرى في الكروموسومات كجزء من تسلسل الجينوم الكامل.
  • تم استخدام نهج الاستنساخ تلو الآخر خلال الثمانينيات والتسعينيات من القرن الماضي لتسلسل جينومات الديدان الخيطية ، C. ايليجانسوالخميرة S. cerevisiae.
  • كان تسلسل استنساخ تلو الآخر هو الطريقة المفضلة خلال مشروع الجينوم البشري ، الذي اكتمل في عام 2001.

تكرار الحمض النووي في بدائيات النوى

تذكر أن الكروموسوم بدائية النواة هو جزيء دائري له بنية ملفوفة أقل اتساعًا من الكروموسومات حقيقية النواة. كروموسوم حقيقيات النواة خطي وملفوف بدرجة عالية حول البروتينات. في حين أن هناك العديد من أوجه التشابه في عملية تكرار الحمض النووي ، فإن هذه الاختلافات الهيكلية تتطلب بعض الاختلافات في عملية تكرار الحمض النووي في هذين الشكلين من أشكال الحياة.

تمت دراسة تكرار الحمض النووي بشكل جيد للغاية في بدائيات النوى ، ويرجع ذلك أساسًا إلى صغر حجم الجينوم والعدد الكبير من المتغيرات المتاحة. الإشريكية القولونية يحتوي على 4.6 مليون زوج أساسي في كروموسوم دائري واحد ، ويتم تكرار كل ذلك في حوالي 42 دقيقة ، بدءًا من أصل واحد للنسخ المتماثل والتقدم حول الكروموسوم في كلا الاتجاهين. هذا يعني أنه يتم إضافة ما يقرب من 1000 نيوكليوتيد في الثانية. هذه العملية أسرع بكثير من حقيقيات النوى. يلخص [رابط] الاختلافات بين مضاعفات بدائية النواة وحقيقية النواة.

الاختلافات بين مضاعفات بدائية النواة وحقيقية النواة
ملكية بدائيات النوى حقيقيات النواة
أصل النسخ المتماثل غير مرتبطة عديد
معدل التكرار 1000 نيوكليوتيدات / ثانية من 50 إلى 100 نيوكليوتيدات / ثانية
هيكل الكروموسوم دائري خطي
تيلوميراز غير موجود الحالي

انقر من خلال برنامج تعليمي حول تكرار الحمض النووي.


Sandwalk

تم تعديله قليلاً من Horton et al. (2006).

أثناء تكاثر الحمض النووي ، هناك آلة جزيئية تسمى إعادة تشكيل في مفترق النسخ حيث ينفصل خيوط الحمض النووي. يحتوي الريبليزوم على أنشطة تفصل الخيوط وتفصلها عن بعضها البعض من أجل التوليف بواسطة نسخة إعادة تركيب من بوليميراز الحمض النووي ، المسمى DNA polymerase III في البكتيريا. يحتوي المجمع على اثنين من المشابك المنزلقة التي تربط المركب بخيوط الحمض النووي بحيث يكون تكرار الحمض النووي عالي المعالجة.

تحفز بوليميرات الحمض النووي استطالة السلسلة حصريًا في الاتجاه 5 & Prime & rarr 3 & الرئيسي. نظرًا لأن خيطي الحمض النووي متضادان ، فإن التوليف باستخدام خيط قالب واحد يحدث في نفس اتجاه حركة الشوكة ، لكن التوليف باستخدام خيط القالب الآخر يحدث في الاتجاه المعاكس لحركة الشوكة. يُطلق على الخيط الجديد المتكون من البلمرة في نفس اتجاه حركة الشوكة الشريط الرئيسي. يُطلق على الخيط الجديد المتكون من البلمرة في الاتجاه المعاكس اسم الخيط المتأخر.

حمض ديوكسي ريبونوكلييك (DNA) تذكر أن الإعادة تحتوي على ثنائي إنزيم هولو إنزيم DNA polymerase III مع مركبين أساسيين يمكنهما تحفيز البلمرة. أحدهما مسؤول عن تخليق الخيط الرئيسي ، والآخر مسؤول عن تخليق الخيط المتأخر.

إليك مقطع فيديو يوضح العملية بأكملها (المصدر غير معروف ، يرجى الاتصال بي إذا كنت تعرف من صنع هذا الفيديو). يتم عرض تفاصيل إحدى الخطوات المهمة في الجزء السفلي غير المرئي من الصفحة.

أ. تركيب حبلا تأخير غير مستمر

يتم تصنيع الخيط الرئيسي باعتباره بولي نيوكليوتيد واحد مستمر ، بدءًا من الأصل وينتهي عند موقع النهاية. في المقابل ، يتم تصنيع الخيط المتأخر بشكل متقطع في قطع قصيرة في الاتجاه المعاكس لحركة الشوكة. ثم يتم ربط هذه القطع المتأخرة من خلال تفاعل منفصل.

تمت تسمية القطع القصيرة من الحمض النووي المتخلف بشظايا Okazaki تكريما لمكتشفها ، Reiji Okazaki. تسمى الآلية العامة لتكرار الحمض النووي شبه مستمر للتأكيد على الآليات المختلفة لتكرار كل خيط.

