معلومة

كيف يمكنك استخدام القراءة كجزء من تصميم الدائرة الجينية؟

كيف يمكنك استخدام القراءة كجزء من تصميم الدائرة الجينية؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

تقليديا ، في البيولوجيا التركيبية ، حاول الباحثون تجنب بعض ظواهر النسخ (مثل حجب طرق المروجين الترادفي أو قراءة النهايات الضعيفة) لأنها لا تتماشى مع سعي التخصص لتصميم دوائر جينية رقمية معيارية. ومع ذلك ، بدأ بعض الباحثين في استخدام هذه "المشكلات" كجزء من التصميم المقصود (انظر Bordoy et al. ، على سبيل المثال).

كيف تعتقد أنه يمكن استخدام القراءة النصية كجزء من تصميم الدائرة الجينية؟ متى تريد الحصول على قراءة؟ ما نوع المنطق أو الوظيفة التي من شأنها أن تحاكي؟


تم استخدام Readthrough بالفعل لتنفيذ بوابات NOR النسخية ، حيث يعبر مروجو الإدخال الترادفي عن مثبط يقوم بقمع محفز الإخراج. (أول مرة أتذكرها هنا: 21150903 ، مستخدمة على نطاق واسع هنا: 27034378 ، حواجز على غرار هنا: 32141239.) ميزة هذا التصميم هي أن المكثف يحتاج فقط إلى ترميز الحمض النووي مرة واحدة ، مما يقلل بشكل كبير من أثر الحمض النووي للتصميم و احتمالية إعادة التركيب إذا كان تسلسل الحمض النووي للقمع طويلًا (على سبيل المثال ، مثبطات تعتمد على البروتين). وبالمثل تم تنفيذ بوابات OR كمروجين ترادفيين يعبران عن جين ناتج مشترك. (تصميم NOR البديل - وهو شائع مع المكابس مع تسلسل DNA قصير (على سبيل المثال ، sgRNAs) - هو تكرار المكبِط والتعبير عنه بشكل منفصل عن كل من معززات الإدخال. )

تم استخدام Readthrough أيضًا مع المحفزات المضادة للحساسية لضبط التعبير الجيني (انظر 26769567). في هذه التصميمات ، يجب أن يقرأ محفز المدخلات من خلال مروج عكسي متجه ، ويمكن استخدام قوة المروج المضاد لضبط استجابة محفز الإدخال.

هناك تطبيق آخر يتبادر إلى الذهن وهو ترميز النسبة النسبية للتعبير عن جينات متعددة عن طريق فصلها باستخدام عوامل إنهاء ضعيفة (على سبيل المثال ، لتحقيق تعبير X-fold للجين الأول بالنسبة إلى الثاني). يبدأ هذا في استحضار أوبرا ، كما تلاحظ jakebeal. أقرب مثال يمكنني التفكير فيه يأتي من هذه الورقة: 23727987 ، على الرغم من أنهم استخدموا بالفعل القراءة لمعالجة المشكلة العكسية لتوصيف قوة المنهي.


أعتقد أن هذا اقتراح مثير للاهتمام لمحاولة تحويل مشكلة إلى فائدة.

ما تفكر فيه مشابه من الناحية المفاهيمية لتنظيم الأوبرا ، حيث يتم التحكم في جينات متعددة بواسطة مروج واحد ، مع نقاط دخول متعددة لموقع ربط الريبوسوم (RBS) للترجمة ، ويمكن بالتأكيد أن تحدث القراءة في هذه الحالات أيضًا. من الناحية الهيكلية ، سيكون هذا هو نفس السلوك ، باستثناء أن نقاط الدخول عبارة عن مروجين بدلاً من RBS.

على المستوى المنطقي ، في الواقع ، ينتهي المروج الثاني بتنفيذ إحدى الوظيفتين:

  • إذا تم تنظيمه بشكل إيجابي ، فسيكون OR ، يتم تنشيطه إما عن طريق عامل النسخ الخاص به أو القراءة من التسلسل 5 '.
  • إذا تم تنظيمه بشكل سلبي ، فلن يكون ذلك ضمنيًا ، يتم تنشيطه بواسطة التسلسل 5 ، ولكنه يهيمن عليه القمع الخاص به ، حيث تميل آليات القمع الصارمة إلى منع القراءة أيضًا.

