معلومة

لا يستخدم استخراج الحمض النووي من النباتات والطحالب الفينول. لماذا ا؟

لا يستخدم استخراج الحمض النووي من النباتات والطحالب الفينول. لماذا ا؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لا أعرف ما إذا كان هذا هو المكان الصحيح لطرح هذا السؤال ، لكني لاحظت أن بروتوكولات استخراج كائنات التمثيل الضوئي DNA لا تستخدم الفينول. فقط CTAB / كلوروفورم.

لماذا ا؟

لأن الاستخلاص البكتيري أو الحيواني هو الفينول: الكلوروفورم.

شكرا لك


CTAB هو لإزالة البوليفينول والسكريات الموجودة في الأنسجة النباتية. لا تحتوي الخلايا الحيوانية / البكتيريا على هذه. يمكنك عمل استخلاص إضافي للفينول والكلوروفورم إذا أردت.

انظر هذا البروتوكول من قبل مونسانتو.

  1. قم بوزن 6 جرام من الأنسجة المعالجة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مناسب للطرد المركزي. ملاحظة: بالنسبة للأنسجة غير المعالجة ، يحدث الوزن قبل المعالجة طالما يتم نقل العينة المعالجة بالكامل إلى الأنبوب المخروطي.

  2. لكل عينة 6 جم ، أضف 25 مل من محلول يتكون من 24.25 مل ، محلول استخلاص CTAB مسبق التسخين (55 درجة مئوية) ، 0.5 مل 2-مركابتوإيثانول (2-ME) ، و 0.25 مل من 10 ملجم / مل بروتيناز K لتركيز نهائي بنسبة 2٪ (2-ME) و 100 ميكروغرام / مل (بروتيناز K).

  3. احتضان الأنبوب لمدة 60 دقيقة عند 55 درجة مئوية. برد الأنبوب لفترة وجيزة على مقاعد البدلاء (10 دقائق)

  4. أضف 20 مل من الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي (PCI ، 25: 24: 1). قم بتغطية الأنبوب واخلطه بقوة بواسطة الدوامة أو الانقلاب.

  5. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 13000 × جم و 20-25 درجة مئوية لفصل المرحلتين المائية والعضوية. انقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل.

  6. كرر الاستخراج مرتين لما مجموعه ثلاث عمليات قلع (الخطوات 4-5).

  7. انقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد وأضف ما يقرب من 2/3 حجم من الأيزوبروبانول -20 درجة مئوية وعكس الأنبوب برفق عدة مرات للخلط.

  8. لترسيب الحمض النووي ضع الأنابيب في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل وحتى ثلاثة أيام.

  9. لتكوير أجهزة الطرد المركزي للحمض النووي الأنابيب في حوالي 13000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.

  10. أعد إذابة الحبيبات في 4 مل من TE pH 8.0. نقل إلى أنبوب Sarstedt 13 مل وإضافة ما يقرب من 40 ميكرولتر من 10 ملغ / مل RNase ، ثم احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

  11. لاستخراج الحمض النووي ، أضف 4 مل من الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (CIA ، 24: 1). جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند حوالي 13000 × جم في درجة حرارة الغرفة. نقل المرحلة المائية العلوية لأنبوب Sarstedt نظيف.

  12. كرر الخطوة 11 ثم أضف نصف حجم أسيتات الأمونيوم 7.5 م ، واخلط بلطف عن طريق الانقلاب / ماصة وأضف 2 مجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪. مزيج عن طريق الانقلاب / ماصة ووضعها في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بين عشية وضحاها.

  13. أجهزة الطرد المركزي عند 13000 × ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية لتكوير الحمض النووي.


لقد استخدمت الفينول: الكلوروفورم عدة مرات لاستخراج الحمض النووي للطحالب والحمض النووي الريبي. احتاجت هذه البروتوكولات إلى تعديلات طفيفة فقط لتكييفها مع نوع معين (يمكن أن تكون بعض جدران الخلايا شديدة للغاية). يعمل المبدأ العام وراء الفينول كلوروفورم على أي عينة تقريبًا بمجرد أن تتحلل / تسحق الخلايا. تحدث المشكلات الرئيسية الوحيدة عندما تكون الأنسجة شديدة الدهون أو مليئة بالكربوهيدرات.

لقد استخدمت أيضًا CTAB ولكن يبدو أنه أقل قابلية للتطبيق عالميًا على عينات الطحالب.


مشاكل عزل الحمض النووي الجيني للنبات - (17 فبراير 2005)

لقد استخدمنا مجموعتين مختلفتين تعملان بشكل جيد مع الأنواع النباتية الأخرى ولكنها تفشل مع هذه المجموعة. مع مجموعة Nucleon ، نرى حبيبة كبيرة (DNA + ملوثات؟) وعندما نشغل ذلك على الرحلان الكهربي ، يمكننا & # 39t رؤية أي شيء & # 33 & # 33

يمكن لأي شخص أن يحتقر أي شيء؟

أهلا
لم أعمل مطلقًا مع الحمض النووي للنبات ، ولكن هل يمكنك استخدام طريقة استخراج الحمض النووي للفينول / الكلوروفورم التقليدية؟ لقد كان لدينا حالات قليلة من الأنواع البكتيرية ، حيث لم تنجح المجموعات ، وقد نجحت هذه الطريقة.
ونصيحة - تصنع إيبندورف أنابيب بها & quot؛ جل قفل الطور & quot؛ وهي مفيدة حقًا لعمليات الاستخراج - تحقق مما إذا كانت قد أعطت واحدة متوافقة مع استخراج الحمض النووي للنبات.

اعتدت استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من Pittosporaceae ، وهي غنية جدًا بالفينول ، باستخدام استخراج PCI القياسي (Phenol: choloroform: Isoamyl alcohol) ، والذي كان يعمل بشكل جيد للغاية. ومع ذلك ، بالنسبة لهذا الاستخراج ، كنا نستخدم عادةً معظم الأوراق (ربما 500 مجم) يمكنني & # 39t أن أتذكرها بالضبط.

كانت المشكلة الرئيسية هي أن السكريات غالبًا ما تتراكم مع الحمض النووي وتؤدي إلى تكوين حبيبات ضخمة يصعب تذويبها وغالبًا ما يتغير لونها. الاستخراج المتكرر عادة ما يحل هذا.

مرحبًا & # 33 شكرًا على ردودك

لقد حاولنا الآن استخدام بروتوكول CTAB والفينول المزدوج: استخلاص الكلوروفورم ، حصلنا على بيليه أنظف أجمل ولكننا ما زلنا نواجه مشاكل في التحقق من ذلك على الرحلان الكهربائي.
نحاول الآن تعجيل هذا الحمض النووي مرة أخرى باستخدام NaAc والإيثانول. هل تعلم ما إذا كانت الترسبات المتكررة ستنظف الحمض النووي وتتخلص من السكريات؟

لقد واجهت العديد من المشاكل في عزل الحمض النووي الجيني للنبات بسبب الملوثات مثل تلك التي ذكرتها. الآن ، أنا بصدد محاولة تنقية الحمض النووي الخاص بي. أستخدم عمود sephadex G50 (نفس النوع الذي نصنعه لفصل المجسات عن الملصق المجاني). إذا كان محلول الحمض النووي لزجًا جدًا ، فقد يستغرق الأمر بضع لفات لإخراج الحمض النووي. إذا كان الأمر كذلك ، فمن المحتمل أنك حملت الكثير من الملح وبعض الفينولات في الدورة الثانية. اصنع عمودًا جديدًا ، وكرر الأمر إذا كان هذا هو الحال. إذا تم تخزين سيفاديكس الخاص بك في TE ، فقم بمعايرة العمود باستخدام TE منخفض. كان اليوم في الواقع أول يوم حاولت فيه ذلك. اختفى اللون الأسمر من العينة ، و A260 / A280 جيد. لقد خسرت حوالي 25٪ من حمضي النووي. غدًا ، سأقوم بعمل ملخص التقييد للتحقق من التقييد والازدهار. ان سوف انشر النتائج.
أوه ، ولا تحجب العمود بحمض نووي للحيوانات المنوية أو ما شابه.

لا تساعد الرواسب المتكررة في العادة. إذا قمت بعمل رشاش الماء في درجة حرارة الغرفة ، وتركت الجلوس لبضع دقائق فقط ، فلن تتاح لمعظم السكريات فرصة للخروج من المحلول.

لسوء الحظ ، لم تكن تنقية العمود ناجحة. يبدو أن هضمي HindIII أفضل قليلاً ، لكن لا يزال يبدو أقل من EcoR1 و BamH1.

لا فكرة لدي. هل يمكن لأي شخص آخر المساعدة؟

آسف لإغراق الردود ، ولكن عند الفحص الدقيق للمواد الهلامية ، أعتقد أن تنقية العمود ساعدت أكثر مما كنت أعتقد في الأصل. أعتقد أن هذه الطريقة واعدة ، لكنني لست متأكدًا بعد من كيفية تحسين العملية. ربما شخص ما لديه بعض الاقتراحات.