يبدأ كل جزء من أجزاء Okazaki ببادئ RNA

من الواضح أن تخليق الخيوط المتأخرة غير مستمر ، ولكن ليس من الواضح كيف يتم بدء توليف كل جزء من أجزاء أوكازاكي. المشكلة هي أنه لا يمكن أن يبدأ بلمرة DNA من جديد يمكنه فقط إضافة النيوكليوتيدات إلى البوليمرات الموجودة. لا يمثل هذا القيد صعوبة في تخليق الخيوط الرائدة لأنه بمجرد أن يتم توليف الحمض النووي قيد التنفيذ ، تتم إضافة النيوكليوتيدات باستمرار إلى سلسلة متنامية. ومع ذلك ، على الخيط المتأخر ، يتطلب تركيب كل جزء من أجزاء أوكازاكي حدث بدء جديد. يتم تحقيق ذلك عن طريق صنع قطع قصيرة من الحمض النووي الريبي في مفترق النسخ. هذه البادئات RNA مكملة لقالب الخيط المتأخر. يتم تمديد كل تمهيدي من نهايته 3 & الأولية بواسطة DNA polymerase I لتشكيل جزء Okazaki ، كما هو موضح في الشكل. (يبدأ تخليق الخيط الرئيسي أيضًا بدهان تمهيدي RNA ، ولكن يلزم وجود مادة أولية واحدة فقط لبدء تخليق الخيط بأكمله.)

يتخطى استخدام بادئات RNA القصيرة القيود التي تفرضها آلية بوليميريز الحمض النووي ، أي أنه لا يمكن بدء تخليق الحمض النووي من جديد. يتم تصنيع البادئات بواسطة إنزيم بوليميريز RNA المعتمد على الحمض النووي الريبي المسمى primase & # 8212 المنتج من الحمض النوويG في بكتريا قولونية. أظهر التركيب البلوري ثلاثي الأبعاد للمجال الحفاز DnaG أن موقعه القابل للطي والنشط متميز عن البوليميرات المدروسة جيدًا ، مما يشير إلى أنه قد يستخدم آلية إنزيم جديدة. Primase هو جزء من مجمع أكبر يسمى primosome يحتوي على العديد من polypeptides بالإضافة إلى primase. يعتبر البريموسوم ، جنبًا إلى جنب مع DNA polymerase III ، جزءًا من الريبليزوم.

مع تقدم شوكة النسخ المتماثل ، يتم فك الحمض النووي الأبوي ، ويصبح المزيد والمزيد من الحمض النووي أحادي الجديلة مكشوفًا. مرة واحدة كل ثانية تقريبًا ، يحفز primase تخليق تمهيدي قصير من الحمض النووي الريبي باستخدام هذا الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل كقالب. تتكون البادئات من عدد قليل من النيوكليوتيدات في الطول. نظرًا لأن شوكة النسخ تتقدم بمعدل حوالي 1000 نيوكليوتيد في الثانية ، يتم تصنيع أساس واحد لكل 1000 نيوكليوتيدات مدمجة. يحفز DNA polymerase III تخليق DNA في الاتجاه 5 & Prime & rarr 3 & الرئيسي عن طريق تمديد كل RNA التمهيدي القصير.

شظايا C. Okazaki ينضم إليها عمل DNA Polymerase I و DNA Ligase

في النهاية يتم ضم شظايا أوكازاكي لإنتاج خيط مستمر من الحمض النووي. يستمر التفاعل في ثلاث خطوات: إزالة المادة الأولية من الحمض النووي الريبي ، وتخليق الحمض النووي البديل ، وختم أجزاء الحمض النووي المجاورة. يتم تنفيذ الخطوات من خلال العمل المشترك لـ DNA polymerase I و DNA ligase.

بوليميريز الحمض النووي الأول بكتريا قولونية تم اكتشافه بواسطة Arthur Kornberg منذ حوالي 45 عامًا. كان أول إنزيم يتم العثور عليه يمكنه تحفيز تخليق الحمض النووي باستخدام خيط قالب. في بولي ببتيد واحد ، يحتوي DNA polymerase I على الأنشطة الموجودة في DNA polymerase III holoenzyme: 5 & prime & rarr 3 & prime polymerase activity و 3 & prime & rarr 5 & amp ؛ نشاط نوكلياز خارجي مصحح. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي DNA polymerase I على 5 & Prime & rarr 3 & amp ؛ نشاط نوكلياز خارجي رئيسي ، وهو نشاط غير موجود في بوليميريز الحمض النووي III.

يمكن شق بوليميراز الحمض النووي 1 باستخدام بعض الإنزيمات المحللة للبروتين لتوليد جزء صغير يحتوي على نشاط نوكلياز خارجي 5 & Prime & rarr 3 & وجزء أكبر يحافظ على أنشطة البلمرة والتدقيق اللغوي. يتكون الجزء الأكبر من مخلفات الأحماض الأمينية C-terminal 605 ، ويحتوي الجزء الأصغر على مخلفات N-terminal 323 المتبقية. الجزء الكبير ، المعروف باسم جزء Klenow ، يستخدم على نطاق واسع لتسلسل الحمض النووي والعديد من التقنيات الأخرى التي تتطلب تخليق الحمض النووي دون تدهور 5 & Prime & rarr 3 & Prime. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم العديد من الدراسات حول آليات تخليق الحمض النووي وتصحيح التجارب المطبعية جزء Klenow كنموذج لبوليميرات الحمض النووي الأكثر تعقيدًا.