هناك الكثير من المخاوف المحتملة فيما يتعلق بقوة إشارة القراءة ، ولكن إذا أراد المرء الاستفادة من هذه الآلية ، فلا يوجد سبب للاعتقاد بأنهم لن يكونوا عرضة للهندسة.


متميز

يسلط الضوء

تعد CRISPR أداة مفيدة للغاية لعلماء الوراثة وعلماء الأحياء الدقيقة. باختصار للتكرارات العنقودية القصيرة المتناظرة المتباعدة بانتظام ، يبدو الأمر مخيفًا على أساس الاسم وحده. ومع ذلك ، فهي أداة تستخدمها آني تايلور - وهي طالبة في الفيزياء التطبيقية والهندسية في جامعة كورنيل - على نطاق واسع في أبحاثها. يُظهر ما تفعله باستخدام تقنية CRISPR بعضًا من قواها.

"يمكنني كتابة تسلسل نيوكليوتيد على جهاز الكمبيوتر الخاص بي ، وشراء جزء من الحمض النووي حسب الطلب لذلك التسلسل ، واستخدامه لبرمجة نظام كريسبر لاستهداف أي تسلسل DNA أريده بدقة عالية." هي شرحت. عند سماع كيفية استخدامها ، من السهل تخيل أن CRISPR كان لها تأثير هائل في الأبحاث البيولوجية ، مع تطبيقات في تخصصات فرعية لا حصر لها.

إنشاء دارات وراثية لتعمل مثل دوائر الحاسوب

تجري تايلور بحثها في مختبر Guillaume Lambert ، الفيزياء التطبيقية والهندسية ، والتي تركز على إنشاء دوائر وراثية في الخلايا ، وهو تطبيق لـ CRISPR في البيولوجيا التركيبية. تشبه الدوائر الجينية الدوائر المنطقية في الهندسة الكهربائية. تتكون الدوائر المنطقية من العديد من البوابات المنطقية التي تغير الجهد والتيار للنظام أثناء مروره عبرها. على غرار كيفية عمل أجهزة الكمبيوتر ، يمكن استخدام الدوائر الجينية في النهاية لأداء وظائف منطقية معقدة في الخلية.

تؤدي العديد من أنواع البوابات المنطقية وظائف متنوعة. يعمل تايلور على نوع معين من البوابة المنطقية المعروفة باسم بوابة NOT ، أو العاكس. يكون دخل البوابة بجهد عالٍ ، بينما يكون خرج البوابة بجهد منخفض (أو العكس). في الهندسة الكهربائية ، يتم تمثيل الجهد العالي بواحد ، بينما يمثل الجهد المنخفض صفرًا. واحد عند مدخل بوابة NOT سينتج صفرًا عند الإخراج. نفس الشيء صحيح بالعكس.

في الأنظمة البيولوجية ، لا يوجد جهد عالٍ أو جهد كهربائي منخفض. بدلاً من ذلك ، فإن الواحد والصفر يتوافقان مع تعبير البروتين المرتفع والمنخفض. يعني واحد أنه يتم التعبير عن بروتين معين ، بينما يعني الصفر أن البروتين غير نشط.

"في حين أن الأنظمة والتقنيات بيولوجية ، فإن الكثير من النظريات الأساسية لعملنا تدور حول الفيزياء."