مرحبًا نورثرن الأبيض العظيم
هذا ليس ردًا جيدًا حقًا لأنني لا أعرف كيفية تحسين التنقية ، لقد لاحظت فقط مع الاستعدادات الخاصة بي (الحمض النووي الجيني البكتيري ، نعم حتى بالنسبة لنا الحياة ليست ذهبية دائمًا) أن بعض الإنزيمات المقيدة & quottough & quot سوف يهضم الحمض النووي جيدًا والذي لا يلمس معظمه ، بالنسبة لي فإن EcoRV و DraI و RsaI أكلته ، لذلك ربما يمكنك التغلب على مشكلة الجودة الخاصة بك.

شكرًا يا ليف ، لكن لدي أيضًا مشكلات مثيلة للتعامل معها. هذا بالفعل يحد من الإنزيمات التي يمكنني استخدامها. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما أحتاج إلى 6 قواطع أساسية. ومع ذلك ، إذا كان لديك إنزيمات قابلة للتحقيق وغير حساسة للميثيل تستخدمها ، فأنا أحب أن أسمع عنها.


خلفية

يجب إجراء جميع طرق استخراج الأحماض النووية تقريبًا في المختبر ، على سبيل المثال ، [1-8]. تستخدم العديد من الدراسات المنهجية والجزيئية والمتعلقة بالنباتات والفطريات الدنا و / أو الحمض النووي الريبي كمصدر أساسي للبيانات [9-14]. في معظم الحالات ، تُستخدم الأنسجة الطازجة لاستخراج الأحماض النووية ، لأن التحلل والعمليات الكيميائية الحيوية الأخرى تبدأ فورًا بعد إزالة الأنسجة من الكائن الحي أو من ركائزه الطبيعية. هذا يحد من الدراسات للنباتات والفطريات القريبة من مختبر الأبحاث ، بما في ذلك تلك التي يمكن زراعتها في البيوت الزجاجية و / أو غرف النمو. ومع ذلك ، يتم إجراء عدد كبير من الدراسات البحثية على الكائنات الحية التي يجب جمعها في الميدان.

تم تطوير ثلاث طرق للحفاظ على الحمض النووي في عينات النباتات التي تم جمعها ميدانيًا [15-18]. يستخدم المرء هلام السيليكا كمجفف لتجفيف الأنسجة بسرعة ، مما يقلل من التحلل في معظم العينات [15 ، 18]. ومع ذلك ، فإنه لا يزيل التدهور ، وعوائد الحمض النووي منخفضة لبعض الأنسجة [19]. الطريقة الثانية تستخدم محلول NaCl-CTAB مشبع (أي محلول ملحي-سيتيل ترايميثيل أمونيوم بروميد) [18]. يعمل الملح المرتفع على تجفيف الأنسجة جزئيًا ويمكن أن يتشابك CTAB مع الأحماض النووية والبروتينات والكربوهيدرات لإبطاء عمليات التحلل. ومع ذلك ، فقد لوحظت درجات عالية من التحلل في بعض الحالات باستخدام هذه الطريقة ، وأحيانًا انخفاض إنتاجية نتيجة الحمض النووي [19]. إضافة الأسكوربات يخفف بعض التدهور. الطريقة الثالثة تستخدم ورق ماص لحفظ الحمض النووي [16]. يتم تحطيم قطع من الأنسجة النباتية أو الفطرية على الورق ، ثم تُترك لتجف. لاحقًا ، يمكن استخدام أقراص الورق (وإعادة استخدامها) لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل. في حين أن هذا من المحتمل أن يكون مناسبًا للعديد من الأغراض ، فقد تم الإبلاغ عن تدهور [16]. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى وسائل أخرى للحفظ و / أو الاستخراج. استخراج الحمض النووي في موقع أخذ العينات (أي فى الموقع) هو بديل محتمل يمكنه تقليل التدهور وزيادة العائد.

يمكن مراقبة التحلل بواسطة الرحلان الكهربي للهلام لأنه مع تكسير الحمض النووي ، تصبح نطاقات الوزن الجزيئي الأعلى أكثر انتشارًا ويُنظر إلى الأجزاء الأصغر من الحمض النووي على أنها مسحات ساطعة بشكل متزايد من التألق تمتد إلى مناطق الوزن الجزيئي المنخفض للهلام انظر على سبيل المثال [8]. ومع ذلك ، فإن هذا يشير فقط إلى حدوث انشقاق في خيوط الحمض النووي. في نفس الوقت ، تحدث أيضًا عمليات تدهور أخرى ، مما يؤدي إلى فقدان معلومات التسلسل [20 ، 21]. التغييرات الأكثر شيوعًا هي فقدان القواعد عن طريق هجوم التحلل المائي للروابط الجليكوسيدية. يحدث نزع البثور في أغلب الأحيان ، ولكن يحدث نزع البثور أيضًا بمعدل أقل. عندما يتم استخدام هذه الحمض النووي كقوالب لـ PCR ، حوالي 75 ٪ من الوقت ، سيتم دمج قاعدة غير دقيقة في تلك المواقع ، مما يتسبب في خسارة محتملة في دقة التسلسل. ينتج نزع الأمين من m 5 C (5-methylcytosine ، السائد في موضع الجين rRNA) ثيميدين ، والذي سوف يقترن مع الأدينوزين بدلاً من الغوانوزين أثناء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفاعلات التسلسل. يؤدي نزع الأمين من الأدينوزين إلى تكوين هيبوكسانثين الذي يتزاوج مع السيتوزين بدلاً من الثيميدين ، مما قد يتسبب مرة أخرى في فقدان دقة التسلسل. في دراساتنا السابقة ، أوضحنا أن الحمض النووي التالف يمكن تضخيمه وتسلسله بنجاح ، ولكن غالبًا ما تكون الأخطاء في التسلسل واضحة [22-24].

يمكن ملاحظة تدهور كبير في الحمض النووي بعد فترة وجيزة من إزالة الأوراق أو الأنسجة الفطرية من جسم الكائن الأساسي أو الركيزة [8] ، ويكون تدهور الحمض النووي الريبي واضحًا في غضون ثوانٍ بعد أخذ العينات. تتمتع بعض الرناوات بنصف عمر يتراوح من دقائق إلى ساعات ، في حين أن تدهور الحمض النووي هو عملية أبطأ. تم اكتشاف الحمض النووي في العديد من أنواع النباتات والفطريات في الأنسجة الجافة من شهور إلى قرون بعد موت الكائن الحي [20 ، 25]. على الرغم من إمكانية اكتشاف الحمض النووي في الأنسجة التي تم تجفيفها لفترات طويلة من الزمن (تصل إلى مئات السنين للفطريات وحتى عشرات الآلاف من السنين للنباتات) ، يمكن ملاحظة التحلل بعد وقت قصير نسبيًا من بدء موت الخلايا [3 ، 8 ، 10-12 ، 26]. في كثير من الأحيان ، يمكن تحقيق تضخيم وتسلسل تفاعل البوليميراز المتسلسل من الحمض النووي المستخرج من الأنسجة التي ماتت منذ قرون إلى آلاف السنين. أثناء وجود الحمض النووي ، يمكن اكتشافه واستخلاصه وتضخيمه وتسلسله لفترة طويلة بعد إزالة النسيج النباتي أو الفطر من النبات أو الباسيدوكارب ، فإنه يتم تجزئته جزئيًا وتغييره بطريقة أخرى عن طريق الإنزيمات المتدهورة ، والتحلل المائي ، والأكسدة والعمليات الأخرى ، مما يؤدي غالبًا لتغيير نتائج التسلسل [20 ، 21]. تزداد هذه العمليات في المناخات الحارة الرطبة وتختلف باختلاف الأنواع. لذلك ، فإن أخذ العينات في مثل هذه الظروف في المواقع الميدانية البعيدة قد يحد من فائدة الأحماض النووية المستخرجة للدراسات الجزيئية ، ما لم يتم الاستخراج بعد وقت قصير من أخذ العينات. تعتبر السرعة ذات أهمية قصوى لضمان استخراج الحمض النووي عالي الجودة الضروري لضمان نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. عندما يتعذر أخذ العينات بشكل فعال وحفظها ونقلها بسرعة إلى المختبر ، فيمكن بدلاً من ذلك نقل المعدات والحلول المخبرية إلى العينات المستهدفة في بيئاتها الطبيعية من أجل استخراج الحمض النووي فى الموقع.

