معلومة

هل كاشف Ellman خاص بالبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والثيول؟

هل كاشف Ellman خاص بالبروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والثيول؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل لا يزال من الممكن تحديد كمية البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي الغنية بالسيستين مثل Metallothionein في عينة معينة باستخدام كاشف Ellman إذا كانت العينة ملوثة ببعض البروتينات عالية الوزن الجزيئي؟


إنه خاص بالثيول بشكل عام. إذا كانت البروتينات الملوثة تحتوي على ثيول يمكن الوصول إليه بمذيب ، فسوف يتفاعل DTNB معها.


مقدمة

الثيول ، المعروف أيضًا باسم مركابتان ، هو فئة من المركبات العضوية التي تحتوي على مجموعة سلفهيدريل (–SH) تتكون من ذرة كبريت وذرة هيدروجين متصلة بذرة كربون [1]. يتكون تجمع ثيول البلازمي بشكل أساسي من ثيول الألبومين وبروتين ثيول ويتشكل بشكل طفيف بواسطة ثيول منخفض الوزن الجزيئي مثل السيستين (Cys) وسيستينيل جلايسين والجلوتاثيون والهوموسيستين وبيتا-جلوتاميل سيستئين [2].

يمكن أن تخضع الثيول (RSH) لتفاعل أكسدة عبر المؤكسدات وتشكيل روابط ثنائي كبريتيد (RSSR) [3]. رابطة ثاني كبريتيد عبارة عن رابطة تساهمية تسمى الرابطة أيضًا رابطة SS أو جسر ثاني كبريتيد. في ظل ظروف الإجهاد التأكسدي ، يمكن أن تؤدي أكسدة مخلفات Cys إلى تكوين قابل للعكس لثنائيات الكبريتيدات المختلطة بين مجموعات بروتين ثيول وثيول الكتلة الجزيئية المنخفضة. يمكن مرة أخرى اختزال روابط ثنائي الكبريتيد المتكونة إلى مجموعات ثيول ، وبالتالي ، يتم الحفاظ على التوازن الديناميكي بين ثيول- ثاني كبريتيد [4].

حالة استتباب ثيول ثاني كبريتيد الديناميكي لها أدوار مهمة في الحماية المضادة للأكسدة ، وإزالة السموم ، ونقل الإشارات ، والاستماتة ، وتنظيم النشاط الأنزيمي وعوامل النسخ وآليات الإشارات الخلوية [5] ، [6]. علاوة على ذلك ، فإن التوازن الديناميكي لثاني كبريتيد الثيول يتورط بشكل متزايد في العديد من الاضطرابات. هناك أيضًا مجموعة متزايدة من الأدلة التي تثبت أن حالة توازن ثيول كبريتيد غير طبيعية متورطة في التسبب في مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك مرض السكري [7] ، وأمراض القلب والأوعية الدموية [8] ، والسرطان [9] ، والتهاب المفاصل الروماتويدي [10] ، مرض الكلى المزمن [11] ، متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) [12] ، مرض باركنسون ، مرض الزهايمر ، ترنح فريدريك و 27 ثانية (FRDA) ، التصلب المتعدد والتصلب الجانبي الضموري [13] ، [14] ، [ 15] واضطراب الكبد [16]. لذلك ، يمكن أن يوفر تحديد التوازن الديناميكي لثاني كبريتيد الثيول معلومات قيمة عن مختلف العمليات الكيميائية الحيوية العادية أو غير الطبيعية.

يتم قياس مستوى ثيول البلازما بشكل أكثر شيوعًا باستخدام كاشف Ellman الكلاسيكي ، وحمض 5،5′-dithiobis- (2-nitrobenzoic) (DTNB). يتم تقليل هذا المركب بطريقة متكافئة بواسطة الثيول الحر في تفاعل التبادل ، مما يؤدي إلى تكوين ثنائي كبريتيد مختلط وإطلاق جزيء واحد من حمض 5-ثيونيتروبنزويك ، والذي يمكن قياسه عند 412 نانومتر [17]. كاشف بديل لـ DTNB هو 4،4′-dithiodipyridine (4-DPS) [18]. يؤدي تقليل 4-DPS إلى 4-thiopyridone tautomer ، ويمكن قياس ذلك عند 324 نانومتر ، وهو طول موجي قريب من الأشعة فوق البنفسجية. لا يمكن استخدام هذا الطول الموجي بواسطة أجهزة التحليل الآلي لأن أقل طول موجي هو 340 نانومتر في جميع أجهزة التحليل الآلي المستخدمة في مختبرات الكيمياء السريرية.

على حد علمنا ، لا توجد طريقة قياس ألوان آلية لمستويات ثنائي كبريتيد البلازما / المصل الديناميكي [19]. في عدد قليل من الدراسات الحديثة ، تم تحديد مستويات ثنائي كبريتيد وثيول لمركبات ثاني كبريتيد منخفضة الوزن الجزيئي في البلازما باستخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) [20] ، [21] ، ورحلان شعري مضيء [22] وأنظمة مضيئة بيولوجيًا [23]. في هذه الأنظمة المتطورة ، عمليات الفصل مثل إزالة المواد المختزلة المتبقية ، والتي هي NaBH4هناك حاجة أيضًا إلى تريس (2-كاربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) وتريبوتيل فوسفين ، بالإضافة إلى ترسيب البروتينات [19]. وتستغرق تطبيقات المعالجة وإجراءات القياس وقتًا طويلاً ، وتتطلب عمالة مكثفة ومكلفة ، وتتطلب تقنيات معقدة.

في هذه الدراسة ، تم وصف اختبار جديد وآلي يحدد التوازن الديناميكي للثيول / ثنائي الكبريتيد الديناميكي ومفهوم مجموعة الاختبار الجديد الذي يحتوي على S –S –، –SH، –S –S - / - SH، –S –S - / (- تم تقديم SH + –S – S–) و –SH / (- SH + –S – S–).


معدلات تفاعلات تبادل ثيول - ثاني كبريتيد بين أحادي وثنائي ثنائي الكبريت وكاشف إيلمان

مشاهدات المقالات هي مجموع تنزيلات النصوص الكاملة للمقالات المتوافقة مع COUNTER منذ نوفمبر 2008 (بتنسيق PDF و HTML) عبر جميع المؤسسات والأفراد. يتم تحديث هذه المقاييس بانتظام لتعكس الاستخدام حتى الأيام القليلة الماضية.

الاقتباسات هي عدد المقالات الأخرى المقتبسة من هذه المقالة ، ويتم حسابها بواسطة Crossref ويتم تحديثها يوميًا. اعثر على مزيد من المعلومات حول عدد الاقتباسات من Crossref.

درجة الانتباه Altmetric هي مقياس كمي للاهتمام الذي تلقته مقالة بحثية عبر الإنترنت. سيؤدي النقر فوق أيقونة الكعك إلى تحميل صفحة على altmetric.com تحتوي على تفاصيل إضافية حول النتيجة ووجود وسائل التواصل الاجتماعي للمقالة المحددة. يمكنك العثور على مزيد من المعلومات حول "نقاط الانتباه البديلة" وكيفية احتساب النتيجة.

ملحوظة: بدلاً من الملخص ، هذه هي الصفحة الأولى للمقالة.