يوضح الشكل (على اليمين) بنية جزء Klenow المركب بجزء من الحمض النووي يحتوي على زوج قاعدة طرفي غير متطابق. يتم وضع الطرف 3 & الرئيسي من الخيط الناشئ في 3 & Prime & rarr 5 & موقع نوكلياز خارجي للإنزيم. أثناء البلمرة ، يحتل خيط القالب الأخدود الموجود أعلى الهيكل ويتم ربط 10 نقاط أساس على الأقل من الحمض النووي المزدوج الشريطة بواسطة الإنزيم ، كما هو موضح في الشكل. تتشابه العديد من بقايا الأحماض الأمينية المشاركة في ربط الحمض النووي في جميع بوليميرات الحمض النووي ، على الرغم من أن الإنزيمات قد تكون مختلفة تمامًا في التركيب ثلاثي الأبعاد وتسلسل الأحماض الأمينية.

يزيل النشاط الفريد من نوعه 5 & Prime & rarr 3 & amp ؛ نشاط نوكلياز خارجي رئيسي لبوليميراز DNA 1 تمهيدي RNA في بداية كل جزء من أجزاء Okazaki. (نظرًا لأنه ليس جزءًا من جزء Klenow ، لم يتم عرض 5 & Prime & rarr 3 & Prime exonuclease في الشكل أعلاه ، ولكنه سيكون موجودًا في الجزء العلوي من الهيكل ، بجوار الأخدود الذي يستوعب حبلا القالب.) يقوم البوليميراز بتجميع الحمض النووي لملء المنطقة بين شظايا أوكازاكي ، وهي عملية تسمى ترجمة نيك (انظر الشكل أدناه). في ترجمة نيك ، يتعرف DNA polymerase I ويرتبط بسلسلة DNA. بهذه الطريقة ، يحرك الإنزيم النك على طول الشريط المتأخر. بعد الانتهاء من 10 أو 12 دورة من التحلل المائي والبلمرة ، ينفصل DNA polymerase I من الحمض النووي ، تاركًا وراءه شظايا Okazaki مفصولة عن طريق شق في العمود الفقري phosphodiester. إزالة الاشعال RNA بواسطة
إن بوليميراز الحمض النووي I جزء أساسي من تكرار الحمض النووي لأن المنتج النهائي يجب أن يتكون بالكامل من DNA مزدوج الشريطة.





تتمثل الخطوة الأخيرة في تخليق الشريط المتأخر من الحمض النووي في تكوين رابط فوسفوديستر بين مجموعة 3 و Prime-hydroxyl في نهاية جزء واحد من Okazaki ومجموعة 5 & prime-phosphate لجزء Okazaki المجاور. يتم تحفيز هذه الخطوة بواسطة DNA ligase. تتطلب ليجازات الحمض النووي في الخلايا حقيقية النواة وفي الخلايا المصابة بالعاثيات ، ATP كركيزة مشتركة. فى المقابل، بكتريا قولونية يستخدم DNA ligase NAD + كركيزة مشتركة. NAD + هو مصدر مجموعة النيوكليوتيديل التي يتم نقلها ، أولاً إلى الإنزيم ثم إلى الحمض النووي ، لإنشاء وسيط ADP-DNA.

[& copyLaurence A. Moran and Pearson / Prentice Hall]


يُظهر جزء الكتائب المكتشفة حديثًا أن دينيسوفان أقرب إلى الإنسان الحديث من إنسان نياندرتال

كشف التسلسل الجينومي للحمض النووي المحفوظ جيدًا بشكل استثنائي في جزء الكتائب من كهف دينيسوفا (سيبيريا) في عام 2010 أنه ينتمي إلى فرد من مجموعة بشرية غير معروفة سابقًا ، دينيسوفان ، الذين كانوا على صلة وثيقة بالنياندرتال [1].

ومع ذلك ، نظرًا لأنه تم العثور على عدد قليل من عظام إنسان الدينيسوفان ، فإن مورفولوجيا أشباه البشر هذه لا تزال غير مؤكدة. الآن قام فريق من العلماء من معهد جاك مونود (CNRS / Universit & eacute de Paris) بقياس وتصوير جزء آخر تم العثور عليه في كهف دينيسوفا. يكشف التحليل الجيني أنه القطعة المفقودة من نفس الكتائب التي مكّن الجزء القريب من التسلسل الأولي لجينوم دينيسوفان.

جنبا إلى جنب مع زملائهم من مختبر PACEA (CNRS / جامعة بوردو / وزارة الثقافة الفرنسية) وجامعة تورنتو (كندا) ، قارن العلماء الجزء الجديد بكتائب إنسان نياندرتال والإنسان الحديث تشريحيا. يشير تحليلهم إلى أنه قريب جدًا من الأخير ، وأقل شبهاً بالأول.