يتم تقديم تحليل يقارن جودة وإنتاجية الحمض النووي المستخرج من الأنسجة الطازجة بجودة وإنتاجية الحمض النووي المستخرج من الأنسجة المعرضة للهواء عند درجة حرارة 21 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أو 72 ساعة (لمحاكاة النقل من الحقل إلى المختبر) . بدأ هذا المشروع لتطوير طريقة يمكن أن تضمن دقة التسلسل ويمكن استخدامها عندما تنتج طرق أخرى نتائج سيئة. أولاً ، اختبرنا المعدات الميدانية في المختبر ، ثم اختبرنا الطريقة مع المعدات الميدانية في ظل ظروف ميدانية محاكاة. يمكن حمل جميع المعدات في حقيبة ظهر قياسية (الشكل 1) ، أو في سيارة ، أو على دراجة نارية (أو دراجة) ، أو بواسطة حيوان. يتم تسخين الحلول عن طريق وضع الحاويات في وعاء به ماء يتم تسخينه بموقد غاز صغير أو نار المخيم أو الفحم. بدلاً من ذلك ، يمكن تسخين الحلول الموجودة في حاوياتها مباشرةً باستخدام سخان يعمل بالبطاريات (العديد منها متوفر تجاريًا). يمكن إجراء الطرد المركزي إما باستخدام جهاز طرد مركزي يعمل يدويًا أو يعمل بالبطارية. يمكن أن تكون البطارية في سيارة أو دراجة نارية أو فانوس أو محمولة بشكل منفصل. بمجرد استخراج الأحماض النووية وترسيبها كأملاح CTAB أو في الإيثانول كأملاح الصوديوم ، يمكن نقلها بأمان إلى المختبر بغض النظر عن درجة الحرارة أو الظروف الخارجية ، دون المخاطرة بتدهور إضافي. في وقت لاحق ، يمكن إكمال ما تبقى من عملية الاستخراج في المختبر.

معدات استخراج الحمض النووي الميدانية الأساسية (أ) وحقيبة الظهر (ب). يتم تضمين جميع المعدات اللازمة للاستخراج إلى نقطة ترسيب الحمض النووي في الإيثانول. أ.

المعدات المصورة (من اليسار إلى اليمين): حاويات نفايات بلاستيكية ، أدوات تشريح ، كابلات مهايئ ، بطاريات 6 فولت ، أرفف أنبوبية صغيرة ، علبة بريد (زجاجة كلوروفورم بداخلها) ، ماصات (P20 ، P200 ، P1000) ، ميكروفوج يعمل بالبطاريات ، 100٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، صندوق ستايروفوم (مع 2X CTAB ، CTAB عازلة ترسيب ، عازلة TE عالية الملح ، 0.1X TE ، ماء RO) ، 1.5 مل أنابيب ميكروفوج ، حاوية نفايات ، شريط ملصقات ، أدوات طحن يدوية ، رؤوس ماصة ، قفازات ، حقيبة ظهر. غير مصور: مصدر تسخين ، جهاز طرد مركزي يتم تشغيله يدويًا (عادةً ، يتم استخدام إما جهاز طرد مركزي يعمل بالبطارية أو يعمل يدويًا ، انظر الشكل 2) ، وأدوات طحن تعمل بالبطاريات (انظر الشكل 6). ب. حقيبة ظهر بها جميع المعدات واللوازم في 1 أ معبأة بالداخل. يمكن رؤية بطاريتي الفانوس 6 فولت في جيوب على كل جانب من حقيبة الظهر. كان الوزن الإجمالي لحقيبة الظهر المحملة بالكامل 24 رطلاً (حوالي 10 كجم). بقيت مساحة حرة إضافية في حقيبة الظهر.


الوزن الجزيئي العالي (HMW) استخراج الحمض النووي و ndash تقليل عنق الزجاجة لتطبيقات تسلسل القراءة الطويلة الناشئة

يتوسع عدد التطبيقات التي تستخدم البيانات الناتجة عن تسلسل جزيئات طويلة من الحمض النووي ، أو HMW DNA ، بسرعة فائقة. ومع ذلك ، فإن الحصول على HMW DNA كمواد إدخال لهذه التطبيقات كان يمثل تحديًا تاريخيًا ويستغرق وقتًا طويلاً. يتوق مستخدمو تقنيات القراءة الطويلة الناشئة هذه لإيجاد حل لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة HMW باستخدام منهجية أسرع ، وواحدة قوية وسهلة الاستخدام. إن تبسيط هذه الخطوة المهمة وتسريعها سيمكن الباحثين من تنفيذ تطبيقاتهم النهائية التي تمت قراءتها لفترة طويلة بشكل أسرع وأكثر كفاءة ، مما ينتج عنه ثروة من المعلومات الجينومية السياقية بجهد أقل.

تطور تقنية تسلسل الحمض النووي

يتضمن تسلسل الحمض النووي تقليديًا قراءة سلاسل قصيرة من الحمض النووي وهو فعال من حيث التكلفة ودقيق. كان تسلسل سانجر ، رغم أنه ليس تسلسل قراءة قصيرًا تمامًا لأنه يمكن أن ينتج قراءات فردية تزيد عن 500 نقطة أساس ، هو الدعامة الأساسية للتسلسل لمدة 40 عامًا وكان حاسمًا في إنتاج التسلسل المرجعي الأول للجينوم البشري. شهد الجيل التالي من التسلسل إدخال التقنيات التي مكنت من تسلسل الملايين من السلاسل القصيرة بالتوازي & ndash توفير الفرصة لتسلسل الجينوم بأكمله بمعدل غير مسبوق. في الجيل الثالث من تقنيات التسلسل ، يزيل تسلسل الأجزاء الطويلة من الحمض النووي كجزيء واحد الحاجة إلى تجزئة الحمض النووي وتضخيمه. مزايا تسلسل القراءة الطويلة (LRS) عديدة: التسلسل أحادي الجزيء بدون تضخيم PCR يحذف تحيز GC الذي يحدث أثناء تضخيم تسلسل الحمض النووي في حالته الأصلية يتيح اكتشاف التعديلات الأساسية مثل المثيلة والعمل بطول قراءة يبلغ 10 كيلو بايت + يجعل تجميع الجينوم أسهل بطريقة مماثلة لتجميع اللغز مع قطع أكبر. على سبيل المثال ، إذا كنت تفكر في الجينوم على أنه أحجية يمكنك إما تجميعها باستخدام 100 قطعة كبيرة أو 10000 قطعة صغيرة ، فسيكون تجميع القطع الكبيرة أسهل بكثير ، مع وجود عبء أقل على المعلوماتية الحيوية. من ناحية أخرى ، يتطلب بناء الجينوم من القراءات القصيرة في النهاية مزيدًا من عمق التسلسل لتوفير تغطية أكبر.

خياراتنا الحالية لاستخراج الحمض النووي HMW أقل من مثالية

يعتبر أي شيء أكبر من 50 كيلو بايت DNA HMW ، ولكن هناك حاجة سريعة التطور للحمض النووي أكبر بكثير من ذلك & ndash عدة مئات من الكيلوبات ، حتى في نطاق قاعدة الميجا. إحدى الطرق التقليدية وغير المكلفة للحصول على DNA HMW في نطاق حجم قاعدة الميجا هي استخراج الفينول / الكلوروفورم إلى جانب ترسيب الإيثانول - إجراء طويل يعمل مع المواد الكيميائية الخطرة. يتم إعاقته أيضًا بسبب الصعوبة الحتمية في التعامل مع DNA HMW - أثناء عملية الاستخراج ، يصبح "blob" شديد اللزوجة ، مما يمثل تحديًا للعودة إلى المحلول قبل استخدامه. كما أن عملية استخدام الفينول أقل من ممتعة - فهي تتطلب العمل تحت غطاء دخان ، وله رائحة كريهة ، وهو سام وبالتالي يتطلب التخلص منه بشكل خطير.

هناك طرق أحدث لا تتضمن الفينول / الكلوروفورم ، مثل الأساليب القائمة على الخرزة المغناطيسية ، وهذه أيضًا لها مزايا وعيوب. هناك ميزة توافق الأتمتة ، والتي تتيح توسيع نطاق التجارب للحصول على إنتاجية أعلى. ومع ذلك ، فإن الخرزات المغناطيسية النموذجية صغيرة جدًا ، وترتبط جزيئات الحمض النووي الطويلة جدًا وتلتف حول عدة خرزات صغيرة في وقت واحد. يمكن أن يتسبب الطرد المركزي اللاحق أو التدوير أو الماصات في فصل الخرزات وقص DNA HMW. لذلك ، على الرغم من أنها تقدم تحسينات في الحجم ، فإن حجم الحمض النووي الذي يمكن استخراجه عادة ما يكون حوالي 100 كيلو بايت.

تم تقديم تقنية جديدة تستخدم الأقراص المغناطيسية المطلية بالسيليكا مؤخرًا واكتسبت بعض الزخم. يمكن عزل الحمض النووي في نطاق قاعدة الميجا ، وبينما تعطي طبقة السيليكا مساحة كبيرة لربط الحمض النووي ، فإنها ترتبط بشدة بالقرص مما يعطي طبقة تشبه الهلام من الحمض النووي ، والتي يصعب استخلاصها (إنتاجية أقل) وبالتالي يصعب حلها (سير عمل أطول).

كيف يحل NEB عنق زجاجة استخراج الحمض النووي HMW؟

طور باحثو NEB نهجًا جديدًا ينتج عنه DNA سليمًا و HMW من خلال استخدام الخرز الزجاجي. إنه يعالج اثنين من أوجه القصور في التقنيات الأخرى. أولاً ، الخرزات كبيرة وقطرها 4 مم & ndash وناعمة.