الملخص

تلعب مجموعات Thiol في الجزيئات البيولوجية دورًا مهمًا في الوظائف الفسيولوجية المختلفة والظروف المرضية. تنقسم الثيول إلى مجموعتين رئيسيتين: بروتين ثيول وثيول غير بروتين. تم الإبلاغ عن العديد من الطرق لفحوصات ثيول. تم تطوير معظم هذه الطرق للجلوتاثيون ، وهو بروتين ثيول غير بروتيني رئيسي ، على الرغم من حقيقة أن بروتين ثيول البروتين الخلوي أكثر وفرة من الجلوتاثيون. علاوة على ذلك ، تتضمن هذه الطرق عادة عملية تحضير العينة البيولوجية تليها طريقة الفصل ، وهي تستغرق وقتًا طويلاً. أبلغنا سابقًا عن سلسلة من كبريتيدات البنزوفورازان الفلورية الفلورية. تتفاعل كبريتيدات البنزوفورازان غير الفلورية هذه بسرعة وعلى وجه التحديد مع الثيول لتشكيل معقد ثيول فلوري قوي. أسفر التفاعل السريع والطبيعة الفلورية الخاصة بالثيول للكبريتيدات عن تطبيق واحد من الكبريتيدات من أجل التقدير النسبي للثيول الكلي في الخلايا الحية من خلال الفحص المجهري الفلوري. في هذا العمل ، استخدمنا نفس المركب لتطوير أول طريقة عالية الإنتاجية للمراقبة المتزامنة لبروتين الثيول والثيول غير البروتيني والثيول الكلي في الخلايا في لوحة 96 بئر على قارئ صفيحة مضان في λالسابق = 430 نانومتر و λم = 520 نانومتر ، على التوالي. الطريقة سريعة وحساسة ، وقد تم التحقق من صحتها بواسطة طريقة اختبار HPLC thiol. يمكن لهذه الطريقة الكشف عن الثيول بتركيزات خلوية منخفضة تصل إلى 500 خلية / بئر. أظهرنا أيضًا أن الطريقة يمكنها بسهولة مراقبة التغيرات في مستويات الثيول الخلوية. على الرغم من أن الطريقة لا يمكن أن توفر تقديرًا كميًا مطلقًا للثيول نظرًا لتباين شدة التألق لعروض الثيول المختلفة ، إلا أنها توفر قياسًا دقيقًا للتقدير النسبي ، بالنسبة إلى عنصر التحكم. ستكون الطريقة أداة قيمة في البحوث الطبية الحيوية / الصيدلانية المتعلقة بالثيول.


المواد

كانت جميع الكواشف والمواد الكيميائية ذات درجة تحليلية أو أعلى. تم الحصول على كاشف Ellman ، (5،5 & rsquo-dithio-bis- (2-nitrobenzoic acid) ، 2-mercaptoethanesulfonic acid ، ملح الصوديوم (MES) والمواد الكيميائية الأخرى المستخدمة من VWR Chemicals (BDH Prolab) و Sigma Aldrich.

تم شراء هلام السيليكا ODS AQ (المنتج 12S50) من YMC Co. Ltd. كيوتو ، اليابان. Bio-Gel P2 من شركة Bio-Rad Laboratories Inc.

كانت جميع المذيبات المستخدمة ذات درجة تحليلية مقدمة من Sigma Aldrich أو Merck. كانت مذيبات HPLC من الدرجة Merck LiChroSolv. أوروبا شركة محدودة.

تم توفير أعمدة زجاجية كبيرة من قبل Soham Scientific ، Fordham ، Ely ، Cambs. ، UK

تم شراء LNCaP (خلايا سرطان البروستاتا البشرية الحساسة للأندروجين ، استنساخ FGC-ECACC رقم 89110211) وخلايا PNT2 (خط الخلايا الظهارية البشرية الطبيعية للبروستاتا والمخلود بفيروس SV40) من مختبرات الصحة العامة في إنجلترا (ECACC-HPA) في بورتون داون ، سالزبوري ، إنجلترا. نمت الخلايا لتلتقي في مصانع الخلايا في وسط يتكون من RPMI 1640 + 2 ملي مولار جلوتامين + 1 ملي بيروفات صوديوم تحتوي على 10٪ منطقة 2 FBS. أعطيت الخلايا المتكدسة حضانة لمدة ساعتين في وسط طازج قبل الحصاد عن طريق التربسين (Tryple Express). تم إجراء تعداد الخلايا على Nucleocounter NC3000 والخلايا التي تم جمعها عن طريق الطرد المركزي. تم تجميد كريات الخلايا الناتجة وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة.


نتائج

في هذا التقرير ، استخدمنا N-acetylcysteine ​​(NAC) وبروتين الأكسدة والاختزال المحتوي على الثيول ، Thioredoxin-1 البشري (Trx1) ، لاختبار ما إذا كان MB هو تفاعل مع الثيول ويعدل ثيولات البروتين تساهميًا. تظهر النتائج (الشكل 1 أ) أن تركيز الثيول الحر انخفض كدالة لتركيز MB مع خسارة كاملة عندما وصل MB: NAC إلى 2: 1. أظهر الفحص الحركي أن ثابت معدل الترتيب الثاني الظاهري كان 5.03 & # x000a0M -1 ثانية -1 (البيانات غير معروضة). قمنا بعد ذلك بفحص تفاعل MB مع بروتين ثيول باستخدام المؤتلف Trx1 كنموذج. يحتوي هذا البروتين على بقايا ثيول التي يمكن الوصول إليها بالمذيبات ولديها طيف من التفاعل وهي ضرورية لوظيفتها البيولوجية [12]. يُظهر الشكل 1 ب فقدانًا متكافئًا لبروتين ثيولز بسبب علاج MB. يحتوي Trx1 على 5 مخلفات Cys وفقدت إشارة البيوتين عند الحضانة مع MB: Trx1 بنسبة مولارية 5: 1 ، مما يشير إلى تعديل كامل للثيول (إما التقريب أو الأكسدة ، انظر أدناه). تم أيضًا فحص تفاعل MB مع الأمينات الأولية (الشكل 1 ج) باستخدام إجراء مشابه لتصور بروتين ثيولز. بعد حضانة MB ، تم تصنيف الأمينات الحرة وتصورها باستخدام sulfo-NHS-biotin & # x000a0 كما هو موضح في & # x000a0 الشكل 1 ب. توضح هذه النتائج أن MB لا يتفاعل مع الأمينات في ظل ظروف الفحص ، ويعدل بشكل تفضيلي ثيولات البروتين فقط. . تم فحص حركية التفاعل بنسبة تركيز 5: 1 باستخدام mPEG2طريقة البيوتين (الشكل 1 د). بالاتفاق مع بيانات تفاعل NAC ، تظهر نتائج هذه التجربة أن التفاعل بين MB و Trx1 بطيء نسبيًا ، ويقترب من التعديل الكامل لجميع Trx1 thiols عند 60 & # x000a0min.

Maneb (MB) هو مركب تفاعلي للثيول. (أ) تؤدي إضافة MB إلى N-acetylcysteine ​​إلى فقد محتوى thiol كما تم قياسه بواسطة كاشف Ellman. نتج عن Maneb بنسبة 2: 1 & # x000a0M خسارة شبه كاملة للثيول. (ب) باستخدام thioredoxin-1 (Trx1) كبروتين نموذجي ، يتسبب maneb stoichiometrically في فقدان بروتين thiols. بروتين ثيول المسمى بـ mPEG2-بيوتين ، وهو N-ethylmaleimide معالج بيوتينيل ، ويتم تصويره في تحليل لطخة غربية باستخدام الستربتافيدين المسمى الفلوريسنت. (C) MB لا يعدل الأمينات كما تم اكتشافه من خلال تفاعل الأمينات الحرة مع sulfo-NHS-biotin وتحليل اللطخة الغربية اللاحقة باستخدام الستربتافيدين المسمى الفلورسنت. (د) دورة زمنية توضح أن المانيب يسبب فقدان معظم الثيول الحر خلال 15 & # x0201330؟ min.