ومع ذلك ، فإن هذا التشابه الهيكلي لا يمتد إلى الأضراس والفك السفلي الموجودان في هضبة التبت [2] ، والتي تتميز بخصائص قديمة أكثر. إن الباحثين مفتونون بفسيفساء دينيسوفان المورفولوجية ويبحثون عن بقايا هيكل عظمي جديدة لتوصيف هذه المجموعة البشرية "الثالثة" بشكل أفضل.

تم نشر النتائج التي توصلوا إليها في تقدم العلم (4 سبتمبر 2019).

[1] J. Krause وآخرون ، جينوم DNA الميتوكوندريا الكامل لأشباه البشر غير المعروف من جنوب سيبيريا. طبيعة سجية 464 ، 894-897 (2010). رايش وآخرون ، التاريخ الجيني لمجموعة أشباه البشر القديمة من كهف دينيسوفا في سيبيريا. طبيعة سجية 468 ، 1053-1060 (2010). M. Meyer وآخرون ، تسلسل جينوم عالي التغطية من فرد دينيسوفان قديم. علم 338, 222-226 (2012).

[2] د. رايش وآخرون ، التاريخ الجيني لمجموعة أشباه البشر القديمة من كهف دينيسوفا في سيبيريا. طبيعة سجية 468 ، 1053-1060 (2010). في سلون وآخرون ، جينوم نسل أم إنسان نياندرتال وأب دينيسوفاني. طبيعة سجية 561 ، 113-116 (2018). S. Sawyer et al. ، تسلسل الحمض النووي النووي والميتوكوندريا من فردين من دينيسوفان. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية 112 ، 15696-15700 (2015). F. Chen et al.، أواخر العصر الجليدي الأوسط الدينيسوفان الفك السفلي من هضبة التبت. طبيعة سجية, (2019).


شظايا أوكازاكي

عملية تكرار الحمض النووي ينطوي على فصل خيوط الحمض النووي الحلزون المزدوج، والذي يحدث في مكان متحرك يُعرف باسم شوكة النسخ المتماثل. والنتيجة هي فصل مستمر للخيوط ، واحد منها فقط يمكن أن يكون بمثابة ملف مستمر نموذج. يجب تكرار الخيط الآخر ، على الرغم من إتاحته بشكل مستمر ، في اتجاه بعيد عن شوكة النسخ المتماثل.

هذه العملية تؤدي إلى أ متخلفة حبلا نموذج هذا هو بشكل متواصل يتم توفيرها ولكن لا يمكن استخدامها حتى يتم توفير قالب كافٍ لبدء جولة أخرى من تكرار الحمض النووي على هذا الخيط يصبح مفيدًا. الامتداد الناتج حديثًا توليفها الحمض النووي المرتبط بهذا حبلا متخلفة أو حبلا متقطع يسمى جزء Okazaki.

شظايا أوكازاكي، كما هو الحال مع تكرار الحمض النووي بشكل عام ، يتطلب فتيلة الحمض النووي الريبي، والذي يمثل بداية جزء من أجزاء أوكازاكي. هؤلاء الاشعال RNA تتم إزالتها لاحقًا بواسطة بوليميريز الحمض النووي في نهاية جزء أوكازاكي البلمرة (بمعنى آخر.، التمهيدي إزالة من السابق جزء أوكازاكي بالتزامن مع الانتهاء من التيار جزء أوكازاكي). ثم يتم ضم شظايا أوكازاكي الكاملة ولكن المنفصلة في خيط واحد من الحمض النووي عبر إنزيم, ligase DNA.

طريقة واحدة للنظر في مفاهيم مستمر عكس متقطع تكرار من الحمض النووي هو من حيث الحصول على شريط من دور الشريط. تحتاج أحيانًا إلى الكثير من الشريط اللاصق ويمكنك أن تقوم بفتح الشريط أثناء لصق الشريط. في هذه الحالة ، يتم تطبيق الشريط بشكل أساسي بأسرع ما يتم لفه ويتم فكه بأسرع ما يتم تطبيقه ، على الرغم من حدوث كل عملية في مواقع مختلفة قليلاً.

على النقيض من ذلك ، كيف يستخدم المرء عادةً قطعًا أصغر من الشريط ، أي شظايا الشريط؟ الاتجاه هنا ليس تطبيق الشريط أثناء قيام الشخص بفكه ولكن بدلاً من ذلك إزالة الشريط بقدر ما يعتقد المرء أنه يحتاج إليه ثم تطبيق تلك القطع من الشريط بشكل فردي. في هذه الحالة ، لا يحدث التطبيق والفتح في نفس الوقت. علاوة على ذلك ، إذا كنت بحاجة إلى قطع صغيرة ومتعددة من الشريط ، فإن عملية التسجيل حرفيًا تكون متقطعة ، أي مقسمة إلى مجموعة من الخطوات الفردية بدلاً من أن تحدث في خطوة واحدة كبيرة وطويلة.