حبات زجاجية 4 مم لاستخراج HMW DNA

تم تحسين كيمياء التحلل لتعطيل نوكليازات والحفاظ على سلامة الحمض النووي ، ويتم إجراء التحلل عن طريق التحريض للتحكم في حجم جزء الحمض النووي & ndash التحريض الأسرع يوفر الحمض النووي الأصغر ، والإثارة البطيئة توفر الحمض النووي الطويل للغاية. بعد التحلل ، تؤدي إضافة الأيزوبروبانول إلى ترسيب شبكة كبيرة من الحمض النووي ويتم قلب الأنبوب بحيث يبدأ الحمض النووي في الالتصاق بالخرز الزجاجي والتفاف حوله ، مثل الطريقة التي تلتف بها حلوى القطن حول العصا. نظرًا لأن جزيئات الحمض النووي الطويلة تلتف حول الحبيبات الكبيرة ، فمن السهل جدًا إزالة الحمض النووي وندشله في الانزلاق بشكل أساسي. يتم التقاط الحمض النووي أيضًا في شكل مسترخٍ وليس مضغوطًا ، مما يسمح له بالعودة إلى المحلول بأقل جهد ممكن ، مما يعني أنه يمكن غالبًا استخدام الحمض النووي في نفس اليوم الذي يتم فيه استخراجه. تحقق من مذكرة التطبيق هذه حيث تمكن مستخدم واحد من تقليل 2-3 أيام من سير عمله.

هذه التقنية متاحة لمعالجة الخلايا ودم الأمبير (NEB # T3050) ، أو الأنسجة (والبكتيريا وبعض العينات الأخرى) (NEB # T3060) ، للتغلب على قيود العينات لبعض منهجيات الاستخراج الأخرى. يكتمل سير العمل في 30 دقيقة للخلايا ، و 60 دقيقة للدم و 90 دقيقة للأنسجة والبكتيريا. كما أن سير العمل السريع هذا يجعل استكشاف أي مشكلات تتعلق بالتطبيقات النهائية أسهل بكثير. يُعد التركيز المستقبلي على توسيع مخزون أنواع العينات أولوية عالية لباحثي NEB ، على سبيل المثال ، تحسين كيمياء التحلل للتغلب على تثبيط الربط الناجم عن السكريات في النباتات والفطريات والطحالب ، وتقييم اتساع الكائنات الحية الدقيقة واللافقاريات التي من أجلها يمكن استخدام النهج لعزل HMW DNA.

نظرة عامة على استخراج الحمض النووي HMW باستخدام العاهل للخلايا والدم

ما الذي يفعله الباحثون بتسلسلات قراءة طويلة؟

تعد الحاجة إلى استخراج الحمض النووي HMW بشكل سليم وسريع أمرًا ضروريًا حتى لا يضيع الباحثون وقتًا ثمينًا في إعداد المواد الأولية لمجموعة التقنيات المتزايدة باستمرار والتي تجمع وفرة من المعلومات الجينية. تعتمد بعض التطبيقات على تسلسل جزيئات الحمض النووي الطويلة جدًا هذه ، والبعض الآخر لا يتطلب بالضرورة جميع المعلومات التي تم التقاطها في قراءة تسلسل طويل. إذن ، ما الذي يفعله الباحثون بهذه الكمية الهائلة من معلومات التسلسل؟

حاليًا ، يتيح LRS معدلًا غير مسبوق لـ الجمعية دي نوفو لمجموعة واسعة من الجينومات - تسلسلات لا يوجد مرجع لها. قبل القدرة على أداء تسلسل قراءة طويل ، تم تجميع معظم التسلسلات المرجعية بناءً على contigs قراءة قصيرة ، تليها المهمة المعقدة لتجميع ما ينتهي به الأمر إلى تسلسل مرجعي مجزأ. إن استخدام امتداد طويل مستمر من الحمض النووي بدلاً من الأجزاء الأقصر يمنح الباحث معلومات سياقية أكثر بكثير حول كيفية تناسب القطع معًا. على سبيل المثال، رسم خرائط الجينوم يقوم أساسًا بعمل خريطة للكروموسومات & ndash تعيين جين معين لمنطقة الكروموسوم وتحديد المسافات النسبية بين الجينات وداخلها على نفس الكروموسوم. تحديد الشكل الإسوي الجديد يتم تقديمه بشكل أفضل باستخدام قراءات التسلسل الطويل لأنه يمكن أن يغطي جينًا متعدد exon بالكامل. يمكن أن تجعل exons المتداخلة والربط البديل من الصعب حل الأشكال الإسوية الجديدة باستخدام قراءات قصيرة. الاختلافات الهيكلية مثل عمليات النقل أو الانقلابات القطاعية الكبيرة يسهل تحديدها ويمكن وضعها بثقة أكبر داخل الجينوم عند استخدام امتدادات تسلسلية طويلة تمتد عبر الوصلات. في حين أن القراءات القصيرة يمكن أن تحدد التغييرات على مستوى نوكليوتيد واحد ، أو حتى indels الصغيرة ، فقد ثبت صعوبة تحديد الاختلافات في التسلسل الأكبر.

تستفيد بعض التطبيقات من القراءات الطويلة للحمض النووي ، على الرغم من عدم استخدام جميع المعلومات التي تم التقاطها في قراءة طويلة. مراحل الجينوم، على سبيل المثال ، يشير إلى القدرة على مراعاة الطبيعة الثنائية الصبغية للجينوم البشري عند النظر في المتواليات المشتقة من الأم والأب. تعطي التجميعات المستندة إلى النمط الفرداني والتي تم إنشاؤها من قراءات أطول للحمض النووي معلومات بشأن المتغيرات على نسختين متماثلتين من منطقة الكروموسومات وكيف يمكن أن يؤثر ذلك على التعبير عن جينات المنطقة. تعطي بيانات القراءة الطويلة التي تم إنشاؤها من تسلسل الحمض النووي HMW القدرة على ربط مناطق الجينوم المختلفة في سياقها والتي قد تكون متغيرة بطريقة ذات مغزى. يمكن أن يعطي هذا فهمًا للتعبير الخاص بالأليل والجمعيات الوراثية للنمط الظاهري. بالإضافة إلى ذلك ، عند النظر إلى تعديلات المستوى الأساسي مثل الميثيل ، فإن تسلسل الجزيئات الأصلية يسمح بتدرجها مع المتغيرات الجينية ، وهذا له تطبيقات في استكشاف التنوع اللاجيني. رسم الخرائط البصرية هي تقنية أخرى حيث لا يتم تسلسل جميع القواعد ولكن يرتبط الفلوروفور بخرائط تقييد مرتبة عالية الدقة للحصول على معلومات طويلة المدى حول كيفية ملاءمتها للهندسة الصبغية.

بشكل عام ، يؤدي تفكيك الجينوم مع تسلسل DNA المستمر الأكبر إلى تحسين تواصل التجميع ويعطي فهمًا أكبر للمعلومات الموجودة داخل الجينوم أكثر من الأجزاء الأصغر. عادة ما يكون عند مفاضلة العمق الكلي للتسلسل & ndash تسلسل القراءة القصيرة فعال من حيث التكلفة ، وعادة ما يتم تحقيق عمق تغطية أكبر عندما تتم محاذاة العديد من القراءات. ولكن ، في الواقع ، تتزاوج بيانات القراءة الطويلة والقصيرة بطريقة ، على الرغم من عدم النظر إليها بعمق ، هناك عمق تغطية ناتج عن القراءات القصيرة التي تكمل تواصُل القراءة الطويلة. لذلك ، بعبارة أخرى ، يتم الجمع بين نقاط القوة في كلتا طريقتين التسلسل.

تحتوي الجينوم على ثروة من المعلومات في انتظار الكشف عنها. تطبيقات تسلسل القراءة الطويلة التي تمت مناقشتها هنا ليست سوى بعض تلك التطبيقات الناشئة التي لديها القدرة على تقديم معلومات مثيرة تتعلق بالتركيب والتخليق الجيني والنمط الظاهري. يوجد حاليًا الكثير من الابتكار والإثارة في مساحة استخراج الحمض النووي لـ HMW. يعد الحد من عنق زجاجة الاستخراج خطوة أساسية في تمهيد الطريق لتسريع التقنيات الجديدة المثيرة التي تكشف أسرار الجينوم.

أخبرنا في قسم التعليقات بالعينات التي تعمل عليها والتقنيات التي تستفيد منها.


تحقق من ندوة الويب الخاصة بنا حيث يقدم مطور منتجات Monarch & reg HMW DNA Extraction Kit ، Giron Koetsier ، دكتوراه ، التكنولوجيا ، ويمشي خلال سير العمل ، ويشارك بعض بيانات التسلسل طويلة القراءة التي تم إنتاجها باستخدام HMW DNA المنقى.

لن تقوم NEB بتأجير أو بيع أو نقل بياناتك إلى طرف ثالث مقابل مادي. الاطلاع على سياسة الخصوصية الخاصة بنا للحصول على التفاصيل. عرض إرشادات المجتمع الخاصة بنا.

لا تفوت فرصة الاطلاع على أحدث إصدارات مدونة NEBinspired. يمكنك التسجيل لتلقي النشرة الإخبارية الإلكترونية!