تم تقييم نشاط Trx1 لتحديد النتائج الوظيفية لتقريب MB. تم تحضين Trx1 لـ 1 & # x000a0h بـ MB (5: 1 ، على النحو الوارد أعلاه) ثم تمت تحليته لإزالة أي ميغابايت غير متفاعل قبل اختبار النشاط. تُظهر البيانات أن تعديل MB لـ Trx1 أبطأ أكسدة NADPH المعتمدة على Trx1 في وجود اختزال Trx بنسبة 43 ٪ (الشكل 2 أ و ب). على عكس هذه النتائج ، لم يُظهر تقليل الأنسولين المحفز بواسطة Trx1 بواسطة DTT أي تأثير على النشاط بسبب تعديل MB (البيانات غير معروضة). أشار التثبيط غير الكامل للنشاط على الرغم من وجود دليل على التعديل شبه الكامل للثيول إلى أن تعديل الثيول المعتمد على MB من المحتمل أن يكون قابلاً للعكس.

مانب يمنع نشاط thioredoxin-1 (Trx1). تم علاج Trx1 بمكافئات 5 & # x000a0M من maneb وتم قياس النشاط من حيث تقليل الأنسولين في وجود NADPH و thioredoxin reductase-1. كان انخفاض النشاط واضحًا في معدل أكسدة NADPH (A) والنشاط المحسوب (B). لم يُظهر الفحص باستخدام DTT كمختزل بدلاً من اختزال NADPH / thioredoxin تثبيط النشاط (غير موضح). يرتبط فقدان بروتين ثيول بتكوين ثيول Trx1 وعكسه بإضافة مادة مختزلة. يمكن لكل من DTT (C) المختزل و N-acetyl cysteine ​​(D) عكس فقدان ثيول البروتين بوساطة maneb.

لفحص قابلية الانعكاس ، تم احتضان Trx1 المعدل بـ MB بـ 1 & # x000a0mM DTT ، وتم فحص محتوى thiol باستخدام mPEG2-biotinylation والنشاف الغربي على النحو الوارد أعلاه. أظهرت النتائج أنه تمت استعادة النطاق المقابل لشكل الثيول غير المعدل لـ Trx1 (الشكل 2 ج). أظهرت المعايرة باستخدام NAC (زيادة نسبة NAC: MB من 0 إلى 13.3) أن زيادة NAC بمقدار 5 أضعاف كانت مطلوبة لاستعادة جميع الثيول (الشكل 2 د). لذلك ، تُظهر النتائج أن تعديل Trx1 بواسطة MB يمكن عكسه تمامًا عن طريق العلاج باستخدام الثيول.

أظهر علم البلورات بالأشعة السينية أن Trx1 المؤكسد يتبلور على هيئة دايمر يتكون من ثاني كبريتيد بين بقايا C73 [14]. لقد بحثنا في احتمال أن يتسبب علاج MB في تكوين ثنائى Trx1 عن طريق معالجة Trx1 بتركيزات متزايدة من MB ، والفصل عبر SDS-PAGE في ظل ظروف غير مختزلة والتصور باستخدام Coomassie blue (الشكل 3 أ). توضح البيانات أن MB تؤدي إلى ظهور نطاق عند 25 & # x000a0kD ، وهو ما يقابل ضعف الوزن الجزيئي لـ Trx1 ، مع ما يعادل 1 & # x000a0M ميغا بايت. تشير هذه النتيجة إلى أن بقايا Cys واحدة فقط متورطة في dimerization.

تتسبب معالجة MB Trx1 في تكوين ثنائي مائل يتم عكسه بواسطة DTT (A). يُظهر التحليل الطيفي الكتلي لـ Trx1 (B) و Trx1 المعدل بـ MB (C) تعديلًا واحدًا لـ MB (إضافة 210 وحدة كتلة تقابل إضافة الإيثيلين ثنائي ثنائي الكربونات (EBDTC)). تشير علامة النجمة (*) إلى ملف م/ض يتوافق مع إضافة Mn-Trx1 محتملة (+54.9).

نظرًا لملاحظة الارتباط المتقاطع للبروتين بوساطة MB ، أجرينا دراسات LC & # x02013MS على Trx1 سليم والمعالج بـ MB باستخدام ESI في وضع التأين الإيجابي والكشف باستخدام LTQ-Orbitrap-Velos (Thermo). أسفرت هذه التجارب عن اكتشاف Trx1 ومنتج واحد معدل (الشكل 3 ب وج). في العينة المعدلة بـ MB ، لاحظنا انخفاضًا كبيرًا في شدة ذروة Trx1 غير المعدلة (م / ض 11602) وقمة جديدة (م / ض 11،810) بسبب ارتباط إيثيلين ثنائي ثنائي الكاربامات (EBDTC) بـ Trx1 ، مما أدى إلى حدوث تحول جماعي قدره 210 وحدات كتلة من القمة غير المعدلة. تشير هذه النتيجة إلى أن بروميد الميثيل لا يسبب أكسدة بسيطة للثيول لثاني كبريتيد ولكنه يشارك في عمليات تفاعل أكثر تعقيدًا.


الملخص

يلعب البروتين التيروزين الفوسفاتيز (PTPs) دورًا مهمًا في تنظيم نقل إشارة الثدييات. أثناء بعض عمليات إرسال الإشارات الخلوية ، يؤدي توليد بيروكسيد الهيدروجين الداخلي إلى تثبيط نشاط PTPs المختارة عن طريق أكسدة مجموعة ثيولات السيستين التحفيزية للإنزيم. الأهم من ذلك ، أن الوزن الجزيئي المنخفض وثيول البروتين في الخلية لديهم القدرة على تجديد PTPs النشطة تحفيزيًا. قمنا هنا بفحص استعادة النشاط الحفاز من اثنين من PTPs المعطلين تأكسديًا (PTP1B و SHP-2) بواسطة ثيولات منخفضة الوزن الجزيئي وإنزيم ثيوردوكسين. جميع أحاديات الثيول التي تم فحصها أعادت توليد النشاط التحفيزي لـ PTP1B المؤكسد ، مع ثوابت معدل ظاهرة تباينت بعامل 8 تقريبًا.كأ كانت مجموعات الثيول فعالة بشكل خاص. قام الجلوتاثيون الثيول البيولوجي بإصلاح PTP1B المؤكسد مع ثابت واضح لمعدل الدرجة الثانية من 0.023 ± 0.004 M –1 s -1 ، بينما أظهر dithiol dithiothreitol (DTT) ثابتًا ظاهريًا لمعدل الدرجة الثانية 0.325 ± 0.007 M -1 ثانية - 1. قام إنزيم thioredoxin بتجديد النشاط التحفيزي لـ PTP1B المؤكسد بمعدل أسرع بكثير من DTT. قام Thioredoxin (2 ميكرومتر) بتحويل PTP1B المؤكسد إلى الشكل النشط مع معدل ثابت ملاحظ يبلغ 1.4 × 10 –3 ثانية -1. اتبعت المعدلات التي تجدد فيها هذه العوامل PTP1B المؤكسد الترتيب Trx & gt DTT & gt GSH والقيم المماثلة التي لوحظت عند 2 ميكرومتر Trx و 4 ملي مولار DTT و 60 ملي مولار من GSH. لم تقم ثاني كبريتيدات مختلفة هي منتجات ثانوية لعملية إعادة التنشيط بإلغاء تنشيط PTP1B الأصلي بتركيزات تتراوح من 1 إلى 20 ملي مولار. يعمل عامل الاختزال الكيميائي الحيوي المشترك tris (2-carboxyethyl) phosphine على تجديد النشاط الأنزيمي من PTP1B المؤكسد بشكل أسرع إلى حد ما من الكواشف القائمة على الثيول ، مع معدل ثابت يبلغ 1.5 ± 0.5 M -1 ثانية -1. لاحظنا الاختلافات الحركية العميقة بين التجديد المعتمد على الثيول للنشاط من PTP1B المؤكسد و SHP-2 ، مما يسلط الضوء على احتمالية الاختلافات الهيكلية في PTPs المؤكسدة المختلفة للعب دور مهم في المعدلات التي يكون فيها الثيول ذو الوزن الجزيئي المنخفض وثيول المحتوي على الثيول. تعيد الإنزيمات مثل thioredoxin و glutaredoxin النشاط التحفيزي إلى هذه الإنزيمات أثناء أحداث إشارات الخلية.