موت الخلايا وتلف الحمض النووي الناجم عن نظام الجين الانتحاري Tet-On الذي ينظم HSV-tk / GCV في خلايا MCF-7

يؤثر Ganciclovir (GCV) على الآلية الجزيئية لموت الخلايا وتلف الحمض النووي بواسطة rAAV (الفيروس المرتبط بالفيروس المؤتلف) الذي يتوسطه نظام الجين الانتحاري Tet-On / HSV-tk / GCV في خط خلايا سرطان الثدي البشري MCF-7. تم استخدام rAAV / TRE / Tet-On / HSV-tk الذي يجمع بين نظام تنظيم Tet-On وجين انتحاري HSV-tk لنقل خط خلايا سرطان الثدي البشري MCF-7 ، وتمت دراسة التأثيرات العلاجية على هذا النظام. بعد ذلك ، استخدمنا RT-PCR ، النشاف الغربي ، ومقايسة المذنب المعدلة لاستكشاف الآلية المحتملة لنظام الجين الانتحاري HSV-tk / GCV في علاجات سرطان الثدي. أظهر فحص MTT أن عدد خلايا مجموعة GCV + rAAV + Dox انخفض بشكل كبير مقارنةً بالمجموعات الأخرى بعد العلاج واكتشف تحليل التدفق الخلوي وجود زيادة كبيرة في خلايا المرحلة S في هذه المجموعة ، مما يعني أن HSV- ربما يعمل نظام الجينات الانتحارية tk / GCV على دورة الخلية. اكتشف RT-PCR زيادة مستوى التعبير عن p21 وكان للـ PCNA اتجاه معاكس. اكتشف النشاف الغربي زيادة تعبير البروتين عن p21 و p53 وانخفض PCNA و CDK1 و cyclin B في مجموعة GCV + rAAV + Dox. أظهر فحص المذنب المعدل أن الأجزاء الإضافية الصغيرة جدًا الناتجة عن معالجة مجموعة GCV + rAAV + Dox مرئية كسحابة صغيرة تمتد من المذنب في اتجاه الرحلان الكهربي. من المحتمل أن تكون الآلية العلاجية لنظام الجينات الانتحارية HSV-tk / GCV على خط خلايا سرطان الثدي البشري MCF-7 عن طريق تنظيم التعبير عن p21 من خلال مسار إشارات تلف الحمض النووي المعتمد على p53 ، مما يؤدي إلى انخفاض التعبير البروتيني لـ PCNA ، cyclin B ، CDK1 في خلايا MCF-7 وتعزيز إيقاف دورة الخلية في مرحلة G1 / S. باختصار ، يثير نظام الجينات الانتحارية HSV-tk / GCV موت خلايا MCF-7 من إعاقة دورة الخلية وتلف الحمض النووي.

الكلمات الدالة: Ganciclovir HSV-tk نظام الجينات الانتحارية لسرطان الثدي البشري.


تحديد وتحليل الجينات والمنتجات الجينية

يمكن استخدام إنزيمات التقييد (لقطع الحمض النووي) والهلام الكهربائي (لفصل الأجزاء الناتجة) لإنتاج خريطة مادية لأجزاء الحمض النووي في عملية تُعرف باسم تعيين القيود.

هناك أيضًا عدد من التقنيات التي يمكن استخدامها لتحديد جينات معينة أو منتجات جينية داخل مكتبة الجينات: النشاف الجنوبي يكتشف وجود متواليات نيوكليوتيد معينة في مجموعة من شظايا الحمض النووي باستخدام مسبار الحمض النووي - قسم من الحمض النووي المسمى باستخدام النشاط الإشعاعي أو التألق الكيميائي النشاف الشمالي يحقق في نسخ الجينات عن طريق تحديد تسلسل معين من الحمض النووي الريبي باستخدام تحقيقات الحمض النووي المسمى و النشاف الغربي يكتشف بروتينات معينة باستخدام الأجسام المضادة الموصوفة.

ومع ذلك ، فإن أقوى تقنية تجريبية للتحقيق في علم الوراثة على المستوى الجزيئي هي تسلسل الحمض النووي، والذي يسمح بتحديد تسلسل النوكليوتيدات للجينات - حتى الكروموسومات الكاملة. تتوفر تقنيات مماثلة لتحليل تسلسل النوكليوتيدات لجزيئات الحمض النووي الريبي وتسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات. تسمح لنا تقنيات التسلسل الآلي الآن بتسلسل الجينوم الكامل للكائنات الحية من البكتيريا إلى البشر.


تسلسل البندقية وتجميعها

تسمى العملية التي يقوم العلماء من خلالها بفك تشفير تسلسل الحمض النووي للكائن الحي بالتسلسل. في عام 1975 طور فريدريك سانجر تقنية التسلسل الأساسية التي لا تزال مستخدمة على نطاق واسع حتى يومنا هذا. بينما تم تحسين هذه التقنية باستمرار على مدار الثلاثين عامًا الماضية ، يمكننا فقط فك تشفير ما بين 1000 و 2000 زوج أساسي من الحمض النووي في وقت واحد - وهو قيد كبير نظرًا لأنه حتى أبسط الفيروسات تحتوي على عشرات الآلاف من الأزواج الأساسية والبكتيريا تحتوي على الملايين ، وتحتوي جينومات الثدييات على مليارات من أزواج القواعد. للتغلب على هذا القيد ، طور العلماء تقنية تسمى تسلسل البندقية حيث يتم تقطيع تسلسل الحمض النووي للكائن الحي إلى عدد كبير من الأجزاء الصغيرة (الشكل 1) ، يتم ترتيب نهايات الأجزاء (الشكل 2) ، ثم التسلسل الناتج يتم ضمها معًا باستخدام برنامج كمبيوتر يسمى المُجمِّع (الشكل 3).

mpop / images / shotgun.jpg "/>

الشكل 1. تم تقسيم الحمض النووي الأصلي إلى مجموعة من الشظايا

mpop / images / sequenced-shotgun.jpg "/>

الشكل 2. نهايات كل جزء (مرسومة باللون الأخضر) متسلسلة

mpop / images / shotgun-assembly.jpg "/>

الشكل 3. يتم تجميع قراءات التسلسل معًا بناءً على تشابه التسلسل


هل تحمل الحمض النووي لإنسان نياندرتال؟ قد يخبرنا شكل جمجمتك.

