معلومة

ما مدى أهمية تدهور الحمض النووي الريبي مع إزالة الغطاء / polyA's في حقيقيات النوى ، أو UTR في بدائيات النوى؟

ما مدى أهمية تدهور الحمض النووي الريبي مع إزالة الغطاء / polyA's في حقيقيات النوى ، أو UTR في بدائيات النوى؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

السؤال لا يحتاج إلى شرح ، لكنه مقسم إلى قسمين. أحاول الاستفادة من نظام القمع الذي يستخدم شق الحمض النووي الريبي في مناطق محددة مع الريبوزيمات بقصد تحطيمها (أو تعطيلها فقط).

يبدو هذا السيناريو أكثر احتمالا في حقيقيات النوى ، حيث إنها تتوج 5 'UTRs وذيل polyA في 3' UTRs التي تضفي على استقرار RNA. ما مدى سرعة ومقدار تدهور الحمض النووي الريبي غير المغطى؟ ماذا عن عدم وجود ذيل بولي ايه؟

نظرًا لأن بدائيات النوى تفتقر إلى هذه الهياكل ، فأنا مقيد باستخدام مناطق UTR في مثالي الخاص. هل هناك أي آلية مماثلة ، سواء بشكل عام أو لبروتينات معينة ، تسمح لي باستغلال منطقة UTR لتعطيل الحمض النووي الريبي في بدائيات النوى؟ يرجى أن تضع في اعتبارك أن إضافة تسلسلات تركيبية إلى مناطق UTR هذه هي بالتأكيد احتمال.


تعد إزالة غطاء 5 بوصة أمرًا ضروريًا للتحلل بمقدار 5 '→ 3' نوكلياز خارجي مثل Xrn1 / 2. يعتبر Xrn1 / 2 تكوينيًا وسيكون تدهور الحمض النووي الريبي غير المعين سريعًا جدًا (ليس له مرجع لعمر الخدمة المحدد). تسبق عملية التخثر عمومًا تدهور 3 '→ 5' بواسطة exosome ولكني لست متأكدًا مما إذا كان هذا شرطًا أساسيًا. ومع ذلك ، يمكن تثبيت mRNAs اللامع عن طريق ربط Pab1p (بروتين ربط Poly-A) بـ 3'UTR. انظر هذه الورقة.

الشكل 4 من الورقة المرتبطة.

يقوم Pab1p المربوط بتثبيت mRNAs التي لا تتلقى ذيلًا. (استراتيجية. تم إدخال ريبوزيم الشق الذاتي HDV في 3 'UTR من MFA2 / MS2 RNA ، مما ينتج عنه mRNA بدون ذيل بولي (A) (A0) في الجسم الحي. (ب) كروماتوغرافيا السليلوز Oligo (dT). تم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا التي تحمل البنية المحتوية على الريبوزيم الموصوف في A ، أو التحكم في البلازميد المستخدم في الأشكال السابقة. تم تجزئة الحمض النووي الريبي بواسطة كروماتوغرافيا السليلوز oligo (dT) ، ثم تم تحليلها بواسطة النشاف الشمالي. لا يتم الاحتفاظ بالـ RNA المحتوي على الريبوزيم بواسطة العمود ، بينما يتم الاحتفاظ بـ RNA التحكم. (T) مجموع الحمض النووي الريبي قبل التجزئة ؛ (+) يحتفظ به العمود ؛ (-) لم يحتفظ بها العمود. يعمل mRNA بشكل أسرع قليلاً في عينة oligo (dT) المحتجزة (+) مقارنةً بإجمالي الحمض النووي الريبي (T) ، نظرًا لأنه يتم تحميل كمية أقل من الحمض النووي الريبي في كل مسار. (ج) تحليل نوكلياز S1. تم تحديد نهاية 3 'من mRNA المحضرة من سلالة تحمل RNA المحتوية على الريبوزيم عن طريق رسم خرائط نوكلياز S1. يتم عرض موضع المسبار غير المهضوم (65 نيوكليوتيد) والأنواع المحمية (43 نيوكليوتيد). تقع المحطة 3 البارزة في الموضع المتوقع لانقسام الريبوزيم. (D) اضمحلال الحمض النووي الريبي المشقوق من خلال تجربة مطاردة النبض النسخي والنشاف الشمالي. تم تحديد معدل دوران mRNAs المراسل المشقوق الريبوزيم في سلالات (يسار) أو بدون (يمين) MS2 / Pab1p. الوقت (بالدقائق) التالي لقمع النسخ مُعطى مباشرة في الأعلى ؛ نصف العمر في القاع. (هـ) تحديد كمية النتائج. تم تطبيع كميات من mRNA إلى مستوى 18S rRNA ، في أسفل كل ممر في D. (•) MS2 / Pab1p ؛ (○) المتجه وحده.

لا تحتوي UTRs بدائية النواة على أي نموذج عام. للحصول على تثبيط متحكم به لـ mRNA في نظام بدائيات النواة ، يمكنك استخدام المحولات الريبية أو RNA القمعي (RBS التكميلي RBS). يمكن أيضًا تدهور الحمض النووي الريبي الموجه من الحمض النووي الريبي في بدائيات النوى باستخدام نظام CRISPR-Cas. انظر هذه الورقة. البروتينات Cmr-1،2،3،4 & 6 مطلوبة لهذا النشاط.


الفصل 14

بالنظر إلى الخيط المزدوج غير المجلف محليًا من الحمض النووي في الشكل أعلاه ، في أي اتجاه وعلى أي خيط يتحرك بوليميراز الحمض النووي الريبي أثناء النسخ؟

حذف نيوكليوتيد مفرد في ترميز exon لموقع نشط من البروتين

تكرار كل أو معظم الإنترونات

طفرة انزياح في إطار واحد من كودون واحد بعيدًا عن الطرف 3 'من الخيط غير النموذجي

تملي الجينات إنتاج إنزيمات معينة ، والأفراد المصابون يعانون من عيوب وراثية تجعلهم يفتقرون إلى إنزيمات معينة.

تستخدم العديد من الإنزيمات الأيضية الحمض النووي كعامل مساعد ، والأفراد المصابون لديهم طفرات تمنع إنزيماتهم من التفاعل بكفاءة مع الحمض النووي.

يتم تنفيذ بعض التفاعلات الأيضية بواسطة الريبوزيمات ، ويفتقر الأفراد المصابون إلى عوامل الربط الرئيسية.

إنزيم يصنع الحمض النووي الريبي كجزء من عملية النسخ

إنزيم يستخدم الحمض النووي الريبي كركيزة

إنزيم يحفز الارتباط بين الوحدات الفرعية الريبوسومية الكبيرة والصغيرة

إما إدراج أو حذف قاعدة

لن يتم نقل الرنا المرسال خارج النواة.

يتم هضم الجزيء عن طريق إنزيمات مقيدة في النواة.

يتحلل الجزيء بواسطة الإنزيمات المتحللة للماء لأنه لم يعد محميًا عند الطرف 5 والنهاية 3.

هناك حاجة إلى العديد من النيوكليوتيدات لتشفير كل حمض أميني.

هناك exons إنهاء بالقرب من بداية mRNA.

هناك تكرار في الشفرة الجينية.

استبدال أول نيوكليوتيد لكودون GGG

حذف اثنين من النيوكليوتيدات

الإنهاء النسخي المبكر

إدراج I1 في مرنا

قد يحل محل حمض أميني مختلف في البروتين ، مما قد يغير وظيفته.

قد يتبادل كودون سيرين واحدًا بكودون سيرين مختلف.

قد يتبادل كودون الإيقاف الواحد كودون إيقاف آخر.

إنه تسلسل يرمز إلى ارتباط بوليميراز الحمض النووي الريبي بالحمض النووي.

يضيف الجوانين المعدل إلى 3 'نهاية mRNA.

يشير إلى موقع الإنهاء متعدية.

التسلسل يتطور بسرعة كبيرة.

يتم تحديد أي طفرة في التسلسل مقابل.

تم العثور على التسلسل في العديد من المروجين ولكن ليس كلهم.

يزيد من معدل النسخ.

يمكن أن يسمح بإنتاج منتجات بروتينية مختلفة من مرنا واحد.

إنها آلية يمكنها زيادة معدل النسخ.

بمجرد بدء النسخ ، يتم نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي حتى تصل إلى نهاية الكروموسوم.

ينسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي من خلال تسلسل المنهي ، مما يتسبب في انفصال البوليميراز عن الحمض النووي وإطلاق النسخة.

يتم نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي من خلال إنترون ، مما يتسبب في تخلي البوليميراز عن النسخة النصية.

عديد ببتيد ينقصه حمض أميني

تحتوي بدائيات النوى على ثلاثة أنواع على الأقل من بوليميرات الحمض النووي الريبي ، في حين أن حقيقيات النوى لها نوع واحد فقط.

يتعرف كل من حقيقيات النوى وبدائيات النوى على إشارة تعدد الأدينيل من أجل إنهاء النسخ.

ينتج بوليميراز الحمض النووي الريبي في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى نفس جزيئات الحمض النووي الريبي.

كل جين يرمز لبروتين واحد.

الأنواع متطورة للغاية.

إزالة 5 'UTR ليس له أي تأثير لأن الإكسونات تظل سليمة.

لن تتم قراءة أول exon لأن I1 سيعمل الآن باعتباره UTR.

إزالة 5 'UTR يزيل أيضًا غطاء 5' ، لذلك قد يتحلل mRNA بسرعة بواسطة الإنزيمات المتحللة بالماء.

التعبير الجيني هو العملية التي توجه بها البروتينات تخليق الحمض النووي الريبي.

التعبير الجيني هو العملية التي يوجه بها الحمض النووي تخليق البروتينات.

التعبير الجيني هو العملية التي توجه بها البروتينات تخليق الحمض النووي.

ثلاثة توائم مفصولة مكانيًا عن ثلاثة توائم أخرى

ثلاثة توائم في الطرف المقابل من الحمض النووي الريبي من موقع ارتباط الحمض الأميني

ثلاثة توائم في نفس إطار القراءة مثل AUG المنبع

يتم بعد ذلك تعديل الحمض النووي الريبي المنتج أثناء النسخ في كلا النوعين من الكائنات الحية.

يمكن أن تبدأ الترجمة بينما لا يزال النسخ جاريًا في بدائيات النوى ، ولكن ليس في حقيقيات النوى.

يمكن أن يحدث النسخ والترجمة في نفس الوقت في كلا الكائنات الحية.

يتم نسخ mRNA و tRNA و rRNA.

يمكن أن يبدأ النسخ بمجرد أن تجمع الترجمة أول عدد قليل من الأحماض الأمينية في عديد الببتيد.

يُضاف ذيل بولي- A إلى الطرف 3 من الرنا المرسال ، ويضاف غطاء إلى الطرف 5.


نتائج

جزيئات الرنا الريباسي 28S المجزأة التي تحتوي على ذيول متجانسة أو غير متجانسة موجودة في كل من السيتوبلازم ونواة الخلايا البشرية.

في عمل سابق ، اكتشفنا الرنا الريباسي 28S و 18 S المقطوع الذي يحتوي على ذيول متجانسة أو غير متجانسة (18). كان من المعقول أن تكون شظايا الرنا الريباسي هذه هي وسيط تدهور للعملية النووية المذكورة سابقًا ، ولكن لا يمكن تجاهل الخيار الثاني: عابر ، وربما يساعد على التحلل ، والغدة من الحمض النووي الريبي داخل السيتوبلازم ، تتعايش مع ذيول بولي المستقرة (أ) التي تميز هذا الموقع الخلوي. ومن ثم ، كان هدفنا الأول هو تحديد ما إذا كانت هذه الجزيئات الذيل المبتورة موجودة في النواة أو السيتوبلازم أو كليهما.

تم الحصول على الحمض النووي الريبي والبروتين من الأجزاء السيتوبلازمية والنووية التي تم تحضيرها من خلايا هيلا. وقد لوحظ توزيع واضح لجزء محدد من الرنا الريباسي الناضج وما قبل الرنا الريباسي (والرنا الريباسي) عند تلطيخ بروميد الإيثيديوم من الحمض النووي الريبي الكلي والسيتوبلازمي والنووي (الشكل S1). لتقييم نقاء الكسور ، تم تحضير اللطخات الشمالية والكتل المناعية ، والشكل 1أ يوضح أن الحمض النووي الريبي وعلامات البروتين تم اكتشافها حصريًا في الكسور المقابلة. بعد ذلك ، تم تقييم وجود الرنا الريباسي 28S المجزأ بواسطة oligo (dT) RT-PCR. كشفت النتائج عن شظايا الرنا الريباسي 28S ، مع امتدادات متجانسة أو غير متجانسة في كل من النواة والسيتوبلازم (الشكل 1).ب). على حد علمنا ، هذا هو الكشف الأول عن الحمض النووي الريبي المضاد داخليًا في سيتوبلازم الخلايا البشرية.

شظايا الرنا الريباسي 28S مع ذيول بولي (A) متجانسة أو غير متجانسة في السيتوبلازم ونواة الخلايا البشرية. (أتم تحديد نقاوة التجزيء عن طريق اللطخات المناعية (IBs) وبقع الحمض النووي الريبي باستخدام علامات خاصة بالجزء: C ، السيتوبلازم: GAPDH. N ، النواة: هيستون H3 (H3) ، فيبريلارين ، و U2 / U3 / U5-snoRNAs. T ، مجموع الخلايا RNA / البروتينات. (ب) عزل Oligo (dT) RT-PCR لجزيئات الرنا الريباسي 28S المقتطعة والمعدلة من الكسور الخلوية (أعلاه) و nuc (أدناه). يتم تقديم 28S rRNA بشكل تخطيطي بأسهم تشير إلى مواقع التمهيدي والخطوط العمودية التي تعرض مواقع الذيل والمحتوى (الجدول S1). (ج) عزل cRT-PCR لجزيئات الرنا الريباسي 28S المقتطعة من الكسور الخلوية (أعلاه) و nuc (أدناه). يتم تمييز الحالات التي لا يُعرف فيها ما إذا كان الحرف "A" مشفرًا أو مضافًا بعد النسخ النصي بعلامة النجمة (الجدول S2).

لتقييم الجزيئات المقطوعة في كلا الجزأين بوسائل غير متحيزة لملحقات بولي (A) ، تم تطبيق النسخ العكسي الدائري (cRT) على نفس المنطقة من 28S rRNA (الشكل 1).ج). تم عزل الجزيئات المقتطعة بنجاح من كل من الكسور السيتوبلازمية والنووية. على الرغم من أن معظم الأجزاء كانت أقل ذيلًا ، إلا أن عددًا صغيرًا كان يحتوي على امتدادات من 1 إلى 4 نانومتر ، ولكن هناك حالات ليس من الواضح فيها ما إذا كان الأدينوزين جزءًا من التسلسل المشفر أو تمت إضافته بعد النسخ. يمكن أن تعكس هذه الجزيئات إضافة oligo (A) ، أو يمكن أن تكون إما في مرحلة ما قبل تخليق الذيل أو وسط تدهور 3′-5. لذلك ، كما هو الحال في العديد من الدراسات السابقة حول ارتباط الأدينيل العابر ، فإن الطرق المتحيزة مثل oligo (dT) RT-PCR ضرورية لعرض ذيول داخلية طويلة وتقييم تركيبها nt ، والتي يمكن أن تؤدي غالبًا إلى هوية عامل polyadenylating (7 ، 19) ).