النتيجة والمناقشة

نعتقد اعتقادًا راسخًا أن تطوير المجسات الكيميائية القادرة على حبس SO2H بشكل انتقائي سيسمح بتوضيح واضح لدور بروتين sulfinylation. في هذا الصدد ، قمنا مؤخرًا بتطوير انتقائي كيميائي س حمض الأولفينيك ن إيتروسو إل إيصال (SNL). 16 إضافة SO2تُعرف مركبات H إلى C-nitroso منذ أكثر من قرن ، ومع ذلك ، فإن التقريب الناتج يكون قابلاً للتغير (الشكل S1). من أجل احتجاز هذه الأنواع غير المستقرة ، قمنا بدمج مركز محب للكهرباء (الشكل 1) في أورثو-موقع مشتق نيتروز-بنزين (1). الأوكسجين العابر (2) يتفاعل مع الإستر عن طريق الأسترة عبر الجزيئية لتشكيل benzisoxazolone مستقر (3). بناءً على عملنا على هذه الفكرة ، قمنا بتصنيع فئة من مركبات C-nitroso التي تُظهر تفاعلًا سريعًا مع وزن جزيئي منخفض SO2حاء - لا تتفاعل هذه الكواشف مع nucleophiles الأخرى ذات الصلة بيولوجيًا بصرف النظر عن thiols ، والتي ، مع ذلك ، لا تشكل مقاربات مستقرة (الشكل S2).

وضع العلامات الكيميائية الانتقائية لحمض السلفنيك مع مركبات أريل نيتروسو.

استخدام SNL لوصف أحماض كبريتات البروتين

بتشجيع من هذه النتائج ، وظفنا SNL لتطوير مجسات كيميائية للكشف عن كبريتات البروتين. بادئ ذي بدء ، اكتشفنا قدرة NO- فتاه (الشكل 2) ، مشتق C-nitroso الذي أظهر أفضل تفاعل ، لتعديل SO2H داخل متحولة مزدوجة (C64،82S) من ثيول بيروكسيديز Gpx3 من الخميرة. 17 في حضور ح2ا2، يشكل Gpx3 رابطة ثاني كبريتيد داخل الجزيئية من خلال السلفنيل للحفاز C36 ، متبوعًا بالتكثيف باستخدام C82 المحلول. يؤدي تحور C82 إلى سيرين إلى استقرار Cys36-SOH العابر ، مما يسمح بمزيد من التحكم في الأكسدة إلى SO2H (انظر المعلومات الداعمة).

تحقيقات Nitroso من أجل وضع العلامات الانتقائية لأحماض السلفينيك البروتينية.

حضانة NO- فتاه باستخدام C64،82S Gpx3-SO2H (22772 Da) ينتج عن إضافة السلفوناميد المتوقعة (22949 Da) كما أكده تحليل ESI-LC / MS (الشكل 3 أ). أظهرت تجاربنا الأولية مع الجزيئات الصغيرة أن الثيول يتفاعل مع مركبات C-nitroso لينتج معقد سلفيناميد غير مستقر ، والذي ينقسم بالتفاعل مع ثيول ثانٍ (الشكل S2). لتأكيد هذه النتائج باستخدام بروتين SH ، عالجنا C64،82S Gpx3 المخفّض بالكامل (22740 Da) باستخدام NO- فتاه، تليها الحضانة مع DTT. من المثير للدهشة أن ESI-LC / MS كشفت عن تشكيل معقد مستقر بكتلة 22935 دا (الشكل 3 ب). ألكلة بقايا Cys مع N-ethylmaleimide (NEM) ، على العكس من ذلك ، منعت تشكيل التقريب (الشكل 3C). حتى مع الأخذ في الاعتبار أن DTT لم يكن قادرًا على شق السلفيناميد المتكون من إضافة NO- فتاه بالنسبة لـ Cys36 ، فإن زيادة الكتلة المكتشفة (& # x00394m = 195) لا تتوافق مع التقريب المتوقع (& # x00394m = 177). بشكل عام ، تؤدي إضافة الثيول إلى مركب C-nitroso aryl إلى إنتاج semimercaptale غير مستقر ، والذي يمكن أن يتفاعل مع جزيء ثيول ثانٍ أو يخضع لإعادة الترتيب لتشكيل سلفيناميد أكثر استقرارًا (الشكل S3). 18 تحدث إعادة الترتيب العفوية عن طريق تفكك أنيون الهيدروكسيل وتشكيل وسيط أيون نيترينيوم كاتيوني ، والذي يتحلل لاحقًا بالماء. باتباع نفس المسار ، فإن إضافة NO-Ph إلى C64،82S Gpx3-SH ستشكل مقارب سلفيناميد مع زيادة كتلة قدرها 195 دا ، وهو ما يتوافق تمامًا مع ملاحظاتنا. تفضل البيئة الحمضية عادة إعادة ترتيب نصف مائل. مع NO- فتاه، ومع ذلك ، بمجرد إنشاء benzisoxazolone ، يبدو أن إعادة الترتيب تحدث حتى عند درجة الحموضة المحايدة ، ربما لأن مجموعة الكربوكسيل أكثر عرضة للانفصال عن ذرة النيتروجين أكثر من أنيون الهيدروكسيل (الشكل S4). قد يفسر تكوين السلفيناميد المعاد ترتيبه أيضًا سبب عدم تقليل التقريب بواسطة DTT. نظرًا لأن تكوين السلفيناميد لم يُلاحظ أبدًا مع ثيول الوزن الجزيئي المنخفض ، 16 فقد تساءلنا عن سبب حدوث إعادة الترتيب مع البروتين SH. لقد توقعنا أنه في مثل هذه الحالات ، يكون هجوم جزيء ثيول ثان على سلفيناميد العابر أسرع بشكل عام من إعادة ترتيب الأخير. بمجرد تكوين السلفيناميد ، سيتم منع هجوم Cys-SH الثاني باستخدام C64،82S Gpx3-SH بسبب العائق الفاصل. للتحقق من هذه الفرضية ، اختبرنا تفاعل NO- فتاه نحو C64S Gpx3 ، الذي يحتوي على كل من السيستين النشط والاختزال. كما هو متوقع ، احتضان C64S Gpx3 مع NO- فتاه روجت حصريًا لتشكيل ثاني كبريتيد الداخلي (الشكل ثلاثي الأبعاد). إن وجود Cys المحلول ، والذي يمكن أن يتفاعل بسهولة مع مادة السلفيناميد المتكونة مع Cys التحفيزية ، يمنع إعادة ترتيب الأخير. تشير هذه النتيجة إلى أن تكوين السلفيناميد المستقر وثاني كبريتيد يعكس مسارات تفاعل تنافسية تتأثر بالعوامل الحركية (الشكل S5). كدليل إضافي ، قمنا باحتضان 2-methyl 2-propanethiol مع وجود فائض من NO-Ph. في هذه الحالة ، توقعنا أنه نظرًا لأن التفاعل بين جزيئين من الثيول سيكون أكثر إعاقة بسبب العائق الفراغي ، فسيتم تسهيل إعادة ترتيب السلفيناميد. كما هو متوقع ، أظهرت تحليلات LC-MS تشكيل مقرب السلفيناميد المتوقع (الشكل S6).