قد يقول شكل عقلك الكثير عن الإنسان البدائي بداخلك. توصل بحث جديد إلى أن البشر المعاصرين الذين يحملون شظايا جينية معينة من أقرب أقربائنا المنقرضين قد يكون لديهم عقول وجماجم أكثر استطالة من غيرهم.

يمتلك الإنسان الحديث جماجم وعقول كروية فريدة نسبيًا. على النقيض من ذلك ، فإن أقرب الأقارب المنقرضين للإنسان الحديث ، إنسان نياندرتال ، لديهم جماجم وأدمغة ممدودة وهي نموذجية لمعظم الرئيسيات.

اقترح بحث سابق أن أشكال الجماجم المتناقضة قد تعكس الاختلافات في حجم مناطق الدماغ المختلفة في الإنسان الحديث والنياندرتال ، وكيف تم ربط مناطق الدماغ هذه معًا. قال المؤلف المشارك في الدراسة فيليب غونز ، عالم الأنثروبولوجيا القديمة في معهد ماكس بلانك للأنثروبولوجيا التطورية في لايبزيغ بألمانيا ، لـ Live Science: "ومع ذلك ، فإن أنسجة المخ لا تتحلل ، لذا ظلت البيولوجيا الأساسية بعيدة المنال". [صور ثلاثية الأبعاد: استكشاف الدماغ البشري]

للمساعدة في حل هذا اللغز ، أجرى العلماء أولاً مسحًا مقطعيًا (CT) لسبع جماجم من أحافير إنسان نياندرتال و 19 جماجم بشرية حديثة. لقد طوروا بصمات للداخلية لأدمغة الجماجم وقاسوا استدارةها.

بعد ذلك ، قام الباحثون بتحليل ما يقرب من 4500 من البشر المعاصرين الذين لديهم بيانات جينية وتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لأدمغتهم.

"لقد استنتجنا أنه إذا تمكنا من تحديد أجزاء معينة من الحمض النووي لإنسان نياندرتال في عينة كبيرة بما يكفي من البشر الأحياء ، فسنكون قادرين على اختبار ما إذا كانت أي من هذه الشظايا تدفع نحو شكل دماغ أقل كرويًا ، مما يسمح لنا بتكبير الجينات التي قد تكون كذلك. مهمة لهذه السمة ، "قال كبير مؤلفي الدراسة سيمون فيشر ، اختصاصي علم الوراثة العصبية في معهد ماكس بلانك لعلم اللغة النفسي في نيميغن ، هولندا ، لـ Live Science.

وجد العمل السابق أن البشر المعاصرين والنياندرتال قد عانوا من نوبات متعددة من التهجين ، حيث أدخلوا الحمض النووي لإنسان نياندرتال في الجينوم البشري الحديث. في الدراسة الجديدة ، اكتشف العلماء أن شظايا الحمض النووي لإنسان نياندرتال في الكروموسومات البشرية الحديثة 1 و 18 مرتبطة بأدمغة أقل استدارة.

قال فيشر: "إن آثار حمل شظايا الإنسان البدائي النادرة خفية". "تأثيرات المتغيرات الجينية للإنسان البدائي صغيرة ، ولن تكون قادرًا على رؤيتها في شكل رأس الشخص عندما تقابلها."

احتوت شظايا الحمض النووي لإنسان نياندرتال على جينين سابقين مرتبطين بنمو الدماغ. أحدهما ، UBR4 ، مرتبط بتوليد الخلايا العصبية ، والآخر ، PHLPP1 ، مرتبط بتطوير العزل الدهني حول الخلايا العصبية.

اكتشف الباحثون أن هذا الحمض النووي لإنسان نياندرتال كان له أقوى التأثيرات على هياكل الدماغ المعروفة باسم البوتامين والمخيخ و [مدش] ، وكلاهما أساسي لإعداد الحركات وتعلمها وتنسيقها. يشكل البوتامين الجزء الخارجي من العقد القاعدية للدماغ ، والتي ترتبط بالذاكرة والانتباه والتخطيط وتعلم المهارات وربما الكلام واللغة.

لاحظ العلماء أنه إذا كان لدى الشخص حمض نياندرتال أكثر من المتوسط ​​، فهذا لا يعني بالضرورة أن دماغه أكثر استطالة. قال فيشر: "شخصان لديهما كميات إجمالية متشابهة جدًا من DNA و mdash لإنسان نياندرتال على سبيل المثال ، 1 بالمائة من الجينوم و [مدش] قد يحملان شظايا مختلفة تمامًا".