في الخلية ، يمكن فحص تعبير البروتين بسهولة. يمكن إدخال جينات الواسمات مثل جين البروتين الفلوري الأخضر (GFP). ستتوهج الخلية التي تعبر عن GFP باللون الأخضر في الضوء فوق البنفسجي أو الضوء الأزرق ، لذلك يمكن للمرء أن يعرف ما إذا كان يتم التعبير عن GFP أم لا عن طريق تسليط الضوء الأزرق على المستعمرات. يقوم تايلور بإدخال هذه الجينات في الخلية عن طريق إدخالها في البلازميد ، وهي بنية تحمل المعلومات الجينية ، والتي يتم امتصاصها بعد ذلك ودمجها في الخلايا البكتيرية. والنتيجة النهائية هي مستعمرة من الخلايا التي تتوهج باللون الأخضر في الضوء الأزرق. ثم يستخدم تايلور نظام كريسبر لاستهداف جين GFP المُدرج.

كيف تعمل تقنية كريسبر

"نظام كريسبر ، في الطبيعة ، هو جهاز مناعة بكتيري. تحاول البكتيريا حماية نفسها من الفيروسات ، والتي هي أساسًا سلاسل من الحمض النووي الغريب. يجب أن يكونوا قادرين على التعرف على المعلومات الجينية الأجنبية والمعلومات الجينية الخاصة بهم ".

للقيام بذلك ، تنتج الخلايا البكتيرية بروتينات كاس ، التي ترتبط بتسلسل الحمض النووي الريبي الإرشادي. ثم يقوم بروتين كاس بفحص أي حمض نووي يصادفه. إذا تطابق أي تسلسل على الحمض النووي مع تسلسل الدليل RNA ، يتعرف بروتين Cas عليه على أنه DNA غريب ويدمره.

بروتين Cas الأكثر استخدامًا لتحرير الجينات ، Cas9 ، يعمل أصلاً على قطع الحمض النووي في المكان الذي يتطابق فيه مع تسلسل دليل RNA ، ولكن يمكن تعديل Cas9 بعدة طرق. على سبيل المثال ، غالبًا ما يستخدم مختبر لامبرت Cas9 الميت - المعروف باسم dCas9) - والذي تم تعديله بحيث يصبح غير نشط من الناحية التحفيزية. عندما يتعرف على تسلسل الحمض النووي ، بدلاً من قطع الحمض النووي ، يرتبط dCas9 بهذا التسلسل ويمنع النسخ. لا يتم شق تسلسل الحمض النووي المستهدف ولكنه يصبح غير قادر على التعبير عن البروتين الذي يرمز إليه.

تكمن قوة نظام CRISPR في حقيقة أنه يمكن تعديل تسلسل RNA الإرشادي المكون من 20 زوجًا والذي يرتبط به بروتين Cas9. إذا عرف المرء تسلسلًا حرجًا للحمض النووي على جين مهم ، فيمكنه إنشاء تسلسل توجيهي للحمض النووي الريبي المقابل الذي سيجعل بروتين Cas9 يستهدف تلك المنطقة من الحمض النووي. إذا كان بروتين dCas9 ، فسوف يرتبط بتسلسل الحمض النووي هذا ويمنع النسخ ، التعبير عن البروتين في ذلك الموقع.

يمكن أن تصمم تايلور تسلسلًا إرشاديًا للحمض النووي الريبي تعرف أنه سيتوافق مع تسلسل على أحد جينات الواسمات التي تدخلها. على سبيل المثال ، يمكنها إنشاء تسلسل من الحمض النووي الريبي يتوافق مع جزء مهم من جين GFP. قبل أن تقوم بإدخال تسلسل دليل الحمض النووي الريبي ، ستعبر الخلايا البكتيرية عن جين GFP. بعد ذلك ، عندما يرتبط dCas9 بتسلسل الحمض النووي الريبي ، ويتعرف على التسلسل المقابل على الحمض النووي ، ويقوم بإلغاء تنشيطه ، لن تقوم المستعمرات بعد الآن بإنتاج GFP ولن تتوهج بعد ذلك تحت الضوء فوق البنفسجي.

يوضح تايلور: "هناك مجموعة متنوعة من بروتينات كاس". "قد يكون لكل بروتين من بروتين Cas تراكيب مختلفة من الحمض النووي الريبي أو قد يعطل الجينات بطرق مختلفة. وبينما يمنع Cas9 الميت النسخ ، هناك طرق أخرى لتعديل بروتينات Cas لتنشيط الجينات. إنه يمنحنا التحكم في تحديد الجينات التي يتم التعبير عنها في الخلية والتي يتم تثبيطها ".