نصوص مقطوعة ، Intron-Less-Actin تحتوي على ذيول متجانسة أو غير متجانسة.

للتحقق مما إذا كان ، بالإضافة إلى الرنا الريباسي ، يمكن أن يخضع mRNA لهذه العملية ، تم تحليل وجود جزيئات β-actin mRNA المقطوعة باستخدام oligo (dT) RT-PCR. تم تطبيق البادئات الخاصة بالجينات التي استهدف بعضها تسلسل الرنا المرسال على الفور في بداية الإنترونات ، مما قد يسمح بعزل كل من شظايا-actin المقسمة وغير المقسمة. كما هو مبين في الشكل 2أ، تم عزل شظايا-actin المقطوعة ومشابهه للـ rRNA ، وقد لوحظت كل من ذيول متجانسة وغير متجانسة. أيضًا ، تم الحصول على هذه الجزيئات من كل من الكسور النووية والهيولية (الجدول S1). لم يكن هناك أي إنترونات بين المتواليات المعزولة ، مما يكشف عن أن هذه (جزئيًا ، إن لم يكن بالكامل) نسخ مقسمة. تظهر هذه النتائج أنه مثل الرنا الريباسي ، يمكن أن يخضع الرنا المرسال لتضخم عابر.

(أ) شظايا-actin المقسمة مع ذيول بولي (A) متجانسة أو غير متجانسة ، معزولة عن الخلايا البشرية. يتم تقديم مرنا بيتا أكتين الأولي بشكل تخطيطي (الإنترونات باللون الأسود ، والإكسونات باللون الرمادي). يتم عرض أطوال كل exon / intron. يتم عرض ذيول متجانسة وغير متجانسة فوق الجين وتحته ، على التوالي (الجدول S1). (ب) عزل Oligo (dT) RT-PCR لجزيئات VV RNA المقتطعة والمعدلة [G8R (مرنا فيروسي) و GFP (مدمجة في الجينوم الفيروسي)] من خلايا هيلا بعد 4 ساعات من تعداء (الجدول S3).

تم عزل الحمض النووي الريبي لفيروس اللقاح المقطوع الذي يحمل ذيولًا متجانسة أو غير متجانسة من الخلايا المصابة.

بالإضافة إلى مقايسات نقاء التجزئة (الشكل 1أ) ، لضمان أن جزيئات الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من الكسور السيتوبلازمية كما هو موضح سابقًا لم تكن وسيطة لعملية نووية "تسربت" إلى السيتوبلازم ، إما في الجسم الحي أو أثناء إجراءاتنا التجريبية ، اعتمدنا نهجًا إضافيًا: اللقاح الفيروسي ( VV) ينتمي إلى عائلة فيروس الجدري ويحتوي على جينوم DNA مزدوج الشريطة ، يشفر أكثر من 200 بروتين. تعد فيروسات الجدري فريدة من نوعها بين معظم فيروسات الحمض النووي من حيث أنها لا تدخل النواة خلال دورة حياتها بأكملها (20). للتحقق مما إذا كان الحمض النووي الريبي الفيروسي يتعرض لتضخم عابر داخل السيتوبلازم ، تمت تنقية الحمض النووي الريبي من خلايا هيلا المصابة وتحليلها لوجود نسخ مقطوعة من الجينات المشفرة في الجينوم الفيروسي. الصورة 2ب يعرض نتائج تحليل G8R mRNA ، وهو جين فيروسي وسيط و GFP mRNA ، تم إنتاجه من جين GFP تم إدخاله في الجينوم الفيروسي (21). تم الكشف عن النسخ المقتطعة التي نشأت من هذه الجينات ، مع ذيول متجانسة أو غير متجانسة. توفر هذه النتائج دعمًا إضافيًا لوجود آلية تتضمن ارتباط بعديد الأدينيل RNA العابر في السيتوبلازم ولا تنطبق فقط على الرنا الريباسي ، ولكن أيضًا على الرنا المرسال. وفقًا لذلك ، كانت الخطوة التالية هي التحقق مما إذا كان هناك ارتباط بين هذا النوع من ارتباط الحمض النووي الريبي الغداني واضمحلال الحمض النووي الريبي ، كما هو الحال في جميع الأنظمة التي سبق دراستها والتي تم العثور فيها على هذه الجزيئات.

هل تحلل النصوص المتعددة الأدينيلات المقتطعة وسيطة؟

في جميع الأنظمة التي تم فيها اكتشاف جزيئات الحمض النووي الريبي المقتطعة والمعدلة ، تبين لاحقًا أنها وسيطة في مسار تحلل الحمض النووي الريبي بمساعدة (A). سألنا ما إذا كانت ذيول الملاحظة هنا ، في السيتوبلازم ، هي بالفعل علامات منبهة لمثل هذه العملية. إذا كان الأمر كذلك ، فإن تثبيط نشاط التحلل الخارجي سيؤدي إلى تراكمها ، كما لوحظ في البكتيريا ، والميتوكوندريا النباتية ، ونواة الخميرة والخلايا البشرية (12-14 ، 22). تحقيقا لهذه الغاية ، استخدمنا RNAi لضرب (KD) hXrn1 والوحدات الفرعية exosome. بالنسبة لهذا الأخير ، تم استهداف PM / Scl-100 ، وهو نوكلياز خارجي مرتبط بالبروتين الخارجي و hRrp41 ، وهو بروتين أساسي خارجي. كشفت اللطخات المناعية عن بروتين KD مهم للبروتينات المستهدفة (الشكل 3أ). تم التحقق من صحة الانخفاض في نشاط الإكسوسوم من خلال تراكم طليعة الرنا الريباسي 5.8S في كل من خلايا PM / Scl-100 و hRrp41 الصامتة (الشكل 3).ب) (13, 23).

إسكات RNAi بوساطة من الوحدات الفرعية exosome ، hXrn1 ، hXrn2 ، و Lsm1. (أ) تم قياس كفاءة الإسكات عن طريق لطخة مناعية بأجسام مضادة محددة. (ب) تم التحقق من صحة فقدان نشاط exosome من خلال تراكم سلائف 5.8S rRNA كما تم الكشف عنها بواسطة لطخة الشمالية. (ج) تمت مراقبة كفاءة KD لبروتينات RNAi التي لا تتوفر لها أجسام مضادة بواسطة RT-PCR. تم تطبيع اللطخات المناعية و RT-PCR باستخدام بيتا أكتين.

المواد الوسيطة للتحلل غير وفيرة وسريعة التدهور ومن ثم فمن المفيد تحليل النصوص المعبر عنها بدرجة عالية لمثل هذه الجزيئات ذات الصلة. لذلك ، اخترنا التركيز على منطقة 28S rRNA التي تم عزل الشظايا الغدانية عن طريق oligo (dT) RT-PCR ، كما هو موضح سابقًا. للتقييم البصري لتراكم الرنا الريباسي 28S المجزأ والمعدن ، تم تطبيق مقايسة العلامات الإشعاعية على كميات التحميل وفقًا لـ B2M mRNA عبر RT-PCR (الشكل 4).أ). بعد النسخ العكسي oligo (dT) ، تم استخدام نفس البادئات التي تم بها عزل الجزيئات المقطوعة مسبقًا ولكن هذه المرة ، تم تضمين مرحلة PCR إضافية تم فيها تسمية المنتجات عبر 5 end [32 P] 28S rRNA التمهيدي ، . التجزيء على تغيير طبيعة هلام بولي أكريلاميد ، سمح بتقييم حساس لتراكم منتجات التضخيم المسمى. نظرًا لأن الجزيئات المقتطعة كانت متعددة الأدينيلات في مواقع مختلفة على طول الرنا الريباسي 28S (الشكل 1ب) ، وكانت الامتدادات ذات أطوال مختلفة ، ولم ينتج عن التراكم نطاق واحد ، بل إشارة ملطخة بدلاً من ذلك. لوحظ تراكم كبير لشظايا الرنا الريباسي 28S المقطوعة في الممرات التي تمثل إسكات RNAi لـ PM / Scl-100 و hXrn1 (الشكل 4).ب). على الرغم من الإبلاغ عن وجود PM / Scl-100 (Rrp6 في الخميرة) في السيتوبلازم ، إلا أنه يوجد بشكل أساسي في نواة الخلايا البشرية بالاشتراك مع الجسيم الخارجي النووي (24 ، 25). لذلك ، فإن الإشارة المقابلة في هذا الممر هي على الأرجح نتيجة لتراكم وسيطة تحلل النواة المترجمة. في المقابل ، كان تراكم شظايا الرنا الريباسي 28S المقتطعة أقل خطورة في الخلايا التي تم إخمادها hRrp41.

يتراكم بشكل كبير في الخلايا Adenylated 28S rRNA تحلل الرنا الريباسي عند إسكات RNAi من نوكليازات خارجية رئيسية. (أ) عرض تخطيطي لمقايسة وسم PCR للكشف عن تراكم جزيئات الرنا الريباسي 28S المقتطعة والمبتورة بعد نوكلياز خارجي KD. باختصار ، بعد oligo (dT) RT من RNA من خلايا KD مختلفة ، PCR مع [32 P] - تمهيدي خاص بالجينات (علامة النجمة نفسها المستخدمة لعزل الجزيئات كما هو موضح في الشكل 1ب) ومحول قلة. (ب) تم إخضاع الحمض النووي الريبي المنقى من الخلايا الوهمية وخلايا KD HeLa لهذا التحليل لتقييم تراكم الرنا الريباسي 28S المجزأ والمتعدد الأدينيل. تظهر هجرة علامات الحمض النووي إلى اليسار (أرقام النيوكليوتيدات). (ج) تم إخضاع الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي أو النووي من الخلايا التي تم فيها إسكات البروتينات المشار إليها بواسطة RNAi ، لعلامة oligo (dT) RT-PCR. يظهر عنصر تحكم ، مع حذف النسخ العكسي من التفاعل ، في أقصى الحارة اليمنى لكل لوحة. (د) للتحقق من أن منتجات PCR نشأت من نسخ متعددة الأدينيلات ، تم إجراء تحكم حيث تمت إزالة ذيول بولي (A) من الكسور السيتوبلازمية عن طريق الحضانة مع oligo (dT) و RNase H قبل oligo (dT) -primed RT-PCR وضع العلامات.أدى ذلك إلى تقليل إشارات التضخيم إلى مستويات الخلفية ، مقارنةً بعينة hXrn1 التي عولجت باستخدام RNase H ولكن بدون oligo (dT) [الممر المسمى hXrn1 (-)].

يلعب hXrn1 دورًا مركزيًا في تدهور 5′-3 RNA في السيتوبلازم. بشكل بديهي ، أدى إسكاته إلى تراكم كبير لجزيئات polyadylated. يوضع التوطين السيتوبلازمي لهذه النصوص من خلال hXrn1 ولكن السؤال الواضح هو لماذا يؤدي تثبيط نوكلياز خارجي 5’-3 إلى تراكم مواد وسيطة مع 3 نهايات بولي (أ). سيتم تناول هذه المشكلة في مناقشة.

معًا ، تشير المعلومات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الاختبار إلى أن شظايا الرنا الريباسي 28S المعزولة متعددة الأدينيلات هي في الواقع مواد وسيطة للتحلل. لتحديد الموقع الخلوي بشكل نهائي ، تكررت التحليلات الموصوفة هنا بعد تجزئة النواة والسيتوبلازم. أيضًا ، لمزيد من التحقيق في ما إذا كان النواة الخارجية متورطة في هذه العملية ، تم تقليل العديد من الوحدات الفرعية الإضافية و exoribonucleases.

أكد إسكات RNAi من Exoribonucleases أن تحلل RNA بمساعدة Poly (A) موجود في سيتوبلازم الخلايا البشرية.

لتأكيد أن تحلل الحمض النووي الريبي الغدي عابرًا يحدث في سيتوبلازم الخلايا البشرية ، تم تكرار التحليل بعد تحضير الكسور النووية والهيولية. تم التخلص من مكونين أساسيين إضافيين من exosome ، وهما hRrp40 و PM / Scl-75 ، واثنين من نوكليازات exoribonucleases ، hDis3 و hDis3L. hDis3 هو متماثل لبروتين الخميرة Dis3 وهو تحلل هيدروليكي 3′-5 exoribonuclease مع نشاط داخلي إضافي يرتبط بالجسيم الخارجي في كل من النواة والسيتوبلازم في الخميرة. يعمل هذا البروتين كوحدة فرعية تحفيزية في إكسوسوم الخميرة السيتوبلازمية (25 ، 26). أثناء تقدم هذا العمل ، تم اكتشاف متماثل إضافي لـ Dis3 في الخلايا البشرية ، hDis3L ، وعلى عكس hDis3 ، وجد أنه مرتبط بقوة بالنواة الخارجية وللتوطين في السيتوبلازم. لذلك ، هو الأكثر احتمالا Dis3 تقويم العظام في الخلايا البشرية وتم إدراج إسكاته (27). تم إسكات إنزيمين إضافيين: hXrn2 و Lsm1. الأول هو نوكلياز خارجي كبير موضعي النواة 5′-3 وبالتالي يمكن توقع أن يتسبب KD الخاص به في تراكم في النواة ولكن ليس في السيتوبلازم (4). تلعب بروتينات Lsm دورًا مشابهًا لبروتينات Hfq البكتيرية ، المتورطة في تحلل الرنا المرسال البكتيري عبر إضافة الذيل. يرتبط Lsm1 بـ hXrn1 ، والإنزيمات المقطوعة (Dcp1 / Dcp2) ، واضمحلال mRNA في السيتوبلازم. أيضًا ، ثبت أنه متورط بشكل مباشر في تسوس هيستون mRNA oligo (U) بوساطة. وبالتالي ، تم تقييم تأثير إسكات RNAi أيضًا (28). أظهر التقدير الكمي لـ RT-PCR ، بسبب نقص الأجسام المضادة المناسبة ، انخفاضًا كبيرًا في مستويات الرنا المرسال للبروتينات الصامتة (الشكل 3).ج).