لاحظ الباحثون أيضًا أن هذه الاختلافات في الجمجمة على الأرجح لم تعكس أي اختلافات في وقت ولادة الرضيع: قال غونز إن البشر المعاصرين والنياندرتال لديهم أشكال متشابهة من الدماغ والجمجمة في ذلك الوقت. وأضاف أنه بعد الولادة ، من المحتمل أن تؤدي الاختلافات في نمو الدماغ إلى الاختلافات الواضحة التي تم العثور عليها في شكل الجمجمة بين البالغين من السلالتين.

قال فيشر إن البحث المستقبلي يمكن أن يبحث عن المزيد من الحمض النووي لإنسان نياندرتال المرتبط بأدمغة بشرية حديثة وتحديد الآثار المحددة التي قد تحدثها هذه المتغيرات الجينية القديمة من خلال تنمية أنسجة المخ باستخدام الحمض النووي لإنسان نياندرتال في المختبر.

قام العلماء بتفصيل النتائج التي توصلوا إليها على الإنترنت في 13 ديسمبر في مجلة Current Biology.


الشكل 2

الشكل 2. تراكيب يجند الجزيء الصغير 1، الببتيد المختار 2، والمثبط الثنائي التكافؤ 3.

بعد ذلك ، يتم تصنيع مكتبة من الببتيدات الحلقية الصغيرة من خلال عرض الملتهمة (6). هذه المكتبة مرتبطة بمجال السوستة لبروتين Fos ، والذي يمكن أن يشكل مغايرًا مع Jun. يمكن أن تختلف الببتيدات المرتبطة بـ Fos في ستة مواضع محاطة بمتبقي سيستين يمكن أن يشكل ثاني كبريتيد ، يحلّق الببتيد ، ويتم فصله عن مجال سحاب Fos بواسطة فاصل يتكون من عدة أحماض أمينية إضافية. يمكن أن تستوعب المواضع الستة المتغيرة أيًا من الأحماض الأمينية الشائعة ، وقد أنشأ Ghosh وزملاؤه مكتبة تضم مليار و GT1 مليار عضو ، وهو ما يتجاوز بكثير حجم أي مجموعة جزيئات صغيرة. عندما يجتمع Fos و Jun معًا ، تكون الببتيدات الحلقية على مقربة من نظائر الجزيء ATP الصغيرة ، ويمكن فحص الاتحادات ، التي لا تزال مرتبطة بالعاثية ، مقابل كيناز الهدف.

تم خلط مجموعة من Jun المترافق مع جزيء صغير مع مكتبة Fos وتعريضها لبروتين كيناز A المعتمد على cAMP (PKA) ، وهو كيناز جيد التوصيف. بعد شطف الملتهمة غير المنضمة بعيدًا ، تمت إزالة الملتهمة المربوطة وتضخيمها ، وتكررت العملية لعدة دورات. في حالة مكتبات Jun المشتقة من AdoC ، على الرغم من الاحتياطات ، أسفرت العملية فقط عن الببتيدات المرتبطة بالمصفوفة التي تحتوي على PKA. ومع ذلك ، عندما تم إجراء الانتقاء باستخدام Jun المترافق مع الستوروسبورين ، اكتشف الباحثون عددًا من الببتيدات بعد ست جولات من الاختيار. الأكثر وفرة كان CTFRVFGC (مركب 2، الشكل 2). من الأهمية بمكان أن تقارب الببتيد المحدد من المحتمل أن يكون منخفضًا جدًا بحيث لا يمكن تحديده دون مساعدة من Jun المترافق مع الستوروسبورين.

قام الباحثون بتركيب هذا الببتيد الدوري واختبروا تقاربه مع مشتق ستوروسبورين المستخدم في الاختيار (الشكل 2). ثم قاموا بتصنيع مثبط ثنائي التكافؤ يتكون من جزيئين متصلين بواسطة رابط مرن. لحسن الحظ ، الجزيء ثنائي التكافؤ 3 له قوة أكبر من أي من المكونين ، مع IC50 2.6 نانومتر مقارنة بـ 243 نانومتر لمشتق ستوروسبورين 1 (أو 78 نانومتر لمتقارن Jun-staurosporine) و 57 ميكرومتر للببتيد الدوري 2. علاوة على ذلك ، يكون المثبط الثنائي التكافؤ أقل نشاطًا ضد خمسة كينازات متنوعة منه ضد PKA. على الرغم من أن خمسة كينازات تمثل جزءًا صغيرًا جدًا من الكينوم ، إلا أنها مع ذلك بداية مشجعة.