أو قم بتنزيل تطبيق قارئ الخلاصة المفضل لديك وانقر فوق الرابط أدناه للاشتراك في موجز RSS الخاص بنا.

كن جزءًا من NEBinspired. أرسل فكرتك إلينا حتى تظهر في مدونتنا ..


استخراج الفينول كلوروفورم - (26 سبتمبر 2005)

قد ترغب في تجربة AquaPlasmid و AquaGenomic ، والتي لا تستخدم الفينول / الكلورفورم على الإطلاق لاستخراج الحمض النووي.

أي شخص يعرف كيفية تحضير المخزن المؤقت 5.1 لاستخراج الحمض النووي الريبي؟ هل هذا كل الكاشف يجب أن يكون خاليًا من RNase؟ من أين يمكننا الحصول عليهم؟

مجرد سؤال مبتدئ.
في استخراج الحمض النووي من الفينول-كلوروفورم ، نستخدم الفينول ، ولكن في حالة سائلة.
طلبت الفينول لكن الشخص الذي وصل كان في حالة كريستالية (ميرك).
لا يمكنني العثور على أي معلومات حول ذلك.

كيف يمكنني تحضير الفينول السائل من شكل بلوري.

مجرد سؤال مبتدئ.
في استخراج الحمض النووي من الفينول-كلوروفورم ، نستخدم الفينول ، ولكن في حالة سائلة.
طلبت الفينول لكن الشخص الذي وصل كان في حالة كريستالية (ميرك).
لا يمكنني العثور على أي معلومات حول ذلك.

كيف يمكنني تحضير الفينول السائل من شكل بلوري.

يمكنك إذابة 500 جم من الفينول الكريستالي في 500 مل 1M تريس pH 8.0 (إذا كنت تريد محلول الفينول لاستخراج الحمض النووي) أو 50 ملي أسيتات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 4.0 (عند تحضير حمض الفينول لاستخراج الحمض النووي الريبي). ضع في اعتبارك فحص الرقم الهيدروجيني لمحلول الفينول قبل الاستخدام وتجاهل هذا المحلول عندما يتحول الفينول إلى اللون الأحمر / البني.

العودة إلى الموضوع الرئيسي حول استخراج الفينول / الكلوروفورم. إذا قمت بتنقية منتج PCR ، والذي يتم تنقيته بواسطة الجل من جميع taq و dNTPs التي أفترضها. أستمر وأهضمه ثم أعطل الإنزيمات. كتاب الاستنساخ الجزيئي يقول الفينول / الكلوروفورم بعد ذلك ثم يربط .. ولكن لماذا إذا كان الحمض النووي مطهرًا بالفعل؟ هذا لن يؤدي إلا إلى مزيد من الخسارة.

مجرد سؤال مبتدئ.
في استخراج الحمض النووي من الفينول-كلوروفورم ، نستخدم الفينول ، ولكن في حالة سائلة.
طلبت الفينول لكن الشخص الذي وصل كان في حالة كريستالية (ميرك).
لا يمكنني العثور على أي معلومات حول ذلك.

كيف يمكنني تحضير الفينول السائل من الشكل الكريستالي.

اعتدت إذابة الفينول البلوري في حمام مائي 37 درجة مئوية ، ثم أضف (في غطاء المحرك) حجمًا متساويًا من Tris-Cl ، pH8 واخلط لتشبع الفينول. بعد تثبيت المزيج ، اسحب معظم الطبقة العلوية من محلول Tris الزائد وأضف حجمًا من الكلوروفورم: Isoamyl Alcohol (24: 1) يساوي الحجم الأصلي للفينول (لذلك بالنسبة لـ 500 مل من الفينول ، استخدم مزيجًا من 480 مل كلوروفورم + 20 مل IAA. يقلل IAA من ميل الكلوروفورم إلى الرغوة عند الخلط). أنت & # 39ll تحتاج إلى حاوية أكبر لهذا المزيج - أي شيء مغلف بالبراغي على ما يرام (لقد استخدمت Erlenmeyer بسعة 2 لتر) ، طالما تم تخزين المزيج النهائي في واحد أو أكثر من الجرار / الزجاجات البنية (محتويات حساسة للضوء) . أفضل طريقة للقيام بذلك هي صب خليط الفينول تريس في الحاوية الأكبر ، ثم غسل جرة الفينول الأصلية بعناية بخليط Cl: IAA عدة مرات ، مع سكبه في كل مرة في الحاوية الأكبر. هناك بعض المحاذير:
1. هذه الأشياء سيئة للغاية - خاصةً عندما يتم خلط الفينول الكاوية مع الكلوروفورم الذي يذوب في الدهون. لا تسكبها على الجلد المكشوف. ارتدِ الكثير من الأدوات الواقية (نظارات واقية ، ساحة مطاطية ، إلخ.)
2. الفينول نفسه مخلوط بالزلق مع Cl: IAA ، ويصبح زلقًا جدًا بالفعل ، وله عادة سيئة تتمثل في التسلل إلى الخارج تحت أغطية الجرة عند اهتزاز الجرة. قد يؤدي هذا إلى إسقاط الجرة الكبيرة من P: Cl: IAA ، مع عواقب غير سارة (وخطيرة للغاية) على البشر ومعدات المختبر. ارتدِ قفازات رائعة وممتعة للغاية - عملت قفازات غسيل الصحون المطاطية بالنسبة لي ، على قفازات المختبر القياسية من اللاتكس أو النتريل.
3. السائل P: C: IAA يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية لبعض الوقت (حتى أشهر) ، ولكن لا ينبغي استخدامه عندما يصبح اللون الأصفر الباهت داكنًا أو يتحول إلى اللون الوردي.
أعلم أن هذا أكثر مما تحتاجه - لكنني وجدت على مر السنين أن الكثير من المعلومات دائمًا ما يكون أفضل من عدم كفاية.

أوه ، وكاثي - إنها فكرة جيدة لتنظيف مادة الإنزيم / الملح من المزيج قبل الربط. لا يتعين عليك دائمًا استخراج الفينول ، على الرغم من - هناك عدد من مجموعات التنظيف الجيدة القائمة على الأعمدة من Qiagen و Promega وما إلى ذلك ، فهي أسرع وأسهل وأقل مزعجة ولديها خسارة أقل.

أهلا،
سؤال آخر لهذا الموضوع:
وهي طريقة & quotbest & quot (أي أكثر إنتاجية DNA عالية الجودة) إذا كانت العينات المتاحة تحتوي على كميات قليلة من الحمض النووي (مثل بيض الحشرات الصغيرة أو أرجلها). الكلوروفورم / الفينول ، التمليح ، كيت ، أو.
شكرا
hobglobin

هذا يعني أنني إذا كنت أرغب في استخلاص محلول الفيروس الغدي من الحمض النووي مع الفينول كلوروفورم (1: 1) ، يجب أن أحضر محلول الفينول كما قلت (500 جم كريستال فينو في 500 مل 1 م تريس pH 8) وخلطه مع الكلوروفورم.

مجرد سؤال مبتدئ.
في استخراج الحمض النووي من الفينول-كلوروفورم ، نستخدم الفينول ، ولكن في حالة سائلة.
طلبت الفينول لكن الشخص الذي وصل كان في حالة كريستالية (ميرك).
لا يمكنني العثور على أي معلومات حول ذلك.

كيف يمكنني تحضير الفينول السائل من الشكل الكريستالي.

يمكنك إذابة 500 جم من الفينول الكريستالي في 500 مل 1M تريس pH 8.0 (إذا كنت تريد محلول الفينول لاستخراج الحمض النووي) أو 50 ملي أسيتات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 4.0 (عند تحضير حمض الفينول لاستخراج الحمض النووي الريبي). ضع في اعتبارك فحص الرقم الهيدروجيني لمحلول الفينول قبل الاستخدام وتجاهل هذا المحلول عندما يتحول الفينول إلى اللون الأحمر / البني.


إعتراف

Author Adilah Ayoib gratefully acknowledges the support from the Director of Institute of Nano Electronic Engineering (INEE), Universiti Malaysia Perlis (UniMAP), the staff members and colleagues for valuable discussion and helpful comments. This work is also supported by NanoMalaysia Institute for Innovative Technology (NanoMite) Grant (9012 00006) program funded by Long Term Research Grant (LRGS), Ministry of Education, Malaysia. The views expressed in this publication are the authors’ own interpretation based on the data collected and do not reflect in any way the views of the funding agencies.


نتائج

Hypovirulence and Associated Traits of Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

Strain DT-8 grew slowly on potato dextrose agar (PDA) and developed colony morphology similar to that of the hypovirulent strain Ep-1PN (Fig. 1 أ and D). The hypovirulence phenotype of strain DT-8 is even more pronounced than that of strain Ep-1PN when inoculated onto نبات الأرابيدوبسيس thaliana (رسم بياني 1ب) or detached leaves of napus براسيكا (Fig. S1). Although strain DT-8 was able to produce sclerotia, the time required for sclerotial initiation was about 3–5 days longer than that for the normal strain and the sclerotia were randomly distributed on the colony surface. Furthermore, the size of the sclerotia produced by strain DT-8 was significantly smaller than that of the normal strain (Fig. 1ج).