لم يلاحظ أي تراكم في سيتوبلازم الخلايا التي تم إسكاتها من مكونات الجسيمات الخارجية ، hRrp40 أو PM / Scl-75 ، ويمكن ملاحظة تراكم طفيف فقط في الكسور النووية (الشكل 4).ج). في المقابل ، أدى KD لأي من hDis3 أو hDis3L إلى تراكم حشوي متميز لشظايا الرنا الريباسي 28S المقطوعة ، مما يشير إلى أن هذين البروتينين متورطان في عملية التحلل. كما هو متوقع ، تسبب إسكات hXrn1 و PM / Scl-100 في تراكم كبير في الجزء السيتوبلازمي والنووي ، على التوالي ، و K من hXrn2 نتج عنه تراكم فقط في الجزء النووي. لم ينتج عن إسكات Lsm1 تراكم داخل أي من الكسر. للتأكد من أن المنتجات ذات العلامات التي لوحظت في الهلام قد تم الحصول عليها بالفعل عن طريق تضخيم جزيئات الرنا الريباسي 28S متعددة الأدينيلات وليس القطع الأثرية للنسخ العكسي غير المحدد ، تم تحضين الحمض النووي الريبي المنقى من السيتوبلازم باستخدام RNase H و oligo (dT) قبل oligo (dT). ) - النسخ العكسي الأساسي (الشكل 4د). بهذه الطريقة ، ستتم إزالة جميع ذيول بولي (A) ولن يتم إنتاج أي كدنا أثناء RT اللاحق الأولي (dT). في الواقع ، قلل هذا العلاج الإشارات المضخمة المرصودة إلى مستوى الخلفية. يتضح بشكل خاص عند مقارنة النتيجة التي تم الحصول عليها للحمض النووي الريبي المنقى من خلايا صامتة hXrn1 والتي تم تحضينها إما باستخدام RNase H وحده أو مع RNase H مع oligo (dT) (الشكل 4).د).

تؤكد هذه النتائج معًا أن الرنا الريباسي يمكن أن يتأخر بشكل عابر ، ليس فقط في نواة الخلايا البشرية ، ولكن في السيتوبلازم أيضًا ، وهذا مرتبط بتحلل الرنا الريباسي. في السيتوبلازم ، تشتمل نوكليازات exoribonucleases المعنية على hDis3L ، و hDis3 ، و hXrn1 ، حيث تتراكم المواد الوسيطة للتحلل الغدي عند تنظيمها السفلي.

Exosome أو hPNPase لا يسبب إسكات الخلايا انخفاضًا في النسبة المئوية للنسخ غير المتجانسة.

في هذه المرحلة ، حاولنا تحديد الإنزيم المسؤول عن إضافة ذيول ، ولا سيما تلك ذات الطبيعة غير المتجانسة. PNPase و exosome البدائي مسؤولان عن كل من الذيل غير المتجانسة والمذلة البكتيرية والعضوية والحمض النووي الريبي الأثري (7). كان exosome حقيقيات النوى المماثل هيكليًا في البداية مرشحًا للنشاط غير المتجانسة الذي لوحظ هنا ، وإذا كان مسؤولاً عن إنتاج ذيول مغايرة ، فمن المتوقع حدوث تحول لصالح الامتدادات المتجانسة على KD الخاص به. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن أن الجسيم الخارجي يفتقر إلى نشاط تحلل الفوسفور (25) وبالتوافق مع هذا ، وجدنا أن النسبة المئوية للذيل المتماثل ضمن المبلغ الإجمالي للنسخ المعزولة والمتسلسلة لم تزداد عند KD من الوحدات الفرعية exosome ، hRrp41 ، PM / Scl-100 و PM / Scl-75 (الشكل 5).

النسبة المئوية للجزيئات ذات الذيل المتجانسة المعزولة من خلايا هيلا مع إسكات RNAi لمكونات exosome أو hPNPase ، والخلايا المصابة بـ VV ، والخميرة. لم تزد النسبة المئوية للجزيئات ذات الذيل المتجانس بين العدد الإجمالي للجزيئات المتسلسلة المعزولة من خلايا هيلا عند إسكات RNAi لـ: hRrp41 أو PM / Scl-75 أو PM / Scl-100 أو hPNPase (تم تحليل 28S rRNA). في الخلايا المصابة بفيروس VV ، تم تحليل الحمض النووي الريبي G8R الفيروسي وفي S. cerevisiaeو 25S rRNA و CYH2 و Actin1 (الجداول S3 و S4 و S5).

يوجد PNPase في الخلايا البشرية (hPNPase) ونشط الفوسفور (29). على الرغم من أنها مترجمة إلى الفضاء بين الغشاء الميتوكوندريا (IMS) (30) ، فقد نظرنا في إمكانية تحرير hPNPase ، على غرار بروتينات IMS الأخرى مثل السيتوكروم C والنوكلياز الداخلي G (31) ، من هذه الحجرة ودخول السيتوبلازم (و / أو النواة) ، حيث يمكنها بلمرة الذيل المتغاير. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي زيادة في معدل الذيل المتجانس في الخلايا ذات hPNPase الثابت shRNA إما لإسكات (32).


Topisirovic ، I. ، Svitkin ، Y. V. ، Sonenberg ، N. & amp Shatkin ، A.J. RNA 2, 277–298 (2011)

Chen ، Y. G. ، Kowtoniuk ، W. E. ، Agarwal ، I. ، Shen ، Y. & amp Liu ، D.R LC / MS تحليل الحمض النووي الريبي الخلوي يكشف عن الحمض النووي الريبي المرتبط بـ NAD. علم الطبيعة. بيول. 5, 879–881 (2009)

Houtkooper، R.H، Cantó، C.، Wanders، R.J & amp Auwerx، J. الحياة السرية لـ NAD +: مستقلب قديم يتحكم في مسارات إشارات التمثيل الغذائي الجديدة. إندوكر. القس. 31, 194–223 (2010)

أوبنهايمر ، N.J.NAD + و NADP + كمجموعات اصطناعية للإنزيمات. eLS http: //dx.doi/org/10.1002/9780470015902.a0000637.pub2 (2010)

Deana، A.، Celesnik، H. & amp Belasco، J.G. الإنزيم البكتيري RppH يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي المرسال بواسطة إزالة 5 ′ بيروفوسفات. طبيعة سجية 451, 355–358 (2008)

Mackie ، G. A. Ribonuclease E هو نوكلياز داخلي يعتمد على 5′ نهاية. طبيعة سجية 395, 720–724 (1998)

Frick، D.N & amp Bessman، M. J. الاستنساخ والتنقية وخصائص رواية NADH بيروفوسفاتاز. دليل على المجال التحفيزي للنيوكليوتيدات بيروفوسفاتيز في إنزيمات شبيهة بـ MutT. J. بيول. تشيم. 270, 1529–1534 (1995)

Walseth ، T. F. & amp Lee ، H. C. توليف وتوصيف الخصوم لإفراز Ca 2+ الذي يسببه cyclic-ADP-ribose. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1178, 235–242 (1993)

Preugschat ، F. ، Tomberlin ، G. H. & amp Porter ، D. J. تفاعل التبادل الأساسي لـ NAD + glycohydrolase: تحديد ركائز بديلة غير متجانسة. قوس. بيوتشيم. بيوفيز. 479, 114–120 (2008)

Migaud ، M.E ، Pederick ، ​​R. L. ، Bailey ، V.C & amp Potter ، B. V. Probing أبليسيا كاليفورنيكا الأدينوزين 5′-ثنائي فوسفات ريبوسيل سيكلاز لمتطلبات ربط الركيزة: تصميم مثبطات قوية. الكيمياء الحيوية 38, 9105–9114 (1999)

Rostovtsev، V. V.، Green، L.G، Fokin، V. & amp Sharpless، K.B. انجيو. تشيم. كثافة العمليات إيدن إنجل. 41, 2596–2599 (2002)

Tornøe ، C.W. ، Christensen ، C. & amp Meldal ، M. Peptidotriazoles على الطور الصلب: [1،2،3] -Triazoles بواسطة النحاس (I) المحفز 1.3-dipolar cycloadditions من الألكينات الطرفية للأزيدات. J. Org. تشيم. 67, 3057–3064 (2002)

هوانغ ، ف. التضمين الفعال لـ CoA و NAD و FAD في RNA بواسطة في المختبر النسخ. الدقة الأحماض النووية. 31، e8 (2003)

Opdyke ، J. A. ، Fozo ، E.M ، Hemm ، M.R & amp Storz ، G. RNase III يشارك في انقسام GadY المعتمد على جادكس-جادو مرنا. جيه مول. بيول. 406, 29–43 (2011)

Opdyke ، J. A. ، Kang ، J.G & amp Storz ، G. GadY ، وهو منظم RNA صغير لجينات الاستجابة الحمضية في الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 186, 6698–6705 (2004)

Gerhart E، H. & amp Nordström، K. التحليل الإنشائي لجزيء RNA يشارك في التحكم في النسخ المتماثل للبلازميد R1. الدقة الأحماض النووية. 14, 2523–2538 (1986)

Lacatena ، R. M. & amp Cesareni ، G. الاقتران الأساسي لـ RNA I مع تسلسله التكميلي في السلائف التمهيدي يمنع تكرار ColE1. طبيعة سجية 294, 623–626 (1981)

D’Alessio، G. & amp Josse، J. Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase، phosphoglycerate kinase، and phosphoglyceromutase of الإشريكية القولونية. التنقية المتزامنة والخصائص الفيزيائية. J. بيول. تشيم. 246, 4319–4325 (1971)

Masuda، N. & amp Church، G.M. الشبكة التنظيمية لجينات مقاومة الأحماض في الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 48, 699–712 (2003)

Jin ، Y. ، Watt ، R. M. ، Danchin ، A. & amp Huang ، J.D Small noncoding RNA GcvB هو منظم جديد لمقاومة الأحماض في الإشريكية القولونية. علم الجينوم BMC 10, 165 (2009)

هايز ، إي تي وآخرون. يعدل الحد من الأكسجين تنظيم الأس الهيدروجيني للتقويض والهيدروجين ، وناقلات الأدوية المتعددة ، وتكوين الغلاف في الإشريكية القولونية K-12. BMC ميكروبيول. 6, 89 (2006)

Gustavsson، N.، Diez، A. & amp Nyström، T. الإشريكية القولونية يتم تنظيمها بشكل منسق والتعاون في الدفاع ضد تلف الحمض النووي. مول. ميكروبيول. 43, 107–117 (2002)

Eguchi، Y. & amp Tomizawa، J. مركب يتكون من حلقات جذعية مكملة للحمض النووي الريبي وتثبيته بواسطة بروتين: وظيفة بروتين CoIE1 Rom. زنزانة 60, 199–209 (1990)

Dumelin ، C. E. ، Chen ، Y. ، Leconte ، A. M. ، Chen ، Y.G & amp Liu ، D. R. الاكتشاف والتوصيف البيولوجي للحمض النووي الريبي المتضخم في البكتيريا. علم الطبيعة. بيول. 8, 913–919 (2012)

بانديرا ، ك.جيه وآخرون. تدفع منطقة بذرة الحمض النووي الريبي الصغير التدمير المتحكم به للـ mRNA المستهدف بواسطة نوكلياز endoribonuclease RNase E. مول. زنزانة 47, 943–953 (2012)

McLennan، A.G. غموض الركيزة بين هيدرولازات العُرة: أهمية بيولوجية ، أو بقايا تطورية ، أو كليهما؟ زنزانة. مول. علوم الحياة. 70, 373–385 (2013)

Song ، M.G ، Bail ، S. & amp Kiledjian ، M. تمتلك بروتينات عائلة Nudix المتعددة نشاطًا لفك الرنا المرسال. RNA 19, 390–399 (2013)

Gherardini، P. F.، Ausiello، G.، Russell، R.B & amp Helmer-Citterich، M. هندسة معيارية لجيوب ربط النوكليوتيدات. الدقة الأحماض النووية. 38, 3809–3816 (2010)

Bandyra، K. J.، Bouvier، M.، Carpousis، A.J & amp Luisi، B. F. النسيج الاجتماعي للـ RNA المتحلل. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 1829, 514–522 (2013)

يسمح Fjeld ، C. C. ، Birdsong ، W. T. & amp Goodman ، R.H. الارتباط التفاضلي لـ NAD + و NADH لبروتين ربط الكاربوكسيل الطرفي النسخي للعمل كمستشعر استقلابي. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 100, 9202–9207 (2003)

ت. بابا وآخرون. بناء الإشريكية القولونية K-12 في إطار ، طفرات خروج المغلوب أحادية الجين: مجموعة Keio. مول. النظام. بيول. 2, 2006.0008 (2006)

هافنر ، م وآخرون. تحديد microRNAs وغيرها من الحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير باستخدام تسلسل مكتبة (كدنا). أساليب 44, 3–12 (2008)

Lohse ، M. وآخرون. RobiNA: حل برمجي متكامل سهل الاستخدام لنسخ النصوص المستندة إلى RNA-Seq. الدقة الأحماض النووية. 40، W622 – W627 (2012)

Halbritter، F.، Vaidya، H.J & amp Tomlinson، S.R GeneProf: تحليل تجارب التسلسل عالي الإنتاجية. طرق الطبيعة 9, 7–8 (2012)

Flicek ، P. وآخرون. انسمبل 2013. الدقة الأحماض النووية. 41، D48 – D55 (2013)

Langmead ، B. ، Trapnell ، C. ، Pop ، M. & amp Salzberg ، S. L. محاذاة فائقة السرعة وفعالة للذاكرة لتسلسلات الحمض النووي القصيرة للجينوم البشري. جينوم بيول. 10، R25 (2009)

Nicol، J.W، Helt، G. A.، Blanchard، S.G، Jr، Raja، A. & amp Loraine، A.E. متصفح الجينوم المتكامل: برنامج مجاني لتوزيع واستكشاف مجموعات البيانات على نطاق الجينوم. المعلوماتية الحيوية 25, 2730–2731 (2009)

كيزيلر ، آي إم وآخرون. EcoCyc: دمج قواعد بيانات الكائنات الحية النموذجية مع بيولوجيا الأنظمة. الدقة الأحماض النووية. 41، D605 – D612 (2013)

Bernofsky، C. & amp Gallagher، W. J. نقل الهيدروجين غير الأنزيمي بين نيوكليوتيدات بيريدين المختزلة والمؤكسدة. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 659, 1–6 (1981)

Celesnik ، H. ، Deana ، A. & amp Belasco ، J.G PABLO تحليل RNA: حالة 5′-phosphorylation ورسم خرائط 5′-end. طرق الانزيم. 447, 83–98 (2008)

Celesnik ، H. ، Deana ، A. & amp Belasco ، J.G بدء اضمحلال الحمض النووي الريبي في الإشريكية القولونية بنسبة 5 ′ إزالة بيروفوسفات. مول. زنزانة 27, 79–90 (2007)

Tomcsányi، T. & amp Apirion، D. معالجة إنزيم ribonuclease E يشق على وجه التحديد RNA I. مثبط لتشكيل التمهيدي في تخليق DNA البلازميد. جيه مول. بيول. 185, 713–720 (1985)

Masukata ، H. & amp Tomizawa ، J. التحكم في تشكيل التمهيدي لتكرار البلازميد ColE1: التغيير التوافقي لنسخة التمهيدي. زنزانة 44, 125–136 (1986)