إنشاء دوائر الوراثة

يتمثل أحد أهداف مختبر لامبرت في استخدام هذا التحكم في التعبير الجيني لتوليد دائرة وراثية. إنهم يريدون تطوير نظام يمكنهم من خلاله إرسال مدخلات معينة ، ومعرفة كيفية تفاعل البوابات المنطقية في الخلية مع المدخلات ، والحصول على نتيجة يمكن التنبؤ بها.

ومع ذلك ، فإن الأنظمة الحية معقدة بشكل لا يصدق. قد يؤدي وجود عدة بوابات منطقية إلى تداخلها مع وظيفة بعضها البعض. يعمل مختبر لامبرت على فهم قيود النظام. كم عدد البوابات المنطقية التي يمكن إدخالها حتى يصبح سلوكها غير متوقع ومستقر؟ ما هي التأثيرات غير المستهدفة لنظام كريسبر؟

يقول تايلور: "إذا كان لديك جينوم يبلغ طوله الملايين أو المليارات من أزواج القواعد ، فقد يكون هناك العديد من المواقع التي سيستهدفها بروتين كاس بشكل غير مقصود ، لأنها تطابق تسلسل الحمض النووي الريبي الإرشادي المكون من 20 زوجًا بالصدفة". "قد يكون هذا كارثيًا للخلية ، أو قد تبدو الخلية غير متأثرة. يعتمد الأمر فقط على مكان وجود تلك التسلسلات غير المستهدفة وما ترمز إليه ".

اندماج الفيزياء والبيولوجيا

يقدر تايلور التقاطع بين العلوم ، وهو محور تركيز مختبر لامبرت. دخلت كورنيل مهتمة بهندسة الطيران ، لكنها وجدت في سنتها الأخيرة شغفًا بالجمع بين الفيزياء والبيولوجيا. تمكنت تايلور من تطبيق مقرراتها الدراسية على عملها في المختبر ، نظرًا لكونها طفيفة في العلوم البيولوجية.

تقول: "في حين أن الأنظمة والتقنيات بيولوجية ، فإن الكثير من النظريات الأساسية لعملنا تدور حول الفيزياء". تأمل في استخدام أدوات تعديل الجينات والتلاعب التي تعلمتها من خلال عملها مع مختبر لامبرت في أبحاثها المستقبلية.

يعد CRISPR اسمًا مخيفًا وأداة قوية ، وكما تعلمت تايلور من خلال عملها مع مختبر لامبرت ، فإن تطبيقاته في البحث العلمي منتشرة على نطاق واسع. لديها القدرة على تحويل المواقع الجينية إلى بوابات منطقية وخلايا إلى دوائر ، وتشغيل البروتينات أو إيقاف تشغيلها حسب الرغبة ، وإعلام معرفتنا المتنامية بكيفية عمل الخلايا - والحياة.