أطياف ESI-LC / MS لـ (A) C64،82S Gpx3-SO2H و (B) C64،82S Gpx3-SH و (C) C64،82S Gpx3-S-NEM و (D) C64S Gpx3-SH قبل وبعد العلاج باستخدام NO-Ph. تم تحضين كل نموذج Gpx3 باستخدام NO-Ph (40 مكافئًا) لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة الغرفة في PBS pH 7.4.

كتلة انتقائية من بقايا السيستين الحرة

يبدو أن إعادة ترتيب السلفيناميد يحد من استخدام SNL للكشف عن كبريتات البروتين. كما تقترح التجربة مع NEM ، ومع ذلك ، يمكن استخدام حماية السيستين الحرة لمنع تكوين مقاربات غير قابلة للاختزال مع الثيول المعوق. في الواقع ، تتضمن العديد من الطرق الكيميائية لاكتشاف تعديلات معينة للثيول (على سبيل المثال ، الارتباط بالنتروزيل S) الحجب الانتقائي للثيولز المختزل. 19 يعتمد نجاح هذه المقايسات على انتقائية خطوة منع الثيول وكفاءة الكاشف & # x02019s في الحماية الكاملة للثيول الحر دون التفاعل المتبادل مع SO2ح. قمنا بتقييم تفاعل العديد من الكواشف المانعة للثيول تجاه C64،82S Gpx3-SO2H. عندما استخدمنا فائضًا كبيرًا من عوامل الألكلة الشائعة مثل NEM أو iodoacetamide (IAM) ، اكتشفت تحليلات ESI-LC / MS كميات صغيرة ولكنها مهمة من حمض السلفنيك المؤلكل (الشكلان S7A و S7B). على الرغم من أن هذه النتيجة قد تبدو غير متوقعة ، إلا أن رد فعل منخفض الوزن الجزيئي SO2تم الإبلاغ عن H مع متقبلات مايكل ومركبات كربونيل هالو. 20 على العكس من ذلك ، لم تظهر مركبات السلفهيدريل التفاعلية التي تعزز تكوينات ثنائي الكبريتيد المختلط ، مثل 2،2 & # x02032-ثنائي كبريتيد (DPS) و S-methyl methanethiosulfonate (MMTS) ، أي تفاعل تبادلي تجاه SO2H (الشكلان S7C و S7D). بعد ذلك ، قمنا بفحص ما إذا كانت حماية بقايا Cys المجانية مثل ثاني كبريتيدات كافية لمنع التفاعل المتبادل مع NO- فتاه. بعد C64S ، تم تحضين 82S Gpx3-SH مسبقًا باستخدام DPS (الشكل S8A) أو MMTS (الشكل S8B) ، تمت إزالة الفائض من الكواشف المانعة للثيول وتم تحضين البروتين باستخدام NO- فتاه. أكدت تحليلات ESI-LC / MS أن كلاً من DPS و MMTS منعت بشكل فعال تكوين معقد السلفيناميد مع البروتين المختزل.

تصميم وتوليف NO-Bio

بعد إثبات ذلك SNL يمكن استخدامها بكفاءة لوصف البروتين SO2H ، قمنا بتصميم وتصنيع لا بيو ( الشكل 2 ). يجمع المسبار الكيميائي الجديد بين الرأس الحربي C-nitroso (الأزرق) ومقبض البيوتين (البنفسجي) ، والذي يسمح باكتشاف بروتين sulfinylation في العينات البيولوجية. توليف لا بيو (الشكل S9) ، الموصوف بالتفصيل في المعلومات الداعمة ، يتضمن اقتران Biotin-PEG4-NHS المتاح تجاريًا مع رابط ثنائي ، N-tert-Butoxycarbonyl-1،6-hexanediamine. تم بعد ذلك شق المجموعة الأمينية المحمية بواسطة معالجة TFA ، وتم إقران الأمين الأولي الناتج مع N-succimidyl ester من NO-Ph لإنتاج NO-Bio ، والذي تمت تنقيته بواسطة HPLC ذو المرحلة العكسية.

تطوير نهج كيميائي للكشف عن حمض السلفنيك البروتيني

كما يوضح الشكل 4 أ ، يمكن اكتشاف كبريتات البروتين بشكل انتقائي بطريقة من خطوتين. في الأول ، يتم إدخال مركب سلفهيدريل التفاعلي (DPS أو MMTS) لمنع بقايا السيستئين الحرة بشكل انتقائي. بعد ذلك يتم معالجة العينة بمسبار علامة البيوتين ، لا بيو، لتسمية أحماض السلفنيك. اختبرنا هذا النهج باستخدام DJ-1 المؤتلف كنموذج. يحتوي البروتين المرتبط باركنسون & # x02019s على بقايا Cys محفوظة ، C106 ، وهي حساسة للغاية للإجهاد التأكسدي وتميل إلى تكوين SO2H مستقر. تظهر العديد من الدراسات أن DJ-1 يحمي الخلايا من موت الخلايا المبرمج التأكسدي بوساطة الإجهاد من خلال تكوين C106-SO2H. 21،22 بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي DJ-1 على اثنين من بقايا Cys المجانية الأخرى ، C46 و C53 ، وهي ليست نشطة الأكسدة والاختزال. على الرغم من أن C53 لا يتم تعديله بواسطة ROS ، إلا أنه لا يزال شديد التفاعل تجاه المواد الكهربائية. وفقًا لذلك ، يمثل DJ-1 نموذجًا ممتازًا لاختبار انتقائية استراتيجيتنا. تم تحضين WT DJ-1 المختزل أو المؤكسد باستخدام DPS ، متبوعًا بالمعالجة بـ لا بيو. كما هو مبين في الشكل 4 ب ، أكد التحليل الشامل بوضوح التعديل الانتقائي لـ DJ-1 المؤكسد فقط. ومن المثير للاهتمام ، أن DPS عزز تكوين ثنائي كبريتيد داخلي بين C46 و C53. لقد توقعنا أن تتفاعل DPS أولاً مع C53 شديد التعرض للمذيبات لإنتاج ثنائي كبريتيد مختلط. في وقت لاحق ، سيهاجم C46 المدفون بشكل أعمق نسبيًا ثاني كبريتيد نشط مع توليد لاحق لرابطة ثاني كبريتيد داخلية (الشكل S10). يمكن تحقيق الحماية الانتقائية لأنظمة Cys المجانية باستخدام MMTS أيضًا (الشكل S11). ومع ذلك ، تشير نتائجنا إلى أن MMTS يتفاعل مع الثيول بمعدل أبطأ نسبيًا من DPS. في الواقع ، تم اكتشاف كميات صغيرة من Cys-SO2H حتى في العينة المختزلة ، مما يشير إلى أن C106 قد تأكسد جزئيًا أثناء منع الثيول. على الرغم من أن إضافة EDTA في المخزن المؤقت منعت هذه الأكسدة غير المرغوب فيها ، فقد اخترنا استخدام DPS الأكثر كفاءة في جميع التجارب اللاحقة. يسمح مقبض البيوتين للمسبار بتصور البروتينات المسمى عن طريق نشاف الستربتافيدين. لذلك ، انتقائية لا بيو تم تأكيد وضع العلامات أيضًا من خلال تحليل لطخة ويسترن. تمت معالجة DJ-1 المختزل أو المؤكسد بـ DPS ، متبوعًا بالحضانة بـ لا بيو. تم إخضاع التفاعلات بعد ذلك لـ SDS-PAGE وتحليلها بواسطة نشاف الستربتافيدين. علاج المؤكسد DJ-1 مع لا بيو تم منح وسم البروتين الانتقائي ، بينما لم يتم اكتشاف DJ-1 على الإطلاق عن طريق النشاف الستربتافيدين في غياب المؤكسد ، مما يدل على خصوصية نهجنا الانتقائي الكيميائي (الشكل S12). لا بيو أظهر أيضًا حساسية أعلى مقارنةً بالجسم المضاد المتاح تجاريًا ضد فرط الأكسدة DJ-1 (الشكل S13) ، مما يسمح باكتشاف DJ-1 المكلور في تركيزات منخفضة نسبيًا.