Blomberg، P.، Wagner، E.G & amp Nordström، K. التحكم في تكرار البلازميد R1: تتم معالجة الازدواج بين RNA المضاد المعنى ، CopA ، وهدفه ، CopT ، على وجه التحديد في الجسم الحي و في المختبر بواسطة RNase III. EMBO J. 9, 2331–2340 (1990)

Sharma، C.M، Darfeuille، F.، Plantinga، T.H & amp Vogel، J. A small RNAs ينظم العديد من mRNAs الناقل ABC من خلال استهداف العناصر الغنية بـ C / A داخل ومنبع مواقع ربط الريبوسوم. تطوير الجينات. 21, 2804–2817 (2007)

Thomason، M.K، Fontaine، F.، De Lay، N. & amp Storz، G. RNA صغير ينظم الحركة وتكوين الأغشية الحيوية استجابة للتغيرات في توافر المغذيات في الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 84, 17–35 (2012)

يورجنسن ، إم جي وآخرون. تتحكم RNAs التنظيمية الصغيرة في نمط الحياة اللاصق متعدد الخلايا الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 84, 36–50 (2012)

Jørgensen، M.G، Thomason، M.K، Havelund، J.، Valentin-Hansen، P. & amp Storz، G. الوظيفة المزدوجة للحمض النووي الريبي الصغير McaS في التحكم في تكوين الأغشية الحيوية. تطوير الجينات. 27, 1132–1145 (2013)

راسموسن ، إيه إيه وآخرون. يعزز الحمض النووي الريبي الصغير المحفوظ إسكات بروتين الغشاء الخارجي YbfM. مول. ميكروبيول. 72, 566–577 (2009)

Mandin، P. & amp Gottesman، S. يُحدد الأسلوب الجيني لإيجاد منظمات RNA صغيرة للجينات ذات الأهمية RybC على أنه ينظم نظام DpiA / DpiB المكون من عنصرين. مول. ميكروبيول. 72, 551–565 (2009)

ويلباتشر ، ت. وآخرون. مكون جديد لـ sRNA في النظام التنظيمي لتخزين الكربون لـ الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 48, 657–670 (2003)

Lease، R. A.، Smith، D.، McDonough، K. & amp Belfort، M. يعتبر DsrA RNA الصغير غير المشفر منظمًا لمقاومة الحمض في الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 186, 6179–6185 (2004)

Sledjeski ، D. D. ، Gupta ، A. & amp Gottesman ، S. يعتبر RNA الصغير ، DsrA ، ضروريًا للتعبير عن درجات الحرارة المنخفضة لـ RpoS أثناء النمو الأسي في الإشريكية القولونية. EMBO J. 15, 3993–4000 (1996)

ليز ، ر.أ. & بلفور ، م عبر- تمثيل الحمض النووي الريبي كمفتاح تحكم في الإشريكية القولونية: DsrA يعدل الوظيفة من خلال تشكيل هياكل بديلة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 97, 9919–9924 (2000)

ليز ، R. A. ، Cusick ، ​​M. E. & amp Belfort ، M. Riboregulation in الإشريكية القولونية: DsrA RNA يعمل بواسطة RNA: تفاعلات RNA في مواقع متعددة. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 95, 12456–12461 (1998)

Göpel، Y.، Papenfort، K.، Reichenbach، B.، Vogel، J. & amp Görke، B. الاضمحلال المستهدف للحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير بواسطة بروتين محول لـ RNase E والتصدي بواسطة RNA المضاد للمحول. تطوير الجينات. 27, 552–564 (2013)

Urban، J.H & amp Vogel، J. يعمل اثنان من الحمض النووي الريبي غير المشفر على ما يبدو متماثلًا بشكل هرمي للتنشيط glmS ترجمة mRNA. بلوس بيول. 6، e64 (2008)

Reichenbach، B.، Maes، A.، Kalamorz، F.، Hajnsdorf، E. & amp Görke، B. glmS التعبير ويخضع للتنظيم عن طريق مادة البولي أدينيل في الإشريكية القولونية. الدقة الأحماض النووية. 36, 2570–2580 (2008)

Moon، K. & amp Gottesman، S. A PhoQ / P- ينظم الحمض النووي الريبي الصغير حساسية الإشريكية القولونية إلى الببتيدات المضادة للميكروبات. مول. ميكروبيول. 74, 1314–1330 (2009)

فوزو ، إي إم وآخرون. قمع تخليق البروتينات السامة الصغيرة بواسطة الحمض النووي الريبي الصغير Sib و OhsC. مول. ميكروبيول. 70, 1076–1093 (2008)

فوجل ، جيه وآخرون. RNomics في الإشريكية القولونية يكتشف أنواع الحمض النووي الريبي الجديد ويشير إلى ناتج نسخي متوازي في البكتيريا. الدقة الأحماض النووية. 31, 6435–6443 (2003)

بلاسي ، إف وآخرون. تثبيط نسخ أوبرا الهيستيدين في المختبر بواسطة الإنزيم الأول لمسار الهيستيدين. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 70, 2692–2696 (1973)

Richards، J.، Luciano، D.J & amp Belasco، J.G. تأثير الترجمة على تدهور الرنا المرسال المعتمد على RppH في الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 86, 1063–1072 (2012)

Nobelmann، B. & amp Lengeler، J.W. التحليل الجزيئي لجينات الجات من الإشريكية القولونية ودورها في نقل الجالاكتيتول والتمثيل الغذائي. J. باكتيريول. 178, 6790–6795 (1996)

تاكر ، دي إل ، تاكر ، إن آند أمبير كونواي ، T. تحديد ملامح التعبير الجيني لاستجابة الأس الهيدروجيني في الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 184, 6551–6558 (2002)

Peng ، C. A. ، Oliver ، M. J. & amp Wood ، A. J. Is the Rehydrin TrDr3 من تورتولا ريفيريس المرتبطة بتحمل البرودة والملوحة وانخفاض درجة الحموضة؟ التقييم الفسيولوجي لتقويم العظام TrDr3 ، HdeD من الإشريكية القولونية استجابة للإجهاد اللاأحيائي. مصنع بيول. 7, 315–320 (2005)

Lawther، R.P & amp Hatfield، G.W. الإشريكية القولونية K-12. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 77, 1862–1866 (1980)

بورتا ، إي وآخرون. ال yfhQ جين الإشريكية القولونية يشفر الحمض الريبي النووي النقال: Cm32 / Um32 ميثيل ترانسفيراز. BMC مول. بيول. 7, 23 (2006)

Elovson، J. & amp Vagelos، P. R. Acyl carrier protein. X. تركيبة البروتين الناقل الأسيل. J. بيول. تشيم. 243, 3603–3611 (1968)

Lu، P.، Vogel، C.، Wang، R.، Yao، X. & amp Marcotte، E.M يقدّر التنميط المطلق للتعبير عن البروتين المساهمات النسبية لتنظيم النسخ والترجمة. Nature Biotechnol. 25, 117–124 (2007)

Rudolph ، F. B. & amp Fromm ، H. J. تنقية وخصائص الأسبارتاز من الإشريكية القولونية. قوس. بيوتشيم. بيوفيز. 147, 92–98 (1971)

Karsten، W. E. & amp Viola، R. E. الدراسات الحركية لـ L-aspartase من الإشريكية القولونية: يتغير النشاط المعتمد على الرقم الهيدروجيني. قوس. بيوتشيم. بيوفيز. 287, 60–67 (1991)

Maki ، Y. ، Yoshida ، H. & amp Wada ، A. بروتينان ، YfiA و YhbH ، مرتبطان بالريبوسومات المستريحة في المرحلة الثابتة الإشريكية القولونية. خلايا الجينات 5, 965–974 (2000)

Agafonov، D. E.، Kolb، V.A، Nazimov، I.V & amp Spirin، A. S. بروتين موجود في واجهة الوحدة الفرعية للريبوسوم البكتيري. بروك.ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 96, 12345–12349 (1999)

Vila-Sanjurjo، A.، Schuwirth، B. S.، Hau، C.W & amp Cate، J.H. الأساس الهيكلي للتحكم في بدء الترجمة أثناء الإجهاد. هيكل الطبيعة. مول. بيول. 11, 1054–1059 (2004)

Agafonov، D. E.، Kolb، V.A & amp Spirin، A. S. Ribosome-related protein الذي يمنع الترجمة في مرحلة ربط aminoacyl-tRNA. ممثل EMBO. 2, 399–402 (2001)

Kim، K. S. & amp Lee، Y. تنظيم التكوّن الحيوي للحمض النووي الريبي 6S عن طريق تبديل استخدام عوامل سيجما والنوكليازات الداخلية. الدقة الأحماض النووية. 32, 6057–6068 (2004)

ويبر إم إم ، فرينش ، سي إل ، بارنز ، إم بي ، سيجيل ، دي إيه وأمب ماكلين ، آر جي. yjfO (bsmA)، تأثيرات الإشريكية القولونية تكوين الأغشية الحيوية والاستجابة للتوتر. علم الاحياء المجهري 156, 139–147 (2010)

Robbins، J.C & amp Oxender، D.L. أنظمة النقل للألانين والسيرين والجليسين في الإشريكية القولونية K-12. J. باكتيريول. 116, 12–18 (1973)

Ghrist، A.C & amp Stauffer، G. V. The الإشريكية القولونية نظام نقل الجليسين ودوره في تنظيم نظام إنزيم انقسام الجليسين. علم الاحياء المجهري 141, 133–140 (1995)

Pulvermacher ، S. C. ، Stauffer ، L. T. & amp Stauffer ، G. V. دور sRNA GcvB في تنظيم سيكا في الإشريكية القولونية. علم الاحياء المجهري 155, 106–114 (2009)

Hugovieux-Cotte-Pattat، N. & amp Robert-Baudouy، J. اتجاه التنظيم والنسخ exuR، وهو القامع ذاتي التنظيم في الإشريكية القولونية K-12. جيه مول. بيول. 156, 221–228 (1982)

Rodionov، D. A.، Mironov، A. A.، Rakhmaninova، A.B & amp Gelfand، M. S. تنظيم النسخ لأنظمة النقل والاستفادة من hexuronides و hexuronates و hexonates في بكتيريا جاما الأرجواني. مول. ميكروبيول. 38, 673–683 (2000)

كول ، إس تي وآخرون. تسلسل النوكليوتيدات والعلاقات بين الجينات والببتيد glpABC أوبرون ترميز اللاهوائية sn- نازعة هيدروجين الجلسرين -3 فوسفات الإشريكية القولونية K-12. J. باكتيريول. 170, 2448–2456 (1988)

Schryvers، A.، Lohmeier، E. & amp Weiner، J.H. الخواص الكيميائية والوظيفية للأشكال الأصلية والمعاد تكوينها للغشاء ، الجلسرين الهوائي-3-فوسفات ديهيدروجينيز من الإشريكية القولونية. J. بيول. تشيم. 253, 783–788 (1978)

سامرز ، إم سي وأمبير روز ، آي أ.تفاعلات نقل البروتون لميثيل جليوكسال سينثيز. جيه. تشيم. شركة 99, 4475–4478 (1977)

Plumbridge، J. A. قمع وتحريض نظام تذمر من الإشريكية القولونية K-12: أدوار تذمر و ناجا في الحفاظ على حالة uninduced. مول. ميكروبيول. 5, 2053–2062 (1991)

White، R.J. السيطرة على التمثيل الغذائي للسكر الأميني في الإشريكية القولونية وعزل المسوخات غير القادرة على تحلل السكريات الأمينية. بيوتشيم. ج. 106, 847–858 (1968)

Freundlich، M.، Ramani، N.، Mathew، E.، Sirko، A. & amp Tsui، P. دور عامل مضيف التكامل في التعبير الجيني في الإشريكية القولونية. مول. ميكروبيول. 6, 2557–2563 (1992)

Nelson، W.C، Howard، M. T.، Sherman، J.A & amp Matson، S.W The صينية تحفيز منتج الجينات وعامل مضيف التكامل الإشريكية القولونية يتم تحفيز هليكاز الحمض النووي I-catalase عند موضع البلازميد F. J. بيول. تشيم. 270, 28374–28380 (1995)

Dhavan، G.M، Crothers، D.M، Chance، M.R & amp Brenowitz، M. الربط المنسق والانحناء للحمض النووي بواسطة الإشريكية القولونية عامل مضيف التكامل. جيه مول. بيول. 315, 1027–1037 (2002)

Yanagisawa ، T. ، Sumida ، T. ، Ishii ، R. ، Takemoto ، C. & amp Yokoyama ، S. هيكل الطبيعة. مول. بيول. 17, 1136–1143 (2010)

Kaiser، K. & amp Murray، N. E. التوصيف الفيزيائي لـ "نشرة Rac" في E. القولونية ك 12. مول. الجنرال جينيه. 175, 159–174 (1979)

كالداس ، ت. وآخرون. بروتين الصدمة الحرارية FtsJ / RrmJ من الإشريكية القولونية هو 23 S الريبوسوم RNA methyltransferase. J. بيول. تشيم. 275, 16414–16419 (2000)

ثيوبالد ، A. ، Springer ، M. ، Grunberg-Manago ، M. ، Ebel ، J. P. & amp Giege ، R. الإشريكية القولونية tRNA Thr 3 في الحل والتفاعل بين هذا الحمض الريبي النووي النقال مع مركب threonyl-tRNA المشابه. يورو. J. Biochem. 175, 511–524 (1988)

سيريس ، إم إتش وآخرون. تحديث وظيفي لبرنامج الإشريكية القولونية جينوم K-12. جينوم بيول. 2، RESEARCH0035 (2001)

Tschowri، N.، Busse، S. & amp Hengge، R. يعمل بروتين BLUF-EAL YcgF كمضاد مباشر للقمع في استجابة الضوء الأزرق لـ الإشريكية القولونية. تطوير الجينات. 23, 522–534 (2009)

دالي ، د. تحليل الطوبولوجيا العالمية لـ الإشريكية القولونية بروتين الغشاء الداخلي. علم 308, 1321–1323 (2005)

Lhoest ، J. & amp Colson ، C. تجمع ريبوسوم حساس للبرودة في a الإشريكية القولونية متحولة تفتقر إلى مجموعة ميثيل واحدة في بروتين الريبوسوم L3. يورو. J. Biochem. 121, 33–37 (1981)

Heurgué-Hamard، V.، Champ، S.، Engström، A.، Ehrenberg، M. & amp Buckingham، R.H The هيمك الجين فيها الإشريكية القولونية يشفر ال ن 5 -جلوتامين ميثيل ترانسفيراز الذي يعدل عوامل إطلاق الببتيد. EMBO J. 21, 769–778 (2002)

White، P. J.، Millar، G. & amp Coggins، J.R. الإفراط في التعبير والتنقية وتسلسل الأحماض الأمينية الكاملة من سينسيز المشيمية من الإشريكية القولونية K12 ومقارنته مع إنزيم من نيوروسبورا كراسا. بيوتشيم. ج. 251, 313–322 (1988)

Imamura، R. et al. تحديد cpdA ترميز الجينات دوري 3 ′ ، 5′-أدينوسين أحادي فوسفات فوسفوديستراز في الإشريكية القولونية. J. بيول. تشيم. 271, 25423–25429 (1996)