مقدمة

يستخدم علماء الأحياء التركيبية مناهج تصاعدية لتجميع الأجزاء الجينية في دوائر جينية أكثر تعقيدًا لتمكين برمجة وظائف جديدة في الخلايا. يجمع هذا النهج بين أجزاء التعبير الجيني الفردية ، أو الوحدات ، التي يمكن وصفها بشكل مستقل واستخدامها لبناء دوائر وراثية جديدة من خلال الجمع بين وحدات متعددة تتفاعل مع بعضها البعض لأداء وظيفة محددة في الخلايا. بدأت بداية علم الأحياء التركيبي بدائيات النوى الهندسية بوظائف جديدة [1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18] ، وسرعان ما تبع ذلك جهود هندسة خلايا الثدييات. ركزت البيولوجيا التركيبية للثدييات بشكل تقليدي على التنظيم النسخي وما بعد النسخ لخلايا البرنامج ذات الوظائف الجديدة. تتضمن هذه الجهود برمجة التغذية الراجعة [19،20،21] ، والتحكم في مستويات التعبير الجيني [22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32] ، وتنفيذ وظائف المنطق المنطقي [33 ، 34 ، 35،36،37،38،39] ، وتستهدف حالات مرضية معينة [40،41،42،43،44،45،46]. الأساليب الأحدث التي تستهدف مواقع محددة في الجينوم باستخدام بروتينات إصبع الزنك (ZF) ، ومؤثرات تشبه منشط النسخ (TALEs) ، وتكرارات متناظرة قصيرة متباعدة متباعدة (CRISPR) مقترنة ببروتين Cas9 معدل مع إزالة نشاط نوكلياز (dCas9) ) ، لاستجواب عوامل النسخ الذاتية [47،48،49،50،51،52،53،54،55،56]. لقد مكنت هذه الدراسات من استجواب تسلسل الحمض النووي الداخلي من أجل فهم أفضل لدور شبكات النسخ الطبيعية داخل الخلايا لفهم أفضل لكيفية سيطرة الخلايا على هذه الشبكات [57 ، 58]. تمت مراجعة تفاصيل هذه الأدوات الجينية على نطاق واسع في مكان آخر [59،60،61،62،63] ، لذلك ، نهدف هنا إلى توفير إطار لاستخدام الدوائر الجينية لتصميم علاجات جديدة عن طريق هندسة الأنسجة بوظائف بديلة.

الخلايا الجذعية متعددة القدرات هي الخلايا التي لديها القدرة على إنتاج أي خلية أو نسيج في الجسم.

في التطور المبكر للكائنات الحية المعقدة ، تخضع الخلايا الجذعية متعددة القدرات لاتخاذ قرارات متخصصة في عملية مرتبة بشكل ملحوظ لإنتاج أنماط الأنسجة ، والتشكل ، وتكوين الأعضاء [64،65،66،67،68]. الآليات الأساسية لعملية تحديد النسب هذه ليست مفهومة تمامًا. ومع ذلك ، فقد ظهرت مجموعات منسقة من عوامل النسخ ، أو شبكات الجينات ، كمنظمين رئيسيين لتعدد قدرات الخلايا الجذعية وتمايزها. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الدراسات أن عدم انتظام شبكات الجينات الطبيعية هذه يساهم في ظهور السرطان وتنكس الأنسجة ، وبالتالي تكمن وراء أنواع متعددة من الأمراض التي تصيب الإنسان.

يمكن للخلايا الجذعية بشكل طبيعي توجيه التزامها النسب من خلال التحكم في توقيت ومستوى التعبير عن عوامل النسخ الرئيسية مما يؤدي إلى مسارات التمايز المرغوبة [69]. تضمنت الأعمال السابقة لتلخيص تعبير عامل النسخ في الخلايا الجذعية لدفع التمايز إلى السلالات المرغوبة الإفراط في التعبير عن عوامل النسخ الرئيسية [70،71،72،73]. أظهرت هذه الدراسات تحسنًا في نتائج التمايز المرغوبة ، ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة غالبًا ما تنتج غلة غير فعالة للخلايا ، وتعتمد على اختيار التجمعات السكانية الفرعية ، وتولد أنواعًا غير متجانسة من الخلايا [74]. أدت هذه التحديات مؤخرًا إلى جهود من علماء الأحياء الاصطناعية لتنفيذ دوائر وراثية قادرة على التحكم الجيني المحكم الذي يوفر تعبيرًا مكانيًا وزمنيًا دقيقًا لعوامل النسخ الرئيسية في الخلايا الجذعية.

في هذه المراجعة ، نقدم إطارًا لتطبيق البيولوجيا التركيبية في الخلايا الجذعية لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية إلى السلالات المرغوبة. نقوم بتفصيل الدراسات التي نفذت الدوائر الجينية في الخلايا الجذعية ونناقش نتائج هذه الدراسات حول مدى قوة اتخاذ قرارات مصير الخلايا الجذعية. بعد ذلك ننظر في استخدام البيولوجيا التركيبية لتصميم أنسجة اصطناعية تتمتع بوظائف بديلة لتوفير علاجات جديدة للحالات المريضة.