وضع العلامات على حمض السلفنيك DJ-1 مع NO-Bio.

يمتلك DJ-1 بقايا G18 محفوظة للغاية ، مما يسهل تأين C106 ، ويقلل من pKأ، ويساعد على استقرار C106-SO2يمكن للتغييرات الصغيرة في هذا الوضع أن تؤثر بشكل كبير على الخواص المؤكسدة لـ C106. 24 على سبيل المثال ، متحولة E18D DJ-1 لديها ميل أقل لتشكيل SO2H ، لكن المسوخ E18N المشابه هيكليًا يُظهر ميلًا متزايدًا للأكسدة بفضل التثبيت القوي لـ C106-SO2H. قمنا بتقييم حساسية لا بيو، التحقيق في ميول الأكسدة المختلفة لطفرات DJ-1 المختلفة بما في ذلك C106S DJ-1 ، والتي لا تحتوي على سيستين نشط الأكسدة والاختزال. تم تعريض كل متغير DJ-1 (WT و E18N و E18D و C106S) لـ H.2ا2، وعولجت مع DPS ، وأخيراً حضنت مع لا بيو. كان تحليل اللطخة الغربية متسقًا مع النتائج المتوقعة (الشكل 4 ج). أظهر E18N DJ-1 نسبة أعلى من الكبريت ، حتى في حالة عدم وجود H.2ا2. على النقيض من ذلك ، كان مستوى الكبريتات للطفرة E18D المعرضة للإجهاد التأكسدي ضئيلًا تقريبًا. من الجدير بالذكر أن C106S DJ-1 تعامل مع H.2ا2 لم يتم اكتشافه عن طريق النشاف الستربتافيدين ، مما يؤكد أن C106 فقط هو القادر على تكوين SO2H تحت ظروف أكسدة معتدلة نسبيًا.

يكتشف NO-Bio البروتينات المعدلة بحمض السلفينيك في محلول الخلية

بعد إثبات خصوصية وحساسية نهجنا المكون من خطوتين في محاليل البروتين المتجانسة ، قمنا بعد ذلك بالتحقيق فيما إذا كان لا بيو يمكن الكشف عن بروتين SO2H في محللة خلية معقدة وغير مجزأة. تحقيقًا لهذه الغاية ، اختبرنا كيمياءنا المحسّنة في مستخلص خلية سرطان عنق الرحم البشري بالكامل (هيلا) ، والذي تم الحصول عليه عن طريق تحليل الخلايا في محلول RIPA معدّل يحتوي على Catalase و DTT. يمنع المخزن المؤقت للتحلل المزيد من أكسدة SO2H ويحافظ على Cys الحرة في الشكل المختزل ، وتجنب المبالغة في تقدير نسبة السلفينيل بالبروتين. يوضح الشكل 5 أ لطخة غربية HRP-streptavidin ، مما يشير إلى وجود مستويات قوية من البروتين SO2يمكن الكشف عن H في ظل الظروف العادية. لإثبات أن DPS احتجز جميع الثيول الحر بكفاءة وبالتالي أن لطخة الستربتافيدين كشفت فقط عن بروتينات كبريتات ، استخدمنا iodoacetyl-PEG2-biotin (IAM-Bio). الكاشف المعالج بالبيوتين قادر على ألكلة الثيول مثل بقايا السيستئين الحر. ألغت المعالجة المسبقة للعينة باستخدام DPS تمامًا الإشارة المعتمدة على IAM-Bio (الشكل 5 أ ، الخط 3) ، والتي أثبتت بشكل غير مباشر ذلك لا بيو يتفاعل فقط مع البروتين SO2بعد ذلك ، حددنا ما إذا كان نهجنا الكيميائي يمكن أن يكتشف الزيادات في كبريتات البروتين في ثقافة الخلايا البشرية. تم تحضين خلايا هيلا بكميات متزايدة من H.2ا2 لمدة 15 دقيقة (تم اختيار هذه النقطة الزمنية بعد تجربة أولية تعتمد على الوقت & # x02013 الشكل S14A) ، lysed ، ثم تم تصنيفها كما هو موضح أعلاه. أظهر تحليل اللطخة الغربية أن مستوى كبريتات البروتين زاد بمقدار H.2ا2 بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل S14B). مجتمعة ، تؤكد هذه النتائج أن SO2H مستقر بدرجة كافية ليتم اكتشافه بنجاح في lysates الخلية ولا يتطلب ذلك في الجسم الحي وضع العلامات.

تفاعلية No-Bio في محللات الخلية - تم تحميل بروتين 5 & # x003bcg لكل حارة - (A). تحليل كبريتات البروتين في أنسجة ورم الرئة البشرية - 1 & # x003bcg بروتين محمل في كل حارة - (B). الأسطورة: T1-001-T1 السرطانة الغدية الحليمية T1-001-N1 الأنسجة الطبيعية المتطابقة T1-005-T1 الورم الحميد T1-005-N1 الأنسجة الطبيعية المتطابقة T1-013-T1 سرطان الخلايا الغدية الحرشفية T1-013-N1 المتطابقة مع الأنسجة الطبيعية.

مستويات كبريتات البروتين في سرطان الرئة البشري

من أجل إظهار أن طريقتنا يمكن تطبيقها على أسئلة بيولوجية أكثر تعقيدًا ، أجرينا التنميط المقارن لحمض السلفينيك في أنسجة ورم الرئة البشرية. بالنسبة لهذه التجارب ، تميز بروتين السلفينيل بتحليل اللطخة الغربية لمحلول الخلية الكاملة. أظهرت نتائجنا وجودًا متغيرًا للغاية لـ SO2ح بين عينات الأنسجة الورم المريض الثلاثة (الشكل 5 ب). أظهرت جميع أنسجة الورم الثلاثة (الورم الحميد الحليمي ، والسرطان الغدي ، وسرطان الخلايا الحرشفية الغدية) زيادة كبيرة في مدى انتشار SO2تعديلات H مقابل الأنسجة الطبيعية المتطابقة. على الرغم من أن عدد العينات كان صغيرًا جدًا بحيث لا يمكن استخلاص استنتاجات عامة ، إلا أن هذه الملاحظات الأولية تشير إلى مستويات مرتفعة من SO2يمكن استخدام H كعلامة للسرطان.


الأكسدة والاختزال في الأركيا

This is a valuable review that brings together a range of information concerning the biochemistry of thiols and their distribution in prokaryotes, with particular emphasis on Archaea. The review is well organised and written, except for some very minor edits as suggested below

  • Be consistent with gamma-glutamylcysteine abbreviation throughout
  • p.11, l. 352 unclear sentence
  • p.12, l. 364 add UDP in Appendix A
  • p.12, l. 391 closing round bracket missing

Comments and Suggestions for Authors

This is a valuable review that brings together a range of information concerning the biochemistry of thiols and their distribution in prokaryotes, with particular emphasis on Archaea. The review is well organised and written, except for some very minor edits as suggested below

Be consistent with gamma-glutamylcysteine abbreviation throughout

Response: We now use &gammaGC consistently throughout the manuscript. We no longer alternate with &gamma-GC.

p.11, l. 352 unclear sentence

Response: We corrected the sentence with stating cysteine instead of CoA. This correction now clarifies the sentence.

p.12, l. 364 add UDP in Appendix A

Response: UDP is now defined in Appendix A.

p.12, l. 391 closing round bracket missing

Response: The closing round bracket is now added.