Long ، C. W. & amp Pardee ، A. B. Cytidine triphosphate synthetase of الإشريكية القولونية ب- التنقية والحركية. J. بيول. تشيم. 242, 4715–4721 (1967)

Py ، B. ، Higgins ، C.F ، Krisch ، H. M. & amp Carpousis ، A.J A DEAD-box RNA hellase in the الإشريكية القولونية تحلل الحمض النووي الريبي. طبيعة سجية 381, 169–172 (1996)

Jeanningros، R.، Creuzet-Sigal، N.، Frixon، C. & amp Cattaneo، J. تنقية وخصائص إنزيم إزالة الامتياز من الإشريكية القولونية. بيوكيم. بيوفيز. اكتا 438, 186–199 (1976)

Ballicora ، M. A. ، Iglesias ، A. A. & amp Preiss ، J. ADP-glucose pyrophosphorylase ، وهو إنزيم تنظيمي لتخليق الجليكوجين البكتيري. ميكروبيول. مول. بيول. القس. 67, 213–225 (2003)

Joly، J.C & amp Wickner، W. الوحدات الفرعية SecA و SecY من ترانسلوكاس هي أقرب جيران للبروتين المسبق الانتقالي ، مما يحميها من الفوسفوليبيد. EMBO J. 12, 255–263 (1993)

Wada، A. & amp Sako، T. الهياكل الأولية والجينات لبروتينات الريبوسوم الجديدة A و B في الإشريكية القولونية. J. Biochem. 101, 817–820 (1987)

Sparrow، C.P & amp Raetz، C.R. تنقية وخصائص مركب CDP-diglyceride المرتبط بالغشاء من الإشريكية القولونية. J. بيول. تشيم. 260, 12084–12091 (1985)

Langley، K. E. & amp Kennedy، E.P. التنقية الجزئية وخصائص CTP: حمض الفوسفاتيديك cytidylyltransferase من أغشية الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 136, 85–95 (1978)

Kanehara ، K. ، Ito ، K. & amp Akiyama ، Y. YaeL (EcfE) ينشط مسار سيجما (E) للاستجابة للضغط من خلال انقسام الموقع 2 لمضاد سيجما (E) ، RseA. تطوير الجينات. 16, 2147–2155 (2002)

ألبا ، ب. م ، ليدز ، جيه أ ، أونوفريك ، سي ، لو ، سي. تطوير الجينات. 16, 2156–2168 (2002)

Takeda ، K. ، Akimoto ، C. & amp Kawamukai ، M. آثار الإشريكية القولونية سفس على الجين mal التعبير الجيني ونشاط ربط الحمض النووي لـ SfsA. بيوسكي. التكنولوجيا الحيوية. بيوتشيم. 65, 213–217 (2001)

Kawamukai، M. et al. تسلسل النوكليوتيدات وتوصيف سفس 1 الجين: سفس 1 متورط في CRP * - معتمد mal التعبير الجيني في الإشريكية القولونية. J. باكتيريول. 173, 2644–2648 (1991)

بول ، ب.جيه وآخرون. DksA: عنصر حاسم في آلية بدء النسخ التي تعزز تنظيم مروجي الرنا الريباسي بواسطة ppGpp و NTP البادئ. زنزانة 118, 311–322 (2004)

Clark، R.B & amp Ogilvie، J.W. Aspartokinase I-homoserine dehydrogenase I of الإشريكية القولونية ك 12. الوزن الجزيئي للوحدة الفرعية وربط فوسفات النيكوتيناميد والأدينين ثنائي النوكليوتيد. الكيمياء الحيوية 11, 1278–1282 (1972)

Starnes، W. L. وآخرون. مركب نازعة هيدروجين الأسبارتوكيناز-الهوموسرين الحساس للثريونين ، وتكوين الأحماض الأمينية ، والوزن الجزيئي ، وتكوين الوحدة الفرعية للمجمع. الكيمياء الحيوية 11, 677–687 (1972)

Burr ، B. ، Walker ، J. ، Truffa-Bachi ، P. & amp Cohen ، G.N. Homoserine kinase from الإشريكية القولونية ك 12. يورو. J. Biochem. 62, 519–526 (1976)

Johansen ، J. ، Eriksen ، M. ، Kallipolitis ، B. & amp Valentin-Hansen ، P. تنظيم سفلي لبروتينات الغشاء الخارجي عن طريق الحمض النووي الريبي غير المشفر: كشف الحالة التنظيمية المعتمدة على CYR-ompX cAMP-CRP- و σE. جيه مول. بيول. 383, 1–9 (2008)

De Lay ، N. & amp Gottesman ، S. يربط RNA CyaR التنظيمي الصغير غير المشفر (Crp) (RyeE) الحالة التغذوية بسلوك المجموعة. J. باكتيريول. 191, 461–476 (2009)

Andersen، J.، Forst، S. A.، Zhao، K.، Inouye، M. & amp Delihas، N. micF RNA. micF RNA هو عامل رئيسي في التنظيم الحراري لبروتين OmpF في الإشريكية القولونية. J. بيول. تشيم. 264, 17961–17970 (1989)

Deighan، P.، Free، A. & amp Dorman، C.J. دور لـ الإشريكية القولونية بروتين شبيه بـ H-NS StpA في تعبير بورين OmpF من خلال تعديل micF استقرار الحمض النووي الريبي. مول. ميكروبيول. 38, 126–139 (2000)

Trotochaud، A. E. & amp Wassarman، K. M. 6S وظيفة RNA تعزز بقاء الخلية على المدى الطويل. J. باكتيريول. 186, 4978–4985 (2004)

وينظم Wassarman ، K. M. & amp Storz ، G. 6S RNA E. القولونية نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي. زنزانة 101, 613–623 (2000)

Kim ، E. Y. ، Shin ، M. S. ، Rhee ، J.H & amp Choy ، H. E. العوامل المؤثرة في الاستخدام التفضيلي لبوليميراز RNA المحتوي على سيجما -38 في التعبير الجيني الثابت في المرحلة الإشريكية القولونية. J. ميكروبيول. 42, 103–110 (2004)

موتو ، إيه وآخرون. هيكل ووظيفة 10Sa RNA: عبر- نظام الترجمة. بيوكيمي 78, 985–991 (1996)

Roche، E.D & amp Sauer، R. T. SsrA-mediated peptide tagging بسبب الكودونات النادرة وندرة الحمض الريبي النووي النقال (tRNA). EMBO J. 18, 4579–4589 (1999)

Kawano ، M. ، Reynolds ، A. A. ، Miranda-Rios ، J. & amp Storz ، G. اكتشاف الحمض النووي الريبي الصغير المشتق من 5′- و 3′- UTR و RNAs المضاد للترميز CIS في الإشريكية القولونية. الدقة الأحماض النووية. 33, 1040–1050 (2005)


الامتحان العام 4

عادة لا يتم نسخ الأوبرا المحرض. يتطلب جزيء محفز لتحفيز النسخ إما عن طريق تعطيل بروتين مثبط في أوبرون محفز سلبي أو عن طريق تحفيز البروتين المنشط في مشغل إيجابي محفز.

(أ) طفرة يسببها صبغة أكريدين في مرنا. الحالة غير متجانسة في الخلية المعنية.

2. منع الترجمة

3. إسكات النسخ

2. في الخلايا حقيقية النواة ، تلعب بنية الكروماتين دورًا في تنظيم الجينات. الكروماتين المكثف يمنع النسخ. لذلك ، لكي يحدث التعبير ، يجب تغيير الكروماتين للسماح بالتغييرات في الهيكل. تعتبر الأستلة لبروتينات الهيستون ومثيلة الحمض النووي مهمة في هذه التغييرات.

3. على مستوى بدء النسخ ، تكون العملية أكثر تعقيدًا في الخلايا حقيقية النواة. في حقيقيات النوى ، يتطلب البدء آلة معقدة تتضمن بوليميريز الحمض النووي الريبي ، وعوامل النسخ العامة ، والمنشطات النسخية. يتم منع أو تحفيز بوليميراز الحمض النووي الريبي البكتيري من خلال إجراءات البروتينات المنظمة.

المروجين وعناصر المروج القريبة والمعززات وكواتم الصوت في حقيقيات النوى.

أ.
الحمض النووي المتكرر باعتدال
ب.
DNA شديد التكرار
ج.
عناصر متناثرة قصيرة
د.
عناصر طويلة تتخللها
ه.
تسلسل فريد من الحمض النووي

2. الإصلاح المباشر. يتم إصلاح تلف الحمض النووي عن طريق التغيير المباشر للنيوكليوتيدات التالفة إلى هيكلها الأصلي.

3. إصلاح ختان القاعدة. يتم استئصال القاعدة التالفة ، ثم يتم استبدال النوكليوتيدات بالكامل.

4. الإصلاح التفاعلي للصور - انعكاس ثنائيات البيريميدين المتكونة من التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية. يتطلب إنزيم التنشيط الضوئي

5. إصلاح ما بعد النسخ المتماثل - يحدث على الحمض النووي التالف الذي نجا من إصلاح عدم التطابق الأولي أثناء تكرار الحمض النووي. في هذه الآلية ، يعيد بروتين RecA تجميع المقابل على الشريط الأبوي غير التالف من نفس القطبية

6. إصلاح كسر الخيط المزدوج - المسؤول عن ربط خيطين مكسور من الحمض النووي - يستخدم إصلاح إعادة التركيب المتماثل والمنطقة المقابلة على الكروماتيد الشقيق كقالب


يخضع حقيقيات النوى pre-mRNA لمعالجة مكثفة قبل أن يصبح جاهزًا للترجمة. تخلق الخطوات الإضافية المتضمنة في نضوج mRNA حقيقية النواة جزيءًا له نصف عمر أطول بكثير من mRNA بدائية النواة. تستمر mRNAs حقيقية النواة لعدة ساعات ، في حين أن النموذج المعتاد بكتريا قولونية لا تدوم mRNA أكثر من خمس ثوان.

يتم طلاء Pre-mRNAs أولاً ببروتينات RNA التي تعمل على تثبيت الحمض النووي الريبي ، وهي تحمي ما قبل mRNA من التدهور أثناء معالجتها وتصديرها من النواة. أهم ثلاث خطوات لمعالجة ما قبل الرنا المرسال هي إضافة عوامل التثبيت والإشارة عند طرفي 5 و 3 للجزيء ، وإزالة التسلسلات المتداخلة التي لا تحدد الأحماض الأمينية المناسبة. في حالات نادرة ، يمكن تحرير نسخة mRNA & # 8220 & # 8221 بعد نسخها.

5 ، السد

بينما لا يزال يتم تصنيع pre-mRNA ، أ 7-ميثيل جوانوزين كاب يضاف إلى نهاية 5 من النسخة المتزايدة من خلال ارتباط الفوسفات. هذه الشق (المجموعة الوظيفية) تحمي الرنا المرسال الناشئ من التدهور. بالإضافة إلى ذلك ، تتعرف العوامل المشاركة في تخليق البروتين على الغطاء للمساعدة في بدء الترجمة بواسطة الريبوسومات.

3 ′ Poly-A Tail

بمجرد اكتمال الاستطالة ، يتم شق ما قبل الرنا المرسال بواسطة نوكلياز داخلي بين تسلسل إجماع AAUAAA وتسلسل غني بـ GU ، تاركًا تسلسل AAUAAA على pre-mRNA. ثم يضيف إنزيم يسمى بوليميراز poly-A سلسلة من حوالي 200 من البقايا A ، تسمى ذيل بولي. يحمي هذا التعديل أيضًا pre-mRNA من التدهور ويشير إلى تصدير العوامل الخلوية التي يحتاجها النص إلى السيتوبلازم.

الربط قبل mRNA

تتكون الجينات حقيقية النواة من exons، والتي تتوافق مع تسلسل ترميز البروتين (السابق-على يدل على أنهم كذلك السابقضغط) و intمتواليات ervening تسمى الإنترونات (intron يدل على intدور ervening) ، والذي قد يكون متورطًا في تنظيم الجينات ولكن يتم إزالته من pre-mRNA أثناء المعالجة. لا تقوم تسلسلات Intron في mRNA بتشفير البروتينات الوظيفية.

جاء اكتشاف الإنترونات بمثابة مفاجأة للباحثين في السبعينيات الذين توقعوا أن تحدد ما قبل الرنا المرسال تسلسلات البروتين دون مزيد من المعالجة ، كما لاحظوا في بدائيات النوى. غالبًا ما تحتوي جينات حقيقيات النوى الأعلى على واحد أو أكثر من الإنترونات. قد تتوافق هذه المناطق مع التسلسلات التنظيمية ، ومع ذلك ، فإن الأهمية البيولوجية لوجود العديد من الإنترونات أو وجود إنترونات طويلة جدًا في الجين غير واضح. من الممكن أن تبطئ الإنترونات التعبير الجيني لأنها تستغرق وقتًا أطول لنسخ ما قبل الرنا المرسال مع الكثير من الإنترونات. بدلاً من ذلك ، قد تكون الإنترونات عبارة عن بقايا متوالية غير وظيفية متبقية من اندماج الجينات القديمة خلال التطور. هذا مدعوم بحقيقة أن exons المنفصلة غالبًا ما تشفر وحدات فرعية أو مجالات بروتينية منفصلة. بالنسبة للجزء الأكبر ، يمكن أن تتغير تسلسلات الإنترونات دون التأثير في النهاية على منتج البروتين.

يجب إزالة جميع إنترونات pre-mRNA & # 8217s تمامًا وبدقة قبل تخليق البروتين. إذا أخطأت العملية حتى بواسطة نيوكليوتيد واحد ، فإن إطار القراءة للإكسونات الملتصقة سيتحول ، وسيكون البروتين الناتج معطلاً. تسمى عملية إزالة الإنترونات وإعادة توصيل الإكسونات الربط (شكل 1). تتم إزالة الإنترونات وتتحلل بينما ما قبل الرنا المرسال لا يزال في النواة. يحدث التضفير بواسطة آلية خاصة بالتسلسل تضمن إزالة الإنترونات وإعادة ربط الإكسونات بدقة ودقة نيوكليوتيد واحد. يتم إجراء تضفير ما قبل mRNAs بواسطة مجمعات من البروتينات وجزيئات RNA تسمى spliceosomes.

سؤال الممارسة

الشكل 1. الربط ما قبل mRNA ينطوي على الإزالة الدقيقة للإنترونات من نسخة RNA الأولية. يتم تحفيز عملية التضفير بواسطة مجمعات بروتينية تسمى spliceosomes تتكون من بروتينات وجزيئات RNA تسمى snRNAs. تتعرف Spliceosomes على التسلسلات في نهاية 5 و 3 من الإنترون.