الخلايا الجذعية والبيولوجيا التركيبية

تلعب الخلايا الجذعية دورًا مهمًا في تطوير وتجديد الأنسجة البشرية. تتحكم شبكة عالمية من عوامل النسخ الذاتية في مصير الخلية وترسل وتستجيب باستمرار للإشارات الفسيولوجية التي تضبط التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية. على سبيل المثال ، فإن الإفراط في التعبير عن عوامل النسخ الرئيسية Oct4 و Sox2 و Klf4 و c-Myc قادر على تجاوز خيارات مصير الخلية التي تم إجراؤها مسبقًا لتحويل أنواع الخلايا الجسدية إلى حالة متعددة القدرات [75،76،77،78،79،80 ، 81]. ومع ذلك ، فإن تمايز الخلايا السليفة متعددة القدرات إلى أنواع الخلايا البالغة يتطلب ديناميكيات التعبير الجيني المكاني والزماني الخاضعة للرقابة الصارمة لعوامل النسخ الرئيسية الخاصة بالنسب. يتضمن تمايز الخلايا الجذعية وتطور الأعضاء تنسيقًا معقدًا لكل من الإشارات الداخلية والخارجية التي تتحكم في سلوك الخلية. هذا التنسيق من الإشارات أمر بالغ الأهمية للخلايا الجذعية لاتخاذ قرارات المصير ولتطوير الأنسجة القوية.

تُبذل حاليًا جهود كبيرة لبرمجة الخلايا الجذعية ذات الدوائر الجينية لدفع تمايزها إلى السلالات المرغوبة. يُعتقد أن تنفيذ الدوائر الجينية للتحكم الديناميكي في التعبير الجيني (مثل تعبير عامل النسخ) في الخلايا الجذعية يحسن نتائج التمايز لأن هذه الدوائر قادرة على تكرار أنماط التعبير الجيني الديناميكي التي لوحظت أثناء التطور. في الآونة الأخيرة ، تم إنشاء دائرة وراثية جديدة تقارن الأجزاء الجينية من قالب ، نيوروسبورا كراسا ، ونظام المثبط البكتيري لاك لإنشاء مفتاح جيني متعامد لاستخدامه في خلايا الثدييات [27]. بعد التأكد من قابلية التوليف في خطوط الخلايا الخالدة لإثبات أداء المفهوم ، تم إظهار التحكم الجيني المحكم وقابلية ضبط التعبير الجيني لهذا المفتاح الجيني في الخلايا الجذعية متعددة القدرات. تشير هذه النتائج إلى أن علماء الأحياء الاصطناعية يمكنهم برمجة الخلايا الجذعية بقدرات اصطناعية على اتخاذ القرار يمكن استخدامها لتوجيه مصير الخلايا الجذعية إلى السلالات المرغوبة. على سبيل المثال ، باستخدام الدوائر الجينية التي تتحكم في مستوى وتوقيت التعبير عن عوامل النسخ المتعددة ، من الممكن ضبط منظمات مصير الخلايا الرئيسية عند نقاط تفتيش مختلفة للتمايز لدفع تمايز الخلايا الجذعية إلى واحد أو أكثر من مصائر الخلايا المرغوبة (الشكل 1). ).

أدوات في البيولوجيا التركيبية لدفع تمايز الخلايا الجذعية. تتيح الأدوات الجينية التي صنعها علماء الأحياء الاصطناعية تحكمًا صارمًا في التعبير الجيني الذي يسمح بالتحكم الديناميكي في تعبير عامل النسخ في الخلايا الجذعية. يتضمن ذلك مستويات مختلفة من التعبير (على سبيل المثال منخفضة ومتوسطة وعالية) ، بالإضافة إلى التحكم في مستويات التعبير في الأنماط الديناميكية بما في ذلك الضبط والنبض والتذبذبات وما إلى ذلك. مصير الخلايا الجذعية يحسن نتائج التمايز