Hypovirulence-associated traits of strain DT-8 of S. sclerotiorum. (أ) Abnormal colony morphology of strain DT-8 grown on a PDA plate at 20 °C for 15 days (ب) hypovirulent phenotype of strain DT-8 as exhibited by infected نبات الأرابيدوبسيس thaliana plants, which were maintained at 20 °C for 4 days postinoculation (ج) small sclerotia produced by strain DT-8 on a PDA plate at 20 °C for 30 days and (د) growth rate of strain DT-8 relative to other strains, bars represent standard deviation from the mean (ن = 8). The small letters on top of the bars in د indicate whether the differences are statistically significant (ص & lt 0.05). The RNA virus-infected hypovirulent strain Ep-1PN and its sexual progeny Ep-1PNA367 (virus-free) were used as controls DT-8VF is a virus-free culture derived by hyphal tipping of strain DT-8, and showed a normal phenotype of S. sclerotiorum.

Strain DT-8 was cured of its hypovirulent phenotype either by hyphal-tip culturing or protoplast regeneration, and the cured isolates of DT-8, such as DT-8VF, regained virulence on plants comparable to that of the normal strains (e.g., strain Ep-1PNA367) and developed normal colony morphology (Fig. 1 أ و د). Furthermore, the traits of these cured isolates can be reverted to the hypovirulence phenotype following contact with the original hypovirulent strain DT-8 (Fig. S2). Thus, strain DT-8 shows typical characteristics of virus-mediated debilitation/hypovirulence.

DNA Elements Associated with Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

Virus-mediated hypovirulence in pathogenic fungi is usually caused by either double-stranded (ds) or single-stranded (ss) RNA viruses. However, several attempts to extract dsRNA from strain DT-8 were unsuccessful. The genomic DNA of strain DT-8 was extracted and resuspended in RNase A-containing TE buffer, and the DNA sample was electrophoresed on 1% agrose gel and stained with ethidium bromide. Surprisingly, besides the fungal genomic DNA, two additional DNA bands with sizes of about 2 kb [large DNA element (LDE)] and 0.3 kb [small DNA element (SDE)], respectively, were clearly observed in a stained gel (Fig. 2أ). These two DNA elements could be digested with DNase I (active against ssDNA and dsDNA) and S1 nuclease (active against ssDNA or ssRNA) but could not be digested with either Exonuclease III (active against linear dsDNA) or Exonuclease I (active against linear ssDNA), suggesting that these elements are circular ssDNA molecules or linear ssDNA with modified 5′ and 3′ ends (Fig. S3أ).

Genomic characteristics and particle morphology of Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1 (SsHADV-1). (أ) Total DNA extracted from mycelia of strains DT-8 and DT-8VF. DNA samples were fractionated on 1.0% agarose gel. The positions of host genomic DNA, viral DNA, or the large DNA element (LDE) and defective viral DNA or small DNA element (SDE) of strain DT-8 are indicated. Lane M1, λ-هينd III-digested DNA Marker lane M2, DL2000 DNA ladder marker (TaKaRa). (ب) Southern blot analysis of total nucleic acid extracted from mycelia of strains DT-8 and DT-8VF. The forms of viral DNA are indicated as OC dsDNA [open circular double-stranded (ds) DNA], SC dsDNA (supercoiled dsDNA), and circular single-stranded (ss) DNA. A 379-bp DNA fragment of Rep was PCR amplified and labeled with α- 32 P dCTP and used as a probe. (ج) Viral particles observed under transmission electron microscopy. Particles were purified from mycelia of strain DT-8 and negatively stained with 1% uranyl acetate. (Scale bars, 50 nm.) (د) SDS/PAGE analysis of SsHADV-1 coat protein. Samples collected from fractions corresponding to 25% sucrose of sucrose gradients were subjected to SDS/PAGE. The size of the Coomassie blue-stained protein was estimated by comparison with protein markers. (ه) Agarose gel electrophoresis on 1% agarose of DNA extracted from sucrose gradient fractions containing virus particles. (F) Genome organization of SsHADV-1. Functional ORFs (coding for CP and Rep) were displayed as thick arrows. The positions of the potential stem–loop structure, large intergenic region (LIR) and small short intergenic region (SIR) were marked the stem-loop structure was shown on the right. LIR is also shown in an expanded form to indicate the elements of the bidirectional promoter.

Interestingly, strain DT-8VF, which was derived from strain DT-8, lacked the additional ssDNA elements characteristic of DT-8 (Fig. 2 أ و ب). However, after contacting the colony of strain DT-8, newly obtained isolates of strain DT-8VF contained the two ssDNA elements, and their colony morphology and virulence were as debilitated as the original strain DT-8 (Fig. S2). Thus, the ssDNA elements are likely to be associated with hypovirulence of strain DT-8.

Cloning and Sequencing of the Full-Length DNA Elements of Strain DT-8.

Full-length DNA clones of LDE were obtained by PCR amplification, confirmed by Southern blot analysis (Fig. 2ب) and subjected to sequence analysis. Sequencing results showed that the full-length DNA of LDE is 2,166 nt in length and contains two large ORFs, whose expressions were confirmed by northern hybridization and RT-PCR analysis (Fig. S4 أ و ب). One ORF, whose expression codes for a putative coat protein, is located on the sense strand and the other ORF is situated on the complementary-sense strand and codes for a putative replication initiation protein (Rep) (Fig. 2F). The putative Rep has two conserved domains, namely geminivirus Rep catalytic domain (Gemini_AL1) and geminivirus Rep protein central domain (Gemini_AL1_M) with conserved motifs for rolling-circle replication (21) (Fig. 3أ). Two intergenic regions separate the two ORFs, the large intergenic region (LIR) contains 133 nt and the small intergenic region (SIR) contains 119 nt (Fig. 2F). Both LIR and SIR also have similar characteristics to those of viruses in the genus Mastrevirus in the family Geminiviridae (22). LIR has an unusual nonanucleotide TAATATT↓AT at the apex of a potential stem-loop structure, which is recognized at a specific position (↓) by the Rep during the initiation of virion DNA replication (23). Therefore, the large DNA element most likely represents a DNA viral genome.

Phylogenetic analysis of SsHADV-1. (أ) Amino acid sequence alignment of Rep of SsHADV-1 and selected viruses from the genus Mastrevirus in the family Geminiviridae. The conserved motifs (I to VII) were shaded with light gray color Asterisks indicate identical amino acid residues, and colons indicate similar residues. Conserved motif Ito VII are IRD, RCR-I, RCR-II, RCR-III, RBR, NTP Binding-A, and NTP binding-B, respectively. The Alignment was generated by using CLUSTALX (2.0). Numbers in brackets are the positions of amino acid residues that are not listed. (ب) Phylograms of the Rep and CP of SsHADV-1 and selected circular ssDNA viruses in the families Geminiviridae, Nanoviridae and Circoviridae. Multiple alignments of amino acids and tentative phylogenetic trees generation were referred to the method described by Liu et al. (20). The position of SsHADV-1 is indicated by a red star. See Table S1 for abbreviations of virus names and viral protein accession numbers used for phylogenetic analysis.

Sequence analysis showed that the SDE comprises a mixture of ssDNA molecules, 236–284 nt in length, representing defective DNA derived from LDE. They lack the two ORFs but contain both LIR and SIR (Fig. S5). The short direct repeat sequences flanking LIR and SIR may represent signal nucleotides for deletion (24).

Viral Particles in Strain DT-8 of S. Sclerotiorum.

To confirm that LDE represents a viral genomic DNA, mycelial mass of strain DT-8 grown on a PDA plate was collected and subjected to a virus purification protocol that includes sucrose gradient centrifugation as the final step. The major band containing viral particles, which was present in the gradient region corresponding to 25–30% sucrose, was collected and the viral particles were recovered by centrifugation. Negatively stained viral particles observed with an electron microscope were nontwinned isometric particles, 20–22 nm in diameter (Fig. 2ج). The viral particles were examined for coat protein (CP) and viral genomic DNA contents. A DNA band, similar in size to the LDE extracted directly from mycelia of strain DT-8, was extracted from the viral particles (Fig. 2د). Like the ssDNA form of M13 phage genomic DNA, the DNA extracted from viral particles can be digested by ssDNA nuclease S1, but not by Exonuclease I (Fig. S3ب). Only one major protein with a molecular mass of about 35 kDa was resolved by SDS/PAGE analysis (Fig. 2ه). The size of this isolated protein is similar to that predicted for coat protein based on DNA sequence analysis. Furthermore, N-terminal sequencing analysis further confirmed that the isolated protein was in fact the coat protein. Thus, we verified that the large DNA element in strain DT-8 represents a circular ssDNA viral genome, which we named Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1 (SsHADV-1).

Sequence and Phylogenetic Analyses of SsHADV-1.