الأخطاء في التضفير متورطة في السرطانات والأمراض البشرية الأخرى. ما أنواع الطفرات التي قد تؤدي إلى أخطاء التضفير؟

لاحظ أن أكثر من 70 من الإنترونات الفردية يمكن أن تكون موجودة ، ويجب أن يخضع كل منها لعملية التضفير - بالإضافة إلى 5 السد وإضافة ذيل poly-A - فقط لتوليد جزيء mRNA واحد قابل للترجمة.

تحرير الحمض النووي الريبي في المثقبيات

الشكل 2. المثقبية البروسية هو العامل المسبب لمرض النوم عند البشر. يجب تعديل mRNAs لهذا العامل الممرض عن طريق إضافة النيوكليوتيدات قبل أن يحدث تخليق البروتين. (الائتمان: تعديل العمل بواسطة Torsten Ochsenreiter)

المثقبيات هي مجموعة من البروتوزوا التي تشمل العامل الممرض المثقبية البروسية، الذي يسبب مرض النوم عند الإنسان (الشكل 2). تحتوي المثقبيات ، وجميع حقيقيات النوى تقريبًا ، على عضيات تسمى الميتوكوندريا تزود الخلية بالطاقة الكيميائية. الميتوكوندريا هي عضيات تعبر عن الحمض النووي الخاص بها ويعتقد أنها بقايا علاقة تكافلية بين حقيقيات النوى وبدائيات النوى المبتلعة. يُظهر الحمض النووي للميتوكوندريا في المثقبيات استثناءً مثيرًا للاهتمام للعقيدة المركزية: لا تملك ما قبل الرنا المرسال المعلومات الصحيحة لتحديد البروتين الوظيفي. عادة ، هذا لأن mRNA يفتقد العديد من نيوكليوتيدات U. تنفذ الخلية خطوة معالجة إضافية لـ RNA تسمى تحرير RNA لعلاج ذلك.

تقوم الجينات الأخرى في جينوم الميتوكوندريا بترميز 40- إلى 80 نيوكليوتيد دليل RNAs. يتفاعل واحد أو أكثر من هذه الجزيئات عن طريق الاقتران الأساسي التكميلي مع بعض النيوكليوتيدات في نسخة ما قبل الرنا المرسال. ومع ذلك ، فإن دليل الحمض النووي الريبي يحتوي على نيوكليوتيدات أكثر من ما قبل الرنا المرسال يحتوي على نيوكليوتيدات يو لربطها. في هذه المناطق ، ينطلق دليل الحمض النووي الريبي (RNA). نهايات 3 ′ من RNAs الدليل لها ذيل طويل poly-U ، ويتم إدخال قواعد U هذه في مناطق نسخة ما قبل mRNA حيث يتم حلقة دليل RNAs. تتم هذه العملية بالكامل بواسطة جزيئات الحمض النووي الريبي. وهذا يعني أن RNAs التوجيهية - وليس البروتينات - تعمل كمحفزات في تحرير RNA.

تحرير الحمض النووي الريبي ليس مجرد ظاهرة من المثقبيات. في الميتوكوندريا لبعض النباتات ، يتم تحرير جميع ما قبل mRNAs تقريبًا. تم تحديد تعديل الحمض النووي الريبي أيضًا في الثدييات مثل الجرذان والأرانب وحتى البشر. ماذا يمكن أن يكون السبب التطوري لهذه الخطوة الإضافية في معالجة ما قبل الرنا المرسال؟ أحد الاحتمالات هو أن الميتوكوندريا ، كونها بقايا بدائيات النوى القديمة ، لديها طريقة قديمة قائمة على الحمض النووي الريبي لتنظيم التعبير الجيني. لدعم هذه الفرضية ، تختلف التعديلات التي تم إجراؤها على ما قبل الرنا المرسال اعتمادًا على الظروف الخلوية. على الرغم من التخمين ، فإن عملية تحرير الحمض النووي الريبي (RNA) قد تكون معلقة من زمن بدائي عندما كانت جزيئات الحمض النووي الريبي ، بدلاً من البروتينات ، مسؤولة عن تحفيز التفاعلات.


نتائج

بدأنا بتوليد نسخة حساسة للتدهور المعتمد على ميرنا. لقد أنشأنا ميرنا صناعيًا استنادًا إلى العمود الفقري mir6.1 (Chen et al. ، 2007) المصمم لاستهداف تسلسل غير موجود في ذبابة الفاكهة الجينوم ، على النحو الذي حدده E-RNAi (Horn & amp Boutros ، 2010) و GESS (Yilmazel et al. ، 2014) ، وبواسطة nucleotide BLAST بحث عن تسلسل الدليل مقابل ذبابة الفاكهة سوداء البطن الجينوم (إصدار FB2016_04). تم إدخال ميرنا الاصطناعي في إنترون 3 ′ UTR من mKate2 الجين ، الذي يسمح لنا بمراقبة التعبير عن بناء ميرنا.لتفضيل الانقسام الموجه لـ miRNA بدلاً من التدهور الموجه نهائيًا أو تثبيط متعدية ، تم دمج ثلاثة مواقع مستهدفة مكملة تمامًا لـ miRNA (Ameres & amp Zamore ، 2013) في 3 ′ UTR من Firefly luciferase (فلوك) الجين المراسل. كما هو متوقع ، شارك في التعبير عن فلوك المراسل وبناء ميرنا أدى إلى انخفاض كبير في مستوى البروتين FLuc بالمقارنة مع التعبير عن فلوك بناء المراسل وحده (من 100٪ إلى 5.3 ± 0.4٪ ، الشكل 1 أ).

لتحديد ما إذا كان بإمكاننا إنقاذ النصوص التي تستهدف ميرنا من التدهور ، وضعنا مسلك بولي (A) من 139 قاعدة على الفور 5 إلى المواقع المستهدفة ميرنا ، وتسلسل ترميز المصب فلوك. لقد استنتجنا أن الانقسام الحالى للنووية الموجه بواسطة miRNA لنصوص المراسل ، فإن السبيل البولي الداخلي (A) ، الموجود الآن في نهاية 3 التي تم إنشاؤها حديثًا من النص المقطوع ، من شأنه أن يحمي المزيد من التسلسلات 5 من 3 إلى 5 التدهور الخارجي للنواة ويسمح الترجمة (Wilusz، Wormington & amp Peltz، 2001). إضافة السبيل البولي الداخلي (A) إلى فلوك تسبب المراسل في انخفاض متواضع في تعبير FLuc مقارنةً بـ فلوك مراسل بدون الجهاز البولي (A) (من 100٪ إلى 89.9 ± 6.5٪ الشكل 1 أ). ومع ذلك ، عندما ميرنا و فلوك تم التعبير عن بنيات المراسل بشكل مشترك ، وجدنا أن فلوك يدعم المراسل الذي يحتوي على جهاز poly (A) الداخلي (أي ، poly (A) +) مستوى أعلى بكثير من تعبير FLuc مقارنةً بـ فلوك مراسل يفتقر إلى جهاز بولي داخلي (A) (أي ، بولي (A) -): 81.4 ± 4.0٪ و 5.3 ± 0.4٪ على التوالي (الشكل 1 أ).

لاختبار ما إذا كانت نسخ المراسل قد تم شقها بواسطة miRNA الاصطناعي ، أجرينا تحليل RT-PCR من الخلايا التي تعبر عن miRNA و poly (A) + أو poly (A) - مراسل. تم نسخ العكسي الأول (كدنا) من الموضع 3 ′ إلى المواقع المستهدفة ميرنا. منطقة 5 داخل فلوك تم بعد ذلك تضخيم منطقة التشفير باستخدام PCR (الشكل 1 ب). في مثل هذه التجربة ، يجب أن تكون كمية منتج PCR متناسبة مع مستويات غير المقطوعة فلوك نسخة طبق الأصل. كما هو موضح في الشكل 1C ، تسبب إضافة ميرنا في انخفاض بنسبة 65٪ في كمية فلوك منتج RT-PCR بالمقارنة مع عنصر تحكم no-miRNA ، بغض النظر عما إذا كان النص يحتوي أو لا يحتوي على جهاز بولي داخلي (A). لم يؤثر وجود ميرنا أيضًا على المستويات الإجمالية للرنا المرسال متعدد الأدينيلات في ذبابة الفاكهة خلايا S2 كما تم قياسها بواسطة RT-PCR لنسخة غير مستهدفة من β جلوكورونيداز (β جلو) الجين (الشكل 1 ج). تتوافق هذه النتائج معًا مع النموذج الذي تقوم فيه المسالك المتعددة الداخلية (A) بتثبيت النصوص المشقوقة في موقع أكثر 3 درجات. مع وضع هذا النموذج في الاعتبار ، شرعنا في بناء نسخة تم حظر الترجمة فيها ، ولكن يمكن تحريرها عن طريق الانقسام المعتمد على ميرنا.

يمكن للبنية الثانوية في 5 ′ -UTR من mRNA كبح ترجمة mRNA في العديد من السياقات (Kozak ، 2005 Lammich et al. ، 2011). لقد سعينا إلى بناء هيكل ثانوي في 5 UTR يمكن تخفيفه أو منعه من التشكل عن طريق الانقسام في 3 UTR. للقيام بذلك ، لجأنا إلى أنظمة تحدث بشكل طبيعي حيث يتم إنشاء بنية RNA مستقرة عن طريق التفاعل بين جزيئين مختلفين من RNA. CopT و CopA هما جزيئات RNA بكتيرية جيدة التوصيف. كل منها يشكل دبوس شعر ، ويتشاركان في التكامل مع أكثر من 90 نيوكليوتيد. في البكتيريا ، يرتبط CopA في العابرة إلى CopT ، التي تقع في المنطقة الرائدة في ريبا، وتشكيل هيكل يمنع ترجمة ريبا مرنا (Blomberg et al. ، 1994 Blomberg، Nordstrom & amp Wagner، 1992). يبدأ الاقتران بتفاعل عابر من حلقة إلى حلقة (معقد التقبيل) ، ثم ينتقل إلى بنية مستقرة ، وهي مفترق حلزوني رباعي (Kolb et al. ، 2000a Kolb et al. ، 2000b). يمنع هذا الهيكل وصول الريبوسوم إلى مواقع ربط الريبوسوم في ريبا مرنا (بلومبيرج وآخرون ، 1994). افترضنا أنه إذا كان CopT و CopA موجودين في 5 ′ و 3 UTR ، على التوالي ، من نفس النص ، فإن تشكيل بنية ثانوية ناتجة عن ارتباطهما سيمنع ترجمة تسلسل الترميز المتداخل.

لاستكشاف هذه الفكرة ، قدمنا ​​CopT أو CopA بمفردهما أو معًا فلوك النصوص. إدخال CopT واحد في 5 UTR من فلوك تسبب mRNA في تقليل تعبير FLuc (من 100٪ إلى 65.3 ± 6.7٪ الأشكال 2A-2B: 2) ، في حين أن وضع CopA واحد في 3 UTR من النص لم يكن له تأثير كبير على تعبير FLuc (107.7 ± 26.1٪) الأشكال 2 أ -2 ب: 3). هذه النتائج متوقعة ، نظرًا لأن بنية دبوس الشعر القوية الموضوعة في مقدمة كودون البدء ، ولكن ليس في 3 UTR ، غالبًا ما تعيق بدء الترجمة (Kozak ، 2005). الأهم من ذلك ، مع ذلك ، لوحظ انخفاض أقوى بكثير في تعبير FLuc عندما تم إدخال CopT و CopA في 5 ′ و 3 UTRs من نفس فلوك نسخة ، على التوالي (من 100٪ إلى 2.8 ± 0.7٪ الأشكال 2 أ -2 ب: 4). من المحتمل أن يكون هذا الإسكات ناتجًا عن تثبيط الترجمة لأن مستويات النسخ كانت متشابهة عند وجود بنية دبوس شعر واحدة ، أو كلاهما أو عدم وجودهما (الشكل 2 ج).

مع هذه الملاحظات في متناول اليد ، سألنا بعد ذلك عما إذا كان بإمكان الحمض الريبي النووي الريبي إزالة القمع أو منع تثبيط ترجمة الرنا المرسال عن طريق تعطيل أو منع التفاعلات بين CopA و CopT. لقد أنشأنا نسخة تم فيها وضع ثلاثة مواقع مستهدفة تم اختبارها مسبقًا لـ miRNA الاصطناعي (الشكل 1) في اتجاه المنبع من CopA في فلوك نسخة مع بنيتي دبوس الشعر (الشكل 2 أ: 4). بالإضافة إلى ذلك ، تم إدخال مسلك بولي (A) بين نهاية 3 لتسلسل الترميز فلوك والمواقع المستهدفة ميرنا. هذا الترتيب يضمن أن الخفض فلوك يحتوي النص على مجرى بولي (A) مكشوف في نهاية 3. يشار إلى هذا البناء فيما بعد باسم مراسل ميرنا (الشكل 3 أ). لتقييم فعالية مراسل miRNA ، قارنا تعبير FLuc منه بالتعبير من نص تحكم تم فيه استبدال CopA في 3 ′ UTR بتسلسل عشوائي متساوي الطول (مراسل CopA−). يوفر المراسل CopA− قياسات تعبير FLuc في غياب القمع بوساطة CopA-CopT ، وبالتالي يعمل كمرجع لأداء المراسل مع وبدون ميرنا.

وجدنا أن ترجمة فلوك من مراسل ميرنا تم قمعه بشدة مقارنة بالمراسل CopA− (من 100٪ إلى 4.4 ± 0.5٪ ، الشكل 3 ب). تم تقليل هذا القمع بشكل كبير عن طريق التعبير المشترك عن ميرنا (من 4.4 ± 0.5٪ إلى 41.9 ± 4.2٪). كان للتعبير المشترك عن ميرنا مع المراسل CopA− تأثير معاكس: انخفضت ترجمة FLuc بشكل طفيف (من 100٪ إلى 84.0 ± 3.5٪ الشكل 3 ب). الأهم من ذلك ، يُظهر تحليل RT-PCR أنه في حين أن وجود ميرنا يسبب انخفاضًا كبيرًا في مستويات نص مراسل ميرنا غير المشبع بالمقارنة مع عدم وجود تحكم ميرنا (من 100 ٪ إلى 43 ٪ ، الشكل 3 ج) ، ترجمة فلوك من الخلايا التي تعبر عن ميرنا زادت بمقدار 10 مرات عن عنصر التحكم في عدم وجود ميرنا (الشكل 3 ب). تجادل هذه الملاحظات معًا بأن الانقسام الموجه للـ miRNA لنسخة المراسل في مواقع مستهدفة محددة يعكس أو يمنع القمع الترجمي ، مما يؤدي إلى مراسل انقسام ميرنا بقراءة ترجمة إيجابية.


RNA (Ribonucleic Acid): التركيب والأنواع (مع الرسوم البيانية)

التركيب الأساسي للحمض النووي الريبي هو نفس بنية الحمض النووي. وهي أيضًا سلسلة من عديد النوكليوتيدات مع 5 & # 8242-3 & # 8242 روابط فوسفات السكر. لكن السكر ريبوز وهو موجود بشكل عام كجزيء وحيد الخيط. لهذا السبب ، لا تحتوي على نسبة واحد إلى واحد بين القواعد التكميلية. كمية البيورينات لا تساوي كمية البيريميدين.