لإثبات فائدة استخدام الدوائر الجينية لدفع عملية صنع القرار في الخلايا ، تم تصميم دائرة وراثية للاتصال ثنائي الاتجاه لتقليد أنماط التعبير الجيني الطبيعي أثناء تكوين الأوعية الدموية ، وتشكيل الأوعية الدموية [82]. كان الاتصال من خلية إلى أخرى هو إطار عمل هذه الشبكة التركيبية. على وجه التحديد ، تمت برمجة الخلايا المرسلة بدائرة جينية للتعبير بشكل أساسي عن سينسيز التربتوفان (TrpB 26) ، وهو إنزيم من بكتريا قولونية، والذي يحول الإندول (مركب في الوسائط) إلى L-tryptophan. قام المؤلفون أيضًا بهندسة خلايا المستقبل بدائرة جينية مصممة للسماح للخلايا باستشعار L-tryptophan المفرز ، واستجابة لذلك ، تشغيل التعبير عن الجين المراسل ، الفوسفاتيز القلوي المفرز (SEAP). بعد ذلك ، استخدم المؤلفون هذا النظام الهندسي للاتصالات الخلوية لتنفيذ تولد الأوعية المعزز. أثناء تكوّن الأوعية الطبيعي ، يعمل عاملا النسخ ، عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF) و angiopoietin-1 (Ang1) ، بطريقة متسلسلة ومنسقة لإنتاج أوعية دموية ناضجة [83]. في نظام الاتصال الخلوي الخلوي ، تمتلك كل من خلايا المرسل والمستقبل دوائر وراثية تولد جينات ناتجة يتم التعبير عنها في أوقات مختلفة ، لتوجيه التمايز الخلوي وإنتاج الأوعية الدموية. نظرًا للطول الصغير نسبيًا لانتشار العناصر الغذائية في الأنسجة ، فإن استراتيجيات تكوين الأوعية الدموية ، مثل تكوين الأوعية في الأنسجة حديثة التكوين ، ستكون حاسمة لنجاح الأنسجة المهندسة.

كما تم استخدام الدوائر الجينية لبرمجة الخلايا الجذعية بقدرات اتخاذ القرار التي تمكنها من إنتاج أعداد فعالة من خلايا بيتا (β). β الخلايا هي الخلايا الموجودة في البنكرياس التي تصنع وتفرز الأنسولين استجابة للجلوكوز في الدم بطريقة تعتمد على الجرعة. داء السكري من النوع الأول هو حالة مزمنة ينتج فيها البنكرياس القليل من الأنسولين أو لا ينتج عنه أي الأنسولين ، ويُعتقد أن السبب الرئيسي لمرض السكري من النوع الأول هو تدمير المناعة الذاتية لخلايا بيتا. يؤدي التدمير الناتج لهذه الخلايا إلى تقليل قدرة الجسم على الاستجابة لمستويات الجلوكوز ، مما يجعل من المستحيل تقريبًا تنظيم مستويات الجلوكوز في مجرى الدم بشكل صحيح. لتطوير علاجات بديلة لمرض السكري من النوع الأول ، ركز العلماء على إنتاج خلايا في المختبر من الخلايا الجذعية السلفية للبنكرياس عن طريق الإفراط في التعبير عن عوامل النسخ الثلاثة للمنظم الرئيسي ، Pdx1 و Ngn3 و Mafa. ينتج عن هذا النهج تمايز الخلايا الجذعية السلفية للبنكرياس إلى خلايا β ناضجة منتجة للأنسولين [76 ، 84]. في الآونة الأخيرة ، تم بناء دائرة وراثية تعمل كمرشح تمرير النطاق للتحكم ديناميكيًا في التعبير عن عوامل النسخ الثلاثة للمنظم الرئيسي [85]. مكنت هذه الدائرة الجينية من التنسيق في الوقت المناسب لعوامل النسخ الثلاثة ، والتي أنتجت مجموعة متجانسة من الخلايا التي أظهرت إنتاجًا قويًا للأنسولين على الخلايا