Sequence analysis of the full-length amino acid sequence of the putative Rep of SsHADV-1 showed that it shares the highest sequence identity with the Reps of chickpea chlorotic dwarf virus (25), bean yellow dwarf virus (26), and tobacco yellow dwarf virus (27) (Table S2). These three viruses that infect dicotyledonous plants belong to the genus Mastrevirus (Fig. 3أ). Phylogenetic analysis of SsHADV-1 and selected ssDNA viruses showed that the putative Rep of SsHADV-1 clusters with members of the family Geminiviridae, but it is distinct from ssDNA viruses in the families Nanoviridae and Circoviridae (Fig. 3ب). Although SsHADV-1 appears to be related to geminiviruses, it is clearly different from all documented geminiviruses. In addition to the difference in particle morphology, the genome of this fungal DNA virus has an unusual nonanucleotide and is smaller than those of plant geminiviruses in the genus Mastrevirus (24). The genome of SsHADV-1 only codes for two proteins (CP and Rep), but lacks a gene for movement protein (MP), which is a key protein of plant geminiviruses for cell-to-cell movement. Furthermore, the Rep gene on the complementary strand lacks an intron. Moreover, phylogenetic analysis of the CP of SsHADV-1 and that of viruses in the families Geminivirdae, Nanoviridae, and Circovirdae shows that SsHADV-1 CP is phylogenetically divergent because it does not cluster with any of the viruses included in this analysis (Fig. 3ب). Thus, SsHADV-1 most likely belongs to a family that is phylogenetically related to the family Geminiviridae. Interestingly, we found that SsHADV-1 CP shares the highest sequence similarity with a marine putative protein (Marine_PP) encoded by a whole genome shotgun sequence (GenBank accession no.: AACY024124290) from a metagenomic data of a microbial community from Sargasso Sea (28). The percent identity and similarity of these two proteins are 37.8% and 52.6%, respectively (Fig. S6). Considering that a short gene sequence possibly coding for a viral Rep is present on the same fragment as this Marine_PP gene, this putative protein is likely of a viral origin. It is thus possible that SsHADV-1 is more closely related to the putative marine virus (most likely infecting algae) than to plant geminiviruses.

Infectivity of Purified SsHADV-1 Particles and Viral DNA Extracted Directly from Infected Mycelium.

Mycelial agar discs were taken randomly from regeneration plates of transfected S. sclerotiorum protoplasts and transferred into fresh PDA plates. Isolates Ep-1PNA367-NT3 and Ep-1PNA367-NT7 were derived from colonies where viral DNA-transfected protoplasts were regenerated and isolates Ep-1PNA367-PT2 and Ep-1PNA367-PT6 were derived from colonies where viral particle-infected protoplasts were regenerated. Colony morphology and hyphal growth of these four isolates were similar to those of strain DT-8 but different from the virus-free strain Ep-1PNA367 (Fig. 4أ). Viral DNA also was extracted successfully from these cultures and confirmed with PCR amplification using the specific primers, which were designed based on the Rep sequence (Fig. 4 ب و ج). Thus, both purified viral particles and viral DNA-enriched fractions isolated directly from infected mycelium were able to transfect S. sclerotiorum protoplasts.

PEG-mediated protoplast transfection with purified SsHDV-1 particles and viral DNA extracted directly from infected mycelium. Colony morphology of the virus-free strain Ep-1PNA367 and its newly transfected isolates. Ep-1PNA367-NT3 and Ep-1PNA367-NT7 were isolated from transfectants with purified viral DNA, whereas Ep-1PNA367-PT2 and Ep-1PNA367-PT6 were isolated from transfectants with viral particles. Colonies were grown on PDA plate at 20 °C for 7 days. (ب) Viral DNA extracted from transfected cultures of strain Ep-1PNA367. Lane 1, strain Ep-1PNA367 lane 2, Ep-1PNA367-NT3 lane 3, p-1PNA367-NT7 lane 4, Ep-1PNA367-PT2 lane 5, Ep-1PNA367-PT6 lane 6, strain DT-8 and lane M, λ-هينd III-digested DNA Marker. (ج) Viral DNA of newly transfected cultures were confirmed by PCR amplification with primer pair designed from the Rep sequence of SsHADV-1. Lane M, DL2000 DNA ladder marker lane 1 to lane 6 are as the same as in ب.

Transmission of SsHADV-1 from Strain DT-8 to a Vegetatively Incompatible Strain of S. sclerotiorum.

Vegetative incompatibility between two fungal individuals often limits the transmission of mycoviruses, and the most likely reasons are compartmentation and cell death of the fusing hyphal cells (29, 30). However, transmission of hypoviruses between two vegetatively incompatible strains has been observed previously (31). In our experiment, successful transmission of SsHADV-1 between vegetatively incompatible strains of S. sclerotiorum was confirmed by dual-culture of DT-8 and the vegetatively incompatible virulent strain Ep-1PNA367, which was labeled with hygromycin-resistance gene. Virus-infected isolates of strain Ep-1PNA367 were frequently obtained from dual culture plates (7 from 21 dual-culture plates), and all newly infected isolates of strain Ep-1PNA367 were converted to hypovirulence and showed a similar phenotype to that of strain DT-8 (Fig. S7).


Any real difference between DNA purification kits? - (May/02/2014 )

Is there any important difference between e.g. PCR clean-up, eukaryotic genomic DNA extraction, mini-, midi-, maxi- plasmid prep, gel extraction kits sold by different companies or are they all selling the same things?

There is a difference between genomic DNA preparation kits and plasmid preparation kits. The kits for PCR cleanup, gel purification, and column based plasmid kits are pretty similar in the final portion of the protocols, but differ in the sample handling early on, primarily in releasing the DNA and adjusting chemistry so that it binds. The charge-switch kits are different chemistry. I'm now a fan of magnetic bead purification for most applications.

I'm not sure whether my question was clear. Just in case, I'm asking whether there's a difference between the kits of different companies' (e.g. QIAGENs vs Promegas vs Life Technologies) kits.

Why do you prefer magnetic bead-based kits? Have you been using them long?

In general there isn't much difference, though there may well be some adjustment of the chemistry to enhance DNA extraction over the basic protocols, though these bits would be proprietary (check the MSDS they will often tell you components based on hazard).

The costs make sometimes the difference .

For DNA extraction kits I know a study where they compared several kits to extract DNA from museum species and they found quite clear differences between companies in terms of DNA yield and PCRs with this DNA (working or not). Therefore especially for difficult and unusual sources the differences can be huge, whereas for standard samples the differences might be small (and differences in results due to differently skilled users can superimpose the actual kit differences).

Generaly QIAGEN is thought to be the best, and also the most expensive (may not be true at different uses and needs, both of these).

For PCR cleanup/gel extraction, I don't know about the others, but Q offers colums with minimal elution volumes, which makes DNA isolated from gel to have reasonable concentration for spectrophotometric measuring (i.e. more than 10 ng/ul). Any other companies, may have half the prize for column kit, but half the yield and much bigger elution volume, so at the end you get so low concentration it's hard to measure.

For plasmids, there depends how much you care about yield. Minipreps are usually only good for testing, and you do a lot of them so we use column kits from a noname cheep company (but we don't use their gel extraction kits as I mentioned). In this case, prize is more important.

Q has even several types of isolation for Midi and Maxi preps, some use filter, some not (in one case needs a centrifuge force we didn't have, so we ended using several midipreps instead of Maxi, when only overall yeald is required and not a high concentration, because it was both cheaper and more bothersome). But if you cultivate a huge bottle of bacteria, you don't want to waste it on some shitty cheap kit. 

Genomic DNA isolation depends much on the type of source tissue and how much you want do bother with it. Q has really many types, for lipidous tissues, plants, etc, many protocols. You can use a whole blood if you want, but as I'm a "blood person" I still prefer classic phenol/chlorophorm, because there is generaly no kit, that would process 6-9 ml of whole blood, the colum kits are usualy up to 1 ml, that's a waste..  but fine for small animals blood, where you don't have that much and you need a PCR-grade DNA.

And.. several companies have differen systems, Q has mostly columns, but few other types, and those kits for the robot of theirs, also column kits that are compatible with vacuum thingy they sell.

Other companies have magnetic beads (not sure if Q makes them) so if you prefer certain type, you choose a company by that. (some other company was really into some weird filtering stuff, for isolations, there are many approches).

LifeTech engulfed Invitrogen and late Ambion, and Ambion was known for the best RNA stuff. But RNA is more tricky thing than DNA. RNA isolation kits we use are mostly not from Q. So, depends on who is doing the best, the exact thing you need. 

But personally I found another huge plus for Q, in theyr marvelous protocols. There just the small books you can read, some background info, clear and comprehensible protocol (protocol variants often).. I've seen Invitrogen manuals, Promega manuals (my god..), ABI manuals (they are so full of safety nonsense and whant other things you should buy from them..), I have seem folded papers of noname companies, but QIAGEN simply makes the best manuals. 
I would take it as a reading on a vacation, with graphs and pictures!

No seriously, I found the comfort of work also an important part. Sometimes it's worth the money, sometimes not.

There is also this company that sells alegedly "the same colums as QIAGEN has" in bulk and manual how to mix your own "QIAGEN" buffers. That is also possible. 

Trof on Tue May 6 21:13:28 2014 said:

Generaly سIAGEN is thought to be the best, and also the most expensive (may not be true at different uses and needs, both of these).