إحدى القواعد الأربعة الرئيسية في الحمض النووي الريبي هي اليوراسيل (U) بدلاً من الثايمين. تظهر الخصائص الفيزيائية الحيوية للحمض النووي الريبي بنية ثانوية أقل بكثير. ومع ذلك ، عندما يتبع تسلسل من القواعد تسلسل تكميلي في نفس السلسلة ، فقد ينثني عديد النيوكليوتيد على نفسه لتوليد بنية مزدوجة مضادة للتوازي ، تُعرف باسم دبوس الشعر.

لها ساق ، والمنطقة الحلزونية المزدوجة ذات القاعدة المزدوجة ، وحلقة بقواعد غير متزاوجة في أحد طرفيها (الشكل 3.55). في هذه المناطق ، يمكن أيضًا أن يقترن G مع U ، لكنه ليس بنفس قوة زوج G-C.

تحتوي الخلايا على ثلاثة أنواع من RNA-messenger RNA (mRNA) ، و RNA الريبوسومي (rRNA) و RNA الناقل (tRNA). يعمل Messenger RNA كقالب لتخليق البروتين. إنها فئة غير متجانسة للغاية من الجزيئات وغير مستقرة للغاية. يشكل 2 & # 8211 5 في المائة من إجمالي الحمض النووي الريبي للخلية الطبيعية. تم اكتشافه لأول مرة بواسطة Hershey (1956). تم إعطاء اسم ومفهوم RNA الرسول لأول مرة بواسطة F. Jacob و J. Monod (1961).

عندما يتم تبريد الحمض النووي المصهور ببطء باستخدام بعض m-RNA المحدد ، يتم تكوين جزيئات هجينة DNA-RNA ، مما يشير إلى أن m-RNA يتكون من الشريط النموذجي لـ DNA المزدوج.

إنه غير متجانس للغاية في الحجم لأن الجينات أو مجموعات الجينات تختلف في الطول. في بدائيات النوى ، غالبًا ما تبدأ ترجمة جزيء الرنا المرسال قبل الانتهاء من نسخها ، لأن الرنا المرسال يتم نسخها وترجمتها في الاتجاه 5 & # 8242 إلى 3 & # 8242 ولا يتم فصل العمليتين بواسطة غشاء نووي.

(أنا) هيكل mRNAs :

تقوم Messenger RNAs بترميز تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات. عدد وأنواع أنواع الرنا المرسال المتميزة (النسخية = ملف تعريف الرنا المرسال) في خلية معينة في مرحلة معينة من حياة الفرد يمكن مقارنتها بعدد البروتينات المختلفة (البروتينات = ملف تعريف البروتين) الموجودة في الخلية في تلك المرحلة. تشكل الرنا الرسول 1٪ إلى 2٪ من إجمالي الرنا الخلوي.

تشترك جميع mRNAs في خصائص معينة:

(أ) تحتوي على تسلسل مستمر من النيوكليوتيدات يشفر عديد ببتيد معين

(ب) تم العثور عليها في السيتوبلازم و

(ج) إما أن تكون مرتبطة بالريبوسومات أو قادرة على مثل هذا المرفق حتى تتم ترجمتها.

(د) تمشيا مع نطاق الكتل الجزيئية التي لوحظت لعديد ببتيدات ، تختلف mRNAs في الطول من بضع مئات من النيوكليوتيدات إلى عدة آلاف من النيوكليوتيدات

(هـ) تكون mRNAs بشكل عام أكثر قابلية للتغير من rRNAs و tRNAs ، على الرغم من أن معدل دوران بعض mRNAs بطيء جدًا.

تحتوي معظم الرنا المرسال على جزء كبير غير مشفر ، أي جزء لا يوجه تجميع الأحماض الأمينية. على سبيل المثال ، ما يقرب من 25 في المائة من كل غلوبين مرنا يتكون من مناطق غير مشفرة وغير مترجمة (UTRs). تم العثور على الأجزاء غير المشفرة على طرفي 5 & # 8242 و 3 & # 8242 من الرنا المرسال وتحتوي على تسلسلات لها أدوار تنظيمية مهمة.

بالإضافة إلى النيوكليوتيدات غير المشفرة ، تمتلك جزيئات الرنا المرسال حقيقية النواة تعديلات خاصة في النهايات 5 & # 8242 و 3 & # 8242 التي لا توجد في الرسائل بدائية النواة. يحتوي الطرف 5 & # 8242 من mRNAs حقيقية النواة على ميثيل غوانوزين & # 8220cap ، & # 8221 بينما يحتوي الطرف 3 & # 8242 على سلسلة من 50 إلى 250 من بقايا الأدينوزين التي تشكل ذيلًا متعددًا (A).

يشكل التسلسل بين رموز البدء والانتهاء إطار القراءة المفتوح (ORF). يحيط به 5 & # 8242 و 3 & # 8242 مناطق غير مترجمة ومتغيرة بشكل كبير في الطول. وبالتالي ، لا يرتبط طول mRNA دائمًا بطول تسلسل الحمض الأميني الذي يشفره.

لا تزال الوظيفة الدقيقة لـ UTRs 5 & # 8242 و 3 & # 8242 غير مفهومة جيدًا للعديد من mRNAs ، ولكن غالبًا ما تحتوي هذه المناطق على تسلسلات RNA التي يمكن أن تشكل هياكل ثانوية وتتفاعل مع البروتينات ، والتي تنظم النقل والترجمة والاستقرار من mRNA.

لم يتم ترميز ذيل بولي أدينيلات 3 & # 8242 في الحمض النووي ، ولكن تتم إضافته بعد النسخ قبل تصدير mRNA من النواة إلى السيتوبلازم. يتعرف مركب الإنزيم الذي يحتوي على نوكلياز داخلي وبوليميراز بولي (A) على تسلسل إشارة (5 & # 8242 & # 8211 AAUAAA & # 8211 3 & # 8242) بالقرب من نهاية 3 & # 8242 من النص ، يشق ما قبل mRNA المتجه من الإشارة ، ويضيف 20 إلى 250 من بقايا الأدينوزين إلى 3 & # 8217end.

يختلف هيكل الرنا المرسال البلاستيد والميتوكوندريا عن هيكل الرنا المرسال السيتوبلازمي. تمزق mRNAs العضوي كلا من غطاء 5 & # 8242 وذيل بولي (A). نتيجة للاختلافات في معالجة الحمض النووي الريبي بعد النسخ ، تحتفظ mRNAs الميتوكوندريا عادةً بمجموعة ثلاثي الفوسفات 5 & # 8242 ، في حين أن النهايات 5 & # 8242 لمعظم mRNAs البلاستيد تكون أحادية الفسفرة.

على غرار mRNAs بدائية النواة ، يمكن أن تشكل 5 & # 8242- و 3 & # 8242-UTRs لمعظم الرنا المرسال العضوي بنية حلقة جذعية لها وظائف تنظيمية واستقرار. غالبًا ما تتفاعل هياكل RNA هذه مع البروتينات وتعمل كإشارات تؤثر على معالجة mRNA وترجمتها وتدهورها.

تحتوي الخلايا حقيقية النواة على فئات إضافية من الحمض النووي الريبي الصغير والمستقر. RNAs المستقرة الغنية باليوريدين هي مكونات بروتينات ريبونوكليو نووية صغيرة (UsnRNPs) وتشكل فئة رئيسية من الحمض النووي الريبي النووي الصغير (snRNAs) من حقيقيات النوى. يتم ترقيم هذه الحمض النووي الريبي من U1 فصاعدًا. تحدث بعض snRNAs في عدد نسخ مرتفع في النيوكليوبلازم وتعرف باسم snRNAs الرئيسية.

تم العثور على معظم snRNAs الثانوية في النواة ، وبالتالي يتم تحديدها snoRNAs (الحمض النووي الريبي الصغير). تشارك معظم snRNAs في snRNPs في تضفير المناطق غير المشفرة المتداخلة من السلائف mRNAs في النواة.

تشارك snRNAs الأخرى في معالجة المحطة 3 & # 8242 من هيستون pre-mRNA ، والتي تفتقر إلى ذيل بولي (A). تشارك معظم snoRNAs في معالجة سلائف الرنا الريباسي.

في حقيقيات النوى ، النسخ والترجمة ليسا متزامنين ، لأن النسخ عملية نووية والترجمة هي عملية سيتوبلازمية. تسمى mRNAs المنسوخة حديثًا بنسخ الجينات الأولية ، والتي يتم نقلها من النواة إلى السيتوبلازم.

تُشتق mRNAs الوظيفية لحقيقيات النوى من نسخ الجينات الأولية من خلال عدة أنواع من المعالجة على النحو التالي:

(أ) انقسام ما قبل mRNA أو سلائف mRNA كبيرة لجزيئات mRNA الفردية الصغيرة.

(ب) تغطية أو إضافة مجموعات 7-methyl guanosine إلى نهايات 5 & # 8242 للجزيء.

(ج) ذيل بولي (A) أو إضافة 200 تسلسل طويل نيوكليوتيد من نوكليوتيد الأدينيلات إلى نهاية 3 & # 8242 من جزيء الرنا المرسال.

(د) تكوين مجمعات ببروتينات محددة.

يُطلق على التسلسل الأساسي من نهاية 5 & # 8242 إلى رمز البدء ، تسلسل القائد وتسمى التسلسلات المتداخلة غير المشفرة بالإنترونات. تسمى تسلسلات الترميز ، التي تُترجم إلى بروتين ، بالإكسونات. تتضمن معالجة النسخة الأولية إزالة تسلسلات intron.

قد تخضع تعديلات ما بعد النسخ للنسخ الجينية الفردية لبعض أو كل الأنواع الأربعة المذكورة أعلاه من المعالجة.

معظم الحمض النووي الريبي غير الريبوزومي المركب في نوى الخلايا حقيقية النواة كبيرة جدًا ومتغيرة الحجم وتسمى RNA النووي غير المتجانس (hnRNA) أو ما قبل الرنا المرسال.

تؤدي المعالجة السريعة لهذه الجزيئات العملاقة داخل النواة بعد وقت قصير من نسخها إلى تكوين جزيئات mRNA التي يتم نقلها من النواة إلى السيتوبلازم. أثناء المعالجة ، من النصوص الأولية يتم تقسيم الإنترونات.

هناك ثلاثة أنواع متميزة من آليات الربط على النحو التالي:

(أ) ربط سلائف الحمض النووي الريبي بواسطة نوكلياز داخلي وإنزيم يجاز.

(ب) التضمين الذاتي لمقدمة Tetrahymena RNA هي آلية تفاعل فريدة من نوعها ، يتم تحفيزها بواسطة جزيء RNA نفسه (الربط الذاتي). تسمى جزيئات الحمض النووي الريبي المحفزة هذه الريبوزيمات. في مثل هذا النوع من آلية الربط لا يوجد إنزيم بروتيني متضمن.

وقد ثبت أيضًا أن هذا النشاط التحفيزي التلقائي يحدث في سلائف الرنا الريباسي للعديد من حقيقيات النوى المنخفضة وفي عدد كبير من سلائف mRNA و tRNA و mRNA في الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء للعديد من الأنواع المختلفة.

(ج) يتم تقسيم الإنترونات الخاصة بنسخ ما قبل الرنا المرسال في تفاعلات من خطوتين يتم تحفيزها بواسطة مجمعات بروتين نووي بروتينية تسمى spliciosomes.

تختلف الإنترونات الخاصة بـ pre-mRNAs ، وتميل إلى أن تكون غنية بالاتحاد الأفريقي وتحافظ على التسلسلات عند تقاطعات الوصلات. في الثنائيات ، تحتوي هذه الإنترونات على 70٪ من AU ، في حين أن نفس الشيء في monocots هو 60٪. يتم الحفاظ على متواليات النوكليوتيدات المحيطة بكل تقاطع exon-intron.

في جميع إنترونات mRNA النووية تقريبًا للنباتات ، تتكون التسلسلات الحدودية في موقع لصق 5 & # 8242 (موقع المتبرع) وموقع الشريحة 3 & # 8217 (موقع القبول) من 5 & # 8242 GU و AG 3 & # 8242. تُعرف هذه الخاصية باسم قاعدة GU-AG. يوجد عنصر هيكلي إضافي ، موقع الفرع ، عادةً ما يكون من 20 إلى 40 نيوكليوتيد في المنبع من موقع 3 & # 8217splice.

أثناء استئصال intron ، يرتبط 5 & # 8217 end من intron ببقايا الأدينين في موقع الفرع ، مما يشكل الوهقة. يحدث التضفير intron Pre-mRNA داخل مجمع بروتين نووي كبير (spliceosome) ، والذي يحتوي على snRNAs U1 و U2 ومركب U4 / U6 و 115 ، والتي تظل مرتبطة ببروتينات النوى الصغيرة (snRNPs) وعوامل البروتين غير snRNP ( الشكل 3.58).

يتم إعطاء أربعة أنواع رئيسية من الإنترونات في الجدول أدناه:

تختلف آلية التضفير الذاتي اعتمادًا على مجموعة الإنترونات. يبدأ تضفير إنترونات المجموعة l عندما يرتبط جزيء غوانوزين أو مشتق فوسفوري 5 & # 8242 بتسلسل intron. تهاجم مجموعة 3 & # 8217OH من الغوانوزين المربوط مجموعة الفوسفات في موقع الشريحة 5 & # 8217 ، وتشق رابطة الفوسفوديستر في ذلك الموقع وتطلق exon-1.

يتفاعل 3 & # 8242 OH في نهاية exon-1 مع الفوسفات في موقع الشريحة 3 & # 8217 ، ويربط الإكسونات ويطلق intron خطيًا (الشكل 3.59). تشبه آلية التضفير الذاتي لإنترونات المجموعة الثانية تضفير ما قبل الرنا المرسال النووي ، ولكنها لا تنطوي على تكوين جسيم لصق. عادة ما تكون تفاعلات الربط هذه داخل الجزيئات وتنضم إلى exons من نسخة واحدة وتسمى cis-splicing.

في المقابل ، تتم إزالة بعض الإنترونات من المجموعة الثانية من النباتات بواسطة آلية جديدة للربط العابر تتضمن جزيئين أو أكثر من جزيئات الحمض النووي الريبي. توجد في نباتات البلاستيدات الخضراء والميتوكوندريا. فقط أنواع معينة من RNAs الصغيرة والمستقرة التي يتم نسخها بواسطة RNA polymerase III لا تخضع لمعالجة مكثفة.

أنواع الحمض النووي الريبي:

(ط) RNA الريبوسوم :

الجزء الأكبر من RNA الخلوي هو RNA الريبوزومي. إنه المكون الرئيسي للريبوسومات ، لكن دوره المحدد في تخليق البروتين غير واضح. تحتوي كل من النباتات والطحالب والمحتويات الضوئية على ثلاث فئات من الريبوسومات: السيتوبلازم ، والبلاستيد ، والميتوكوندريا. تم العثور على ثلاثة أنواع من الرنا الريباسي في E. coli ribosomes. يطلق عليهم 5S و 16S و 23S بسبب سلوكهم في الترسيب.