Manuscript antioxidants-775988 by Rawat and Maupin-Furlow

For the domains of Eukarya and Bacteria various studies of low molecular weight (LMW) thiols have been published in the past, leading to a better understanding of the role and biochemistry of LMW thiols in these organism groups. Therefore, it is known that LMW thiols play important roles such as regulating the redox homeostasis inside cells or as cofactors. However, for Archaea not much is known about the role and presence of LMW thiols until now. This manuscript gives an overview on the state of art of LMW thiols in Archaea. The authors summarize the distribution of currently known LMW thiol classes in archaea and the role and biochemistry of single molecules. The article is well structured and supported by well-designed figures.

The only issue I have in terms of content is that I missed somewhat a small paragraph on thioredoxins in Archaea. Specifically for the methanogens, some literature is available. The authors could easily integrate it into paragraph 3.2 or split this paragraph.

  1. 67 Transition between the two sentences is missing/not fluent: &lsquo&hellipare found in domestic animals or humans [25]. Variations of GSH exist&hellip&rsquo please rewrite
  2. 276-276 to me this sentence sounds like DTNB reduces the -SH groups of present LMW thiols: &lsquo&hellipusing DTNB, which would reduce all -SH groups&hellip&rsquo, the -SH groups represent the reduced form, to my knowledge DTNB itself gets reduced whereas the LMW thiols gets oxidized by forming a mixed disulfide please clarify what is meant here
  3. 311-312 not the protein is induced but the expression of ohrA
  4. 332-333 transition between the two paragraphs is missing/not fluent please rewrite
  5. 334 the Fiege and Frankenberg-Dinkel article showed that RdmS is not a histidine kinase but a tyrosine kinase
  6. 371-375 sentence difficult to follow and understand, or is there meant to be a period instead of a comma in l. 374 &lsquo&hellip[121,122], Mtr,&hellip&rsquoMtr please rewrite

Inconsistent usage of &lsquoArchaea&rsquo and &lsquoarchaea&rsquo, not clear to me why sometimes with capital letter and sometimes not, e.g. l.127 &lsquoArchaea and bacteria&rsquo. Might be used to differ between the domain Archaea and archaea as organisms in general.

  1. 30 such as
  2. 38 the canonical pathway
  3. 76 auto-oxidation
  4. 107 Either &lsquoThe InterPro database&rsquo or omit &lsquoThe&rsquo
  5. 109 Consistent naming of citations in running text, either &lsquo&&rsquo or &lsquoand&rsquo between names of authors
  6. 140 &lsquobased on&rsquo instead of &lsquobased in&rsquo
  7. 187 is there an &lsquoas&rsquo missing: &lsquocan also act as a&rsquo?
  8. 202 &lsquoinsulin&rsquo instead of &lsquoinulin&rsquo
  9. 210 InterPro
  10. 266 &lsquosequences&rsquo
  11. 275 introduction of the abbreviation &lsquoDTNB&rsquo is missing
  12. 281 introduction of the abbreviations &lsquoDHA&rsquo and &lsquoHED&rsquo are missing
  13. 322 introduction of the abbreviation &lsquoDTT&rsquo is missing
  14. 333 correct citation name
  15. 358 &lsquothan&rsquo instead of &lsquothat&rsquo
  16. 359 &lsquoeven at&rsquo instead of &lsquoat even&rsquo
  17. 387 &lsquoto involve to&rsquo?
  18. 390-391 &lsquoan archaeal&rsquo
  19. 411 better: &lsquosome archaeal species&rsquo

Fig. 2 grey boxes: shade of gray somewhat darker for better contrast

Fig. 3, legend: please add the explanation of FTR with iron-sulfur cluster

For the domains of Eukarya and Bacteria various studies of low molecular weight (LMW) thiols have been published in the past, leading to a better understanding of the role and biochemistry of LMW thiols in these organism groups. Therefore, it is known that LMW thiols play important roles such as regulating the redox homeostasis inside cells or as cofactors. However, for Archaea not much is known about the role and presence of LMW thiols until now. This manuscript gives an overview on the state of art of LMW thiols in Archaea. The authors summarize the distribution of currently known LMW thiol classes in archaea and the role and biochemistry of single molecules. The article is well structured and supported by well-designed figures.

The only issue I have in terms of content is that I missed somewhat a small paragraph on thioredoxins in Archaea. Specifically for the methanogens, some literature is available. The authors could easily integrate it into paragraph 3.2 or split this paragraph.

Response: Thanks, we have altered this section of the manuscript to enhance organization and highlight the insight provided on thioredoxins in Archaea including reference to methanogens.

67 Transition between the two sentences is missing/not fluent: &lsquo&hellipare found in domestic animals or humans [25]. Variations of GSH exist&hellip&rsquo please rewrite

Response: Thanks, we have rewritten these sentences to emphasis the theme of this section is focused on GSH synthesis.

276-276 to me this sentence sounds like DTNB reduces the -SH groups of present LMW thiols: &lsquo&hellipusing DTNB, which would reduce all -SH groups&hellip&rsquo, the -SH groups represent the reduced form, to my knowledge DTNB itself gets reduced whereas the LMW thiols gets oxidized by forming a mixed disulfide please clarify what is meant here

Response: we now state that DTNB would presumably oxidize all of the &ndashSH groups.

311-312 not the protein is induced but the expression of ohrA

Response: we now state that it [leads to the induction of expression of the gene encoding OhrA]

332-333 transition between the two paragraphs is missing/not fluent please rewrite

Response: transition now added.

334 the Fiege and Frankenberg-Dinkel article showed that RdmS is not a histidine kinase but a tyrosine kinase

Response: this point is now corrected.

371-375 sentence difficult to follow and understand, or is there meant to be a period instead of a comma in l. 374 &lsquo&hellip[121,122], Mtr,&hellip&rsquoMtr please rewrite

Response: we have reorganized this paragraph to more clearly explain this section of the manuscript.

Inconsistent usage of &lsquoArchaea&rsquo and &lsquoarchaea&rsquo, not clear to me why sometimes with capital letter and sometimes not, e.g. l.127 &lsquoArchaea and bacteria&rsquo. Might be used to differ between the domain Archaea and archaea as organisms in general.

Response: we now consistently use archaea in a general manner - since we do not specifically state العتيقة domain in the text.

Response: corrected to autoxidation.

107 Either &lsquoThe InterPro database&rsquo or omit &lsquoThe&rsquo

109 Consistent naming of citations in running text, either &lsquo&&rsquo or &lsquoand&rsquo between names of authors

Response: corrected to all &lsquoand&rsquo.

140 &lsquobased on&rsquo instead of &lsquobased in&rsquo

187 is there an &lsquoas&rsquo missing: &lsquocan also act as a&rsquo?

Response: corrected all Interpro to InterPro.

275 introduction of the abbreviation &lsquoDTNB&rsquo is missing

Response: Ellman's reagent [(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) or DTNB)] is now defined.

281 introduction of the abbreviations &lsquoDHA&rsquo and &lsquoHED&rsquo are missing

Response: Docosahexaenoic acid (DHA) and bis(2‐hydroxyethyl) disulfide (HED) are now defined.

322 introduction of the abbreviation &lsquoDTT&rsquo is missing

Response: dithiothreitol (DTT) is now defined.

333 correct citation name

Response: We were unclear what is meant by this point but have added that the information is related to the binding of MsvR to its own promoter to clarify which promoter is under discussion if this is what the reviewer meant.

line 333 is related to the following: Incubation of oxidized MsvR with the M. acetivorans thioredoxin system, consisting of NADPH, thioredoxin reductase and one of the 7 thioredoxins, leads to reduction of the cysteines and binding to its own promoter [105].