إحدى السوابق المفاهيمية لهذا العمل هي إنشاء مثبطات تماثلية ثنائية الركيزة ، والتي تتضمن ربط محاكى ATP بببتيد مشتق من ركيزة كيناز (7-9). تتمثل إحدى نقاط القوة في هذه التقنية الجديدة في عدم الحاجة إلى معرفة أي شيء عن بنية الكيناز أو ركيزته المفضلة نظرًا لأن الببتيد يتم اختياره تجريبيًا عن طريق عرض الملتهمة. في الواقع ، في المثال الحالي ، ليس من الواضح أين يرتبط الببتيد الدوري المختار في PKA ، والملاحظة التي تفيد بأن أيًا من الببتيدات المختارة ليس لها هوية متسلسلة للركائز الفسيولوجية المعروفة تشير إلى أنها قد ترتبط خارج موقع ربط الركيزة (2) . على الرغم من عدم ذكرها من قبل المؤلفين ، إلا أن سابقة أخرى هي مفهوم التجميع الذاتي للمكتبات الكيميائية ، حيث يتم ربط شظايا الجزيئات الصغيرة بالحمض النووي. يمكن التعرف على الجزيئات الصغيرة التي ترتبط بالبروتين المستهدف من خلال علامات الحمض النووي الخاصة بها ثم ربطها معًا (10). في بعض التنسيقات ، يمكن أن تعتمد هذه التقنية على مكتبات يمكن مقارنتها في الحجم بتلك التي تم تحقيقها بواسطة عرض الملتهمة (11). أخيرًا ، يبدأ الربط مع الموسعات أيضًا بجزء معروف بالفعل أنه يرتبط بالبروتين. يتم استخدام الرابط التساهمي (مثل رابطة ثاني كبريتيد) على هذا الجزء لالتقاط جزء آخر ، وبالتالي العثور على جزء ثان ذي تقارب للهدف وإنشاء الاتصال بين الشظيتين (12).

كما هو الحال مع أي دليل على المفهوم ، هناك قيود مع الدراسة الحالية. أولاً ، على الرغم من أنه مستوحى من اكتشاف الترابط المستند إلى الشظايا ، فإن الجزيئات المعنية كبيرة جدًا بحيث لا يمكن اعتبارها شظايا. الببتيد المحدد 2 له وزن جزيئي يبلغ 986.17 ، أي ضعف الوزن الجزيئي الذي أوصى به ليبينسكي وآخرون. لدواء عن طريق الفم (13). حتى مشتق ستوروسبورين الناضج 1 له وزن جزيئي يبلغ 566.6 ، وهو أكبر من معظم مثبطات كيناز المعتمدة سريريًا مثل إيماتينيب (الوزن الجزيئي 493.6) ، إرلوتينيب (الوزن الجزيئي 393.4) ​​، سونيتينيب (الوزن الجزيئي 398.5) ، داساتينيب (الوزن الجزيئي 488.0) ، سورافينيب (الوزن الجزيئي 464.8).

التعقيد الثاني هو الرابط ، والذي يبلغ طوله 30 Å. تتآكل فوائد تجميع الأجزاء بسبب التكاليف الحتمية لتجميد الروابط القابلة للدوران في الوصلات ، لذلك يجب أن يكون الرابط قصيرًا قدر الإمكان (14). المركب ثنائي التكافؤ 3 يرتبط بـ PKA مع تقارب نانومولار منخفض ، وهو أمر مثير للإعجاب. ومع ذلك ، إذا كان الرابط أكثر مثالية ، فإن طاقات ربط المكونين 1 و 2 يجب أن يكون مضافًا تقريبًا ، مما ينتج عنه مثبط ذو فعالية في نطاق البيكومولار المنخفض.

في المثال الحالي ، موقع ربط الببتيد الدوري غير معروف ، لذلك اختار المؤلفون رابطًا طويلًا لزيادة احتمالية أن كلا الجزأين من المثبط الثنائي التكافؤ سيكونان قادرين على الارتباط بشكل منتج. نأمل أن يؤدي فهم وضع الربط بشكل أفضل إلى السماح للمركبات المستقبلية بأن يكون لها رابط أقصر. There is, however, a darker possibility: Perhaps the cyclic peptide binds far away from the ATP-binding site. Indeed, the geometry of the Fos-Jun dimer could very well prefer compounds that bind at some distance from one another. The α-carbons at the end of the zipper region are >10 Å apart (15), and with three or more amino acids as spacers between the ends of the proteins and the small molecules, the binding sites could be >40 Å apart from one another (2).

Finally, given the very nature of the phage-display methodology employed, one of the components must be a peptide. While the number of peptide drugs is increasing (6), peptides often suffer from poor absorption, distribution, metabolism, excretion, and pharmacokinetic properties. Indeed, the low cell permeability of most peptides suggests that they are unlikely to be broadly effective against intracellular targets, and most kinases are intracellular.

Thus, the technique may prove more useful with extracellular targets, of which there are an abundance of intriguing choices. For example, it has potential to target protein–protein interactions. Small-molecule ligands are known for the cytokine interleukin-2, which is involved in T-cell proliferation, and such ligands could serve the same function as the staurosporine derivative served for PKA (16, 17). Moreover, in theory one need not even be limited to small-molecule ligands. One intriguing approach might be to start with a small-molecule ligand attached to Jun, use the technique to a identify a peptide ligand, and then apply the technique again, this time using the newly identified peptide as the known binder to find a second peptide ligand that could be linked to the first to yield a fully peptidic bivalent inhibitor. Whatever the direction, it is likely that the marriage of phage display with concepts from fragment-based ligand discovery will produce many exciting discoveries.


شاهد الفيديو: شرح الحمض النووى بأسهل طريقه مهم لأولى وتانيه وتالته ثانوى 1 (أغسطس 2022).