يحتوي كل ريبوسوم على جزيء واحد من كل نوع من أنواع الرنا الريباسي. ومع ذلك ، تحتوي الريبوسومات حقيقية النواة على جزيء واحد من كل من أنواع الرنا الريباسي 5S و 7S و 18S و 28S rRNA. RNA الريبوسوم هو الأكثر وفرة من بين 3 أنواع من الحمض النووي الريبي في الخلية.

RNA الريبوسوم هو واحد تقطعت به السبل ، لكنه يظهر أيضًا درجة عالية من التعديلات الثانوية بسبب تكوين خيوط مزدوجة بين المناطق التكميلية وحلقات دبوس الشعر. تحتوي كل حلقة على سيقان مزدوجة. توفر الحلقات والسيقان مواقع ربط متجهية محددة لبروتينات ريبوزومية مختلفة وأنزيمات أخرى لتخليق البروتين.

يحتوي الطرف 3 & # 8242 لـ 16S rRNA المعزول من E. coli على تسلسل Shine و Dalgarno الذي يعمل كموقع ربط mRNA في الريبوسوم 30S. يساعد هذا التسلسل في التعرف على نهاية بداية الرنا المرسال. يحتوي الرنا الريباسي 5S على تسلسل مكمل لتسلسل TΨC لجميع الرنا الريباسي. لذا ، فإن 5S RNA ضروري لربط الحمض النووي الريبي (tRNA) بالريبوسومات.

تتضمن معالجة ما قبل الرنا الريباسي الانقسام النووي والميثيلين. تخضع بعض نسخ الرنا الريباسي حقيقية النواة لعملية التضفير بواسطة الإنترون نفسه (التضفير الذاتي ، الريبوزيم).

يتم نسخ وحدات النسخ في مجموعة جينات الرنا الريباسي النووية التي تشفر جزيئات الرنا الريباسي 17S و 5.8S و 25S بواسطة RNA polymerase I إلى جزيء أولي طويل واحد ، والذي يخضع بعد ذلك لسلسلة من الانقسامات وخطوات المثيلة لإنتاج 17S ، 5.8S ، وجزيئات الرنا الريباسي 25S.

إن نسخ الرنا الريباسي 5S من الجينات النووية المقابلة مستقل ويتم تحفيزه بواسطة RNA polymerase III. لا يتطلب أي معالجة.

يتم إنتاج الرنا الريباسي 17S و 5.8S و 25S من جزيء سلائف 45S rRNA شائع عن طريق معالجة التفاعلات المحفزة بواسطة عدة RNases. أثناء المعالجة ، تصبح الرنا الريباسي 25S و 5.8S مرتبطة بالهيدروجين وتبقى مقترنة بعد اكتمال المعالجة (الشكل 3.60).

يتم ترميز أربعة جزيئات من الرنا الريباسي البلاستيد كوحدة نسخ متعددة الكواكب تتضمن أيضًا جيني الرنا الريباسي الذي يشفر الحمض الريبي النووي النقال ala و tRNA lle في منطقة المباعد التي تفصل بين الرنا الريباسي 16S و 23S ، كل منها يحتوي على إنترون طويل. من خلال مسار معالجة معقد ، يتم شق السلائف RNA في 16S ، 23S ، 4.5S ، و 5S rRNAs وسلائف الحمض النووي الريبي.

يتم بعد ذلك معالجة سلائف الحمض النووي الريبي المشقوق إلى جزيئات الحمض الريبي النووي النقال الوظيفية وجزيئات الرنا الحمض النووي الريبي. يتم نسخ الحمض النووي الريبي بواسطة RNA polymerase III من مجموعات الجينات النووية ، ولكن على عكس 5S rRNA فإنها تحتاج إلى معالجة (الشكل 3.61).

(ثانيا) نقل الحمض النووي الريبي :

تم تحديد نقل الحمض النووي الريبي لأول مرة على أنه جزء من ترسيب الحمض النووي الريبي في 4S. يبلغ طول الحمض الريبي النووي النقال 75-85 نيوكليوتيدات. تُعرف أيضًا باسم RNA القابل للذوبان أو RNA السيتوبلازمي. نقل الحمض النووي الريبي هو جزيء محول يؤدي وظائف مزدوجة. يتعرف على كل من الكودون والحمض الأميني.

يعطي تسلسل النيوكليوتيدات في الحمض النووي الريبي شكل ورقة البرسيم. في هذا الهيكل ، تنبع القواعد المزدوجة التكميلية من الحلقات المفردة المجدولة. تُعرف الهياكل الجذعية والحلقة بأذرع الحمض الريبي النووي النقال.

تم تحديد التسلسل الأساسي لجزيء الحمض النووي الريبي (tRNA) لأول مرة بواسطة روبرت هولي في عام 1965. وباستثناء العناصر المعتادة A و G و C و U ، فهي تحتوي على مجموعة متنوعة من النيوكليوسيدات غير العادية ، مثل pseudouridine (Ψ) و dihydrouridine (H2U) وريبوثيميدين (rT) وإينوزين (I) ومشتقات أحادية وثنائي ميثيل من الأدينوزين والجوانوزين ومشتقاتهما الثيولات.

تحدث هذه التعديلات على إحدى القواعد الأربع فقط بعد أن يتم دمجها في سلسلة البولي ريبونوكليوتيد. هناك أربع حلقات وأربع أذرع رئيسية في جزيء الحمض الريبي النووي النقال. يتم تسمية الأذرع بهياكلها ووظائفها.

يتكون الذراع المستقبلة من جذع زوجي أساسي ينتهي دائمًا بسلسلة غير مقترنة- C-C- تسلسل تكون مجموعته الحرة 3 & # 8242 OH عبارة عن aminoacylated وتنتهي النهاية 5 & # 8242 بشكل عام إما في G أو C.

تتكون الأذرع الأخرى من سيقان مقترنة وحلقات غير مقترنة. تم تسمية الذراع D نسبة لوجود قاعدة dihydrouracil. يحتوي ذراع Anticodon دائمًا على ثلاثي anticodon في وسط الحلقة. تم تسمية ذراع TΨC لوجود هذا التسلسل الثلاثي.

السمة المتغيرة لـ tRNA هي ما يسمى الذراع الإضافية ، الواقعة بين TΨC والأذرع المضادة للكودون وعلى أساس طبيعتها يتم تصنيف tRNA إلى نوعين & # 8211 class-I tRNAs (لها ذراع إضافي صغير) والفئة -II tRNAs (لها ذراع إضافي كبير). في اتجاه عقارب الساعة حول ورقة البرسيم ، يوجد دائمًا 7 أزواج قاعدية في الجذع المستقبِل ، و 5 في ذراع TΨC ، و 5 في ذراع anticodn وعادةً ثلاثة في الذراع D.

يتم الحفاظ على موقع إنترونات الحمض النووي الريبي النووي ، لكن تسلسلها ليس كذلك. يشق نوكلياز ما قبل الحمض الريبي النووي النقال في طرفي الإنترون مما يؤدي إلى تكوين مجموعة دورية 2 & # 8242، 3 & # 8242-فوسفات في 3 & # 8242 نهاية المقطع 5 & # 8242 tRNA ، و 5 & # 8242 مجاني - مجموعة الهيدروكسيل من الجزء 3 & # 8242 tRNA.

يتم تقسيم مجموعة الفوسفات الحلقية لتشكيل مجموعة 2 & # 8242-فوسفات. يتم بعد ذلك فسفرة مجموعة الهيدروكسيل المجانية 5 & # 8242 وينضم كلا النصفين بواسطة ليجاز RNA. يزيل A 2 & # 8242-phosphatase مجموعة 2 & # 8242-فوسفات لإنتاج الحمض الريبي النووي النقال الناضج.


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


مناقشة

قدمت هذه الدراسة نهجًا قائمًا على qRT-PCR يمكن استخدامه لرصد تحلل الرنا المرسال المؤتلف في أنظمة التعبير الناجم عن جزيئات الوزن الجزيئي المنخفض التي يتم نقلها داخل وخارج الخلايا عن طريق الانتشار. تؤثر هذه التقنية البسيطة إلى حد ما بشكل طفيف على الخلايا المعالجة ، على عكس معظم الطرق الأخرى للوصول إلى استقرار الرنا المرسال ، والتي تتضمن تثبيطًا عالميًا لبوليميراز الحمض النووي الريبي البكتيري بواسطة المضاد الحيوي ريفامبيسين [50]. قد يؤدي النهج الأخير إلى آثار جانبية سلبية غير معروفة ، بالإضافة إلى أنه تم وصف محفزات غير حساسة للريفامبيسين [48].

تحليل جيش تحرير بلوخ أظهرت 5 & # x02032-UTRs المرتبطة مباشرة أن تحفيز مستوى النص بواسطة متغيرات LV-2 و LII-11 يعتمد على معدل النسخ المحسن وليس mRNA الأكثر استقرارًا (الشكل 1). كما تم توثيقه بواسطة متغير LII-11 ، فإن الترجمة الأكثر كفاءة لا تؤدي دائمًا إلى حماية أفضل ضد تدهور النص ، كما تم الإبلاغ عن الجينات الأخرى [37] ، [51]. ومع ذلك ، وفقًا لتلك التقارير ، أظهرنا هنا أن تسلسل إشارة الانتقال المدمج في الإطار إلى نهاية الجين البشري 5 & # x02032 يمكن أن يحفز استقرار mRNA (الشكل 4). من المفترض أن تكون هذه الاختلافات غير المتوقعة نتيجة لتعقيد العلاقات بين النسخ ، واضمحلال الرنا المرسال ، والترجمة. قد يكون لإضافة تسلسل إشارة 5 & # x02032 تأثير على طي mRNA ومن ثم قد يؤثر أو لا يؤثر على تحلل الرنا المرسال بوساطة RNase E. بدلاً من ذلك ، قد تشير الزيادة الملحوظة في كمية النسخ ونصف عمر mRNA المطول في حالة الاندماج 5 & # x02032 إلى حماية محتملة للنصوص عن طريق ترجمة الريبوسومات بسبب بدء ترجمة أكثر كفاءة. يمكن استخدام المزيد من الدراسات ، على سبيل المثال من خلال استخدام تقنية جديدة للتحليل الكمي لكثافة الريبوسوم على mRNAs المترجمة [52] ، لاكتساب رؤية أكثر تفصيلاً ، ولكننا نعتقد عمومًا أنه من الصعب للغاية كشف الآليات الأساسية من خلال التقنيات المتاحة حاليًا.

على غرار بلوخ المتغيرات المرتبطة 5 & # x02032-UTR ، وإدخال الطفرات المترادفة في بلوخ أدى تسلسل الترميز 5 & # x02032 إلى زيادة مستوى النص المتراكم دون التأثير الواضح على استقرار mRNA (الشكل 3). قد تكون أسباب ذلك مماثلة لتلك الكامنة وراء تأثير طفرات LV-2 UTR [14] ، ولكن من المثير للاهتمام أن تسلسل تشفير الجين يمكن أن يكون له مثل هذا التأثير على النسخ نفسه. على الرغم من أن منطقة الترميز 5 & # x02032 قد تم ربطها عدة مرات بالتحكم في الترجمة من خلال هياكل mRNA الثانوية واستخدام الكودون [53] ، [54] لا يُعرف الكثير عن كيفية تأثيرها على النسخ. لقد ثبت أن منطقة DNA 5 & # x02032-UTR المجاورة يمكن أن تؤثر على عملية النسخ من خلال تسلسلات تشبه & # x0221210 عنصر المروج (TATAAT) القادرة على تحفيز & # x003c3 70-توقف النسخ المعتمد [55] ، [56 ]. في حالة أوبرون التربتوفاناز (tna) ، تم وصف مواقع الإيقاف المؤقت للنسخ في منطقة المباعد الطويلة المكونة من 220 نيوكليوتيدات والتي تفصل مناطق الترميز لببتيد زعيم TnaC و TnaA tryptophanase ، وتورطت في اقتران الترجمة بالنسخ [57]. ولذلك فإن أحد الاحتمالات هو أن الطفرات المترادفة داخل جيش تحرير بلوخ تؤثر منطقة الترميز على مواقع الإيقاف المؤقت في النوع البري بلوخ تسلسل الحمض النووي بطريقة تحفز النسخ.

لإثبات الأهمية العامة للمنهجية الجديدة لتقييم استقرار mRNA ، قمنا بتوسيع استخدامها أيضًا ليشمل المروج المحفز IPTG. اضمحلال mRNAs (ompA-gm-csf و جم- CSF، الشكل 5) المتولدة من صتاك أكد المروج أن المنهجية كانت مفيدة بنفس القدر لهذا النظام الذي يحفز IPTG كما هو الحال بالنسبة لـ مXylS- طويل التحريض /مساء النظام. قد يكون أحد القيود المحتملة لهذه الطريقة هو أنها تتطلب استخدام مروج محفز بمستوى منخفض للتعبير عن الخلفية. من المحتمل أن يؤدي أي إنتاج للخلفية من mRNA قيد الدراسة إلى مزيج من الاضمحلال الفعلي ومستوى معين من تخليق النص الجديد ، مما يتسبب في حدوث خطأ في حساب معدل الانحلال النسبي.

تم اختبار طريقة غسل المحرض باستخدام البلازميدات التي تحتوي على عدد نسخ منخفض (على سبيل المثال pIB11) وعدد نسخ مرتفع بشكل معتدل (على سبيل المثال ، pGM29). بالنظر إلى أن qRT-PCR يُنظر إليه عمومًا على أنه تقنية محددة وحساسة للغاية ، فإننا نعتقد أن الطريقة يمكنها دون صعوبة معالجة مستويات التعبير المختلفة. علاوة على ذلك ، عند استخدامها جنبًا إلى جنب مع تحديد مستويات النسخ وكمية البروتين ذات الصلة ، يجب أن تكون طريقة غسل المحفز مفيدة لتوضيح العوامل المختلفة التي قد تؤثر على مستوى التعبير العام للجين المؤتلف. يمكن استخدام المفهوم الموصوف هنا على الأرجح لقياس تحلل الرنا المرسال لأي جين في أي نوع من الخلايا (حتى بعض حقيقيات النوى) المستخدمة بكثرة في أبحاث البيولوجيا الجزيئية. والسبب هو أن الأنظمة التي تعتمد على المحرضات القابلة للانتشار متاحة عالميًا تقريبًا. أيا كان الجين المعني ، يمكن ببساطة تضخيم PCR باستخدام UTR الخاص به ثم إدخاله في اتجاه مجرى مروج محفز. سيعطي هذا على الأرجح نفس النسخة من البيئة الطبيعية التي يتم فيها توطين الجين.


شاهد الفيديو: عملية splicing وجزيء mRNA الناضج. بعد نسخ الحمض النووي في حقيقيات النواه. الجزء الثالث (أغسطس 2022).