The citation references the work by the following which appears appropriate for the information presented:

Sheehan, R. McCarver, A.C. Isom, C.E. Karr, E.A. Lessner, D.J. The Methanosarcina acetivorans thioredoxin system activates DNA binding of the redox-sensitive transcriptional regulator MsvR. J Ind Microbiol Biotechnol 2015, 42, 965-969, doi:10.1007/s10295-015-1592-y.

359 &lsquoeven at&rsquo instead of &lsquoat even&rsquo

411 better: &lsquosome archaeal species&rsquo

Fig. 2 grey boxes: shade of gray somewhat darker for better contrast

Response: the shade of gray is now darker for better contrast.

Fig. 3, legend: please add the explanation of FTR with iron-sulfur cluster

Response: FTR/FDR added to legend with explanation and citation.

The review &ldquoRedox and thiol in Archaea&rdquo by Mamta Rawat and Julie A. Maupin- Furlow provides a clear and extensive panorama on a topic regarding Low molecular weigh (LMW) thiols of which up to now there has not been an updated overview. The detailed analysis of the different LMWs in the different kingdoms of life is well written and deepens biochemical pathways of the different LMWs. In the Archaea the role of LMW is still little known but this review has analyzed the different distribution of LMW thiols in this kingdom and has highlighted their possible function. Therefore, this manuscript could be worthy of publication. However, I have some points that, if addressed, would go a long way towards reducing my reservations and making this publication even better.

Plesae change &hellip&hellipdifferent LMW thiol, bacillithiol&hellip. in &hellip&hellip different LMW thiols, such as bacillithiol

I would like that the authors describe and comment the role of PDO not only in relationship to Sur but also as part of redox system involved in the regeneration of prx in S. sofataricus . PDO activity should be commented

The authors should include the following papers among references :

- Limauro D, D'Ambrosio K, Langella E, De Simone G, Galdi I, Pedone C, Pedone E, Bartolucci S. Exploring the catalytic mechanism of the first dimeric Bcp: Functional, structural and docking analyses of Bcp4 from Sulfolobus solfataricus. بيوكيمي. 2010 92(10):1435-44. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.006

- D'Ambrosio K, Limauro D, Pedone E, Galdi I, Pedone C, Bartolucci S, De Simone G.Insights into the catalytic mechanism of the Bcp family: functional and structural analysis of Bcp1 from Sulfolobus solfataricus. Proteins. 2009 76(4):995-1006. doi: 10.1002/prot.22408.

In these papers a new disulfide redox system that reduces peroxiredoxins in Saccharolobus solfataricus is described. The canonical system NADPH / Tr / Trx, generally used to reduce Prxs, in S. solfataricus is replaced by the NADPH / Tr / PDO to regenerate the bacterioferritin (Bcps) comigratory proteins.

Line 147 change glutaredoxin and thioredoxin to Grx and Trx respectively

Line 149 changes glutaredoxin to Grx

In Fig. 3 NTR could also be connected to Prx by Protein Disulfide Oxidoreductase (PDO) as reported in the previous comment. Also the legend must be completed inserting PDO of S. solfataricus

Line 163 Please change هالوباكتيريوم ساليناروم إلى H. salinarum

Line 167 Please change Pyrococcus furiosus إلى P. furiosus

Line 195: Sulfolobus solfataricus must be changed to Saccharolobus solfataricus, based on the update of the taxonomy within the Sulfolobaceae أسرة

Lane 205: Please change Pyrococcus horikoshii في P. horikoshii

Lane 288 Edit S. solataricus في S. solfataricus

Lane 298 Edit S. sulfotaricus في S. solfataricus

Lane 320 Insert the follow reference: Lipscomb, G.L. , Schut, G.J. Scott RA, Adams, M.W.W. SurR is a master regulator of the primary electron flow pathways in the order Thermococcales. Mol Microbiol 2017, 104, 869-881, doi: 10.1111/mmi.13668

Lane 347 Please Change Pyrococcus furiosus في P. furiosus و Sulfolobus solfataricus في S. solfataricus

Comments and Suggestions for Authors

The review &ldquoRedox and thiol in Archaea&rdquo by Mamta Rawat and Julie A. Maupin- Furlow provides a clear and extensive panorama on a topic regarding Low molecular weigh (LMW) thiols of which up to now there has not been an updated overview. The detailed analysis of the different LMWs in the different kingdoms of life is well written and deepens biochemical pathways of the different LMWs. In the Archaea the role of LMW is still little known but this review has analyzed the different distribution of LMW thiols in this kingdom and has highlighted their possible function. Therefore, this manuscript could be worthy of publication. However, I have some points that, if addressed, would go a long way towards reducing my reservations and making this publication even better.

Plesae change &hellip&hellipdifferent LMW thiol, bacillithiol&hellip. in &hellip&hellip different LMW thiols, such as bacillithiol

Response: we replaced the , with : to avoid confusion and clarify that bacillithiol is one example of a LMW thiol that differs from GSH.

I would like that the authors describe and comment the role of PDO not only in relationship to Sur but also as part of redox system involved in the regeneration of prx in S. sofataricus . PDO activity should be commented

The authors should include the following papers among references :

- Limauro D, D'Ambrosio K, Langella E, De Simone G, Galdi I, Pedone C, Pedone E, Bartolucci S. Exploring the catalytic mechanism of the first dimeric Bcp: Functional, structural and docking analyses of Bcp4 from Sulfolobus solfataricus. بيوكيمي. 2010 92(10):1435-44. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.006

- D'Ambrosio K, Limauro D, Pedone E, Galdi I, Pedone C, Bartolucci S, De Simone G.Insights into the catalytic mechanism of the Bcp family: functional and structural analysis of Bcp1 from Sulfolobus solfataricus. Proteins. 2009 76(4):995-1006. doi: 10.1002/prot.22408.

In these papers a new disulfide redox system that reduces peroxiredoxins in Saccharolobus solfataricus is described. The canonical system NADPH / Tr / Trx, generally used to reduce Prxs, in S. solfataricus is replaced by the NADPH / Tr / PDO to regenerate the bacterioferritin (Bcps) comigratory proteins.

In Fig. 3 NTR could also be connected to Prx by Protein Disulfide Oxidoreductase (PDO) as reported in the previous comment. Also the legend must be completed inserting PDO of S. solfataricus

Response: Thanks, we now include all of this information in the manuscript text in the section which discusses Prxs and the work performed in archaea. The references listed above and citations are now in the main body of the text.

Line 147 change glutaredoxin and thioredoxin to Grx and Trx respectively

Line 149 changes glutaredoxin to Grx

Response: We now use GRX and TRX throughout the manuscript.

Line 163 Please change هالوباكتيريوم ساليناروم إلى H. salinarum

Line 167 Please change Pyrococcus furiosus إلى P. furiosus

Line 195: Sulfolobus solfataricus must be changed to Saccharolobus solfataricus, based on the update of the taxonomy within the Sulfolobaceae أسرة

Lane 205: Please change Pyrococcus horikoshii في P. horikoshii

Lane 288 Edit S. solataricus في S. solfataricus

Lane 298 Edit S. sulfotaricus في S. solfataricus

Lane 347 Please Change Pyrococcus furiosus في P. furiosus و Sulfolobus solfataricus في S. solfataricus

Response: We have made all of these taxonomic changes and now use appropriate abbreviations.


شاهد الفيديو: رجيم البروتين. نهار جديد فالرجيم اطباق جديدة و سهلة و صحية و تساعدكم في نقص الوزن #régimesproteien (أغسطس 2022).