 

For PCR cleanup/gel extraction, I don't know about the others, but س offers colums with minimal elution volumes, which makes DNA isolated from gel to have reasonable concentration for spectrophotometric measuring (i.e. more than 10 ng/ul). Any other companies, may have half the prize for column kit, but half the yield and much bigger elution volume, so at the end you get so low concentration it's hard to measure.

 

For plasmids, there depends how much you care about yield. Minipreps are usually only good for testing, and you do a lot of them so we use column kits from a noname cheep company (but we don't use their gel extraction kits as I mentioned). In this case, prize is more important.

س has even several types of isolation for Midi and Maxi preps, some use filter, some not (in one case needs a centrifuge force we didn't have, so we ended using several midipreps instead of Maxi, when only overall yeald is required and not a high concentration, because it was both cheaper and more bothersome). But if you cultivate a huge bottle of bacteria, you don't want to waste it on some shitty cheap kit. 

 

Genomic DNA isolation depends much on the type of source tissue and how much you want do bother with it. س has really many types, for lipidous tissues, plants, etc, many protocols. You can use a whole blood if you want, but as I'm a "blood person" I still prefer classic phenol/chlorophorm, because there is generaly no kit, that would process 6-9 ml of whole blood, the colum kits are usualy up to 1 ml, that's a waste..  but fine for small animals blood, where you don't have that much and you need a PCR-grade DNA.

 

And.. several companies have differen systems, س has mostly columns, but few other types, and those kits for the robot of theirs, also column kits that are compatible with vacuum thingy they sell.

Other companies have magnetic beads (not sure if س makes them) so if you prefer certain type, you choose a company by that. (some other company was really into some weird filtering stuff, for isolations, there are many approches).

 

LifeTech engulfed Invitrogen and late Ambion, and Ambion was known for the best RNA stuff. But RNA is more tricky thing than DNA. RNA isolation kits we use are mostly not from س. So, depends on who is doing the best, the exact thing you need. 

 

 

But personally I found another huge plus for س, in theyr marvelous protocols. There just the small books you can read, some background info, clear and comprehensible protocol (protocol variants often).. I've seen Invitrogen manuals, Promega manuals (my god..), ABI manuals (they are so full of safety nonsense and whant other things you should buy from them..), I have seem folded papers of noname companies, but سIAGEN simply makes the best manuals. 
I would take it as a reading on a vacation, with graphs and pictures!

No seriously, I found the comfort of work also an important part. Sometimes it's worth the money, sometimes not.

 

There is also this company that sells alegedly "the same colums as سIAGEN has" in bulk and manual how to mix your own "سIAGEN" buffers. That is also possible. 

Now I'm wondering if you have a contract with the "Q" company?

Maybe for people working with "clean" stuff QIAGEN is a reference. For the ones we work in environmental micro, you never use their kits for isolation. Probably, MoBIO has more stuff in environmental DNA extraction than any other company. And if you use kits for that type of samples you usually use either one from MOBIO or the FastDNA Spin kit (or one the many protocols derived from it).

hobglobin on Wed May 7 16:40:31 2014 said:

Now I'm wondering if you have a contract with the "Q" company?

No, but I obviously should ask them to 
 
(they're are expensive, so not an option for everyone, but as said, often a "golden standard")
 
 
 

El Crazy Xabi on Thu May 8 05:39:16 2014 said:

Maybe for people working with "clean" stuff QIAGEN is a reference. For the ones we work in environmental micro, you never use their kits for isolation. Probably, MoBIO has more stuff in environmental DNA extraction than any other company. And if you use kits for that type of samples you usually use either one from MOBIO or the FastDNA Spin kit (or one the many protocols derived from it).

Didn't they have that miraculous polymerase mixes, that can overcome many inhibitors? One company had such, especially for soil samples and other.. so you could do onsite PCR (but I don't remember which company that was). I found that very interesting, but I don't need that actually.

Q supplies "Q solution" which is 1M betaine.  They forgot to pay me this month. -)


Has anyone here done an RNA extraction?

In the lab I'm working in, I'm still in the midst of being trained. I just did my third RNA extraction and the results were horrid. I know it comes with practice, but does anyone have any helpful tips? I do RNA extractions on Brachypodium/Oryza sativa roots with the RNeasy plant mini kit, starting with grinding the roots in a mortar and pestle and then a series of washes. I try to grind the tissue up as hard as I can and get as much as I can into the collection tubes, I just can't tell if my error is in the grinding/collecting or in the washes, if I'm not being careful enough with my micro-pipetting. Thanks in advance for any helpful tips, Iɽ like to get some good RNA samples so I can move onto RT-PCRs and sequencing.
Cheers!

[EDIT]: Just to add to this, I'm an undergraduate student doing research- so I don't really have much say in what I use/do- I have to use the plant kit and follow the protocol- just looking for tips to make the best of what I have. :)

From my experience (have done thousands of extractions in the last two years), ditch the column kits for TRIzol extractions (also use glycogen, incubate the sample in a -80 for 1-24hrs during the precipitation step, and add a second ethanol wash to the standard protocol, I can send you my modified protocol if youɽ like). Since moving to this new method I've had a 100% success rate with the last 300 samples, great specs, high yields, and no degradation. I had so many issues with the column kits (60-80% success rate with less than perfect specs) that I've given up on them.

If you want to keep using the columns try these things: Make sure you're using filtered tips for any steps involving RNA, make sure your washes are thorough (invert and roll the tubes to get the wash all over the inside and lid before a spin), and use a vac or pipette to remove washes (don't just flick it out of the collection tube).

*Edit: Here is my modified protocol, I work on human cells but there might be some additional steps for plant tissue so look at the original Thermo protocol to find out. Also, make sure you are clean around RNA and use 10% bleach or RNase Zap on your gloves/workspace/tools to inhibit any RNases before working.

Going to second this protocol. Trizol is the shit. I've also heard that linear polyacrylamide works even better than glycogen as an RNA carrier.

Extra recommendation if OP wants to keep using the columns (this protocol combines the high yield of Trizol with the easy/clean-ness of kits):

Follow /u/what_are_you_saying's protocol through step 5, then transfer the aqueous phase to an RNAse-free eppendorf tube.

Kits frequently have an "clean up RNA using our column" protocol. Use that protocol on the aqueous bit from the bullet point above.

If your kit does not have a "RNA clean up protocol", add lysis buffer/ethanol to the amounts you would normally need for a 200uL liquid sample. Do NOT add beta-mercaptoethanol or proteinase K. Add this mixture to the column and purify RNA normally according to instructions for a normal sample in the kit.

This protocol can usually get a couple ug of ultra-clean RNA even if you have an extremely small amount of starting material (like say 10 Drosophila heads).

Have you ever done extractions without glycogen? If so, do you find that the glycogen increases yield? Increases purity?

I use a column kit, I have 100% success rate, with most of my samples scoring a RIN of 10. Mouse cells here.

I'm a molecular geneticist who works on plants. I've done a lot of RNA extractions. Here's a couple thoughts.

-RNA degrades very easily and is much less stable than DNA. Spray down your work bench, pipettes, and your gloves with ethanol before you begin an extraction. Touch something else while the centrifuge is spinning? Spray your gloves again. I also like to use special "filter tips" to avoid contaminating my samples with RNases.

-It sounds like you're using a kit. Make sure you follow the directions carefully - a lot of the buffers have similar sounding names. If there are optional steps, do them. At the final step, when you are eluting your RNA out of the column, I like to take what comes out and pipette it back into the top of the column. This second wash will give you a slightly higher yield.

-It sounds like you're new in the lab - welcome! I'm sure there are some more senior people working with you who have done that protocol (not necessarily the PI, but perhaps even a post doc or a grad student). Ask them for help! Ask them to sit with you while you do the protocol and they can observe your technique and might be able to point out something you're doing incorrectly.


In Genomic Dna Isolation Why We Use 70 Percent Ethanol?

Because 70% ethanol can wash the DNA pellet at the end of DNA isolation process. The genomic or plasmid DNA isolation needs several buffers like lysis buffer, TAE buffer along with different salts and phenol, chloroform, iso-amylalcohol solution.

So at the end we have to wash the DNA pellet with 70% ethanol. 100% ethanol will dry the estimated DNA that's why 70% ethanol is used for this purpose.

You might also like.

The reason why uracil is not seen in DNA is because there are certain enzymes that break it down before.

The denisities of materials is clearly visible in blood agar making it useful as a primary isolation.

1987 was the first year that DNA evidence was used to convict someone in the US. If you would like.

Something to consider: Purifying alcohol is expensive. Each time you distill it you can make it.

It does not lyse WBCs probably because RBCs do not contain nucleus and are more prone to lysis than WBCs.

Because it's what they ave to use.

Molecular biology is completely dependant on the methods of electrophoresis, this method separates DNA.

It acts as a chaotroph (at high concentrations) and will 'dehydrate' the DNA, meaning that the DNA is.

The medical field has used statistics extensively for a very long time - perhaps more than any other.

Its a preprocesser directive of c language which can be use to include a specific file..ex :#include.


شاهد الفيديو: How to Extract DNA from Strawberries (أغسطس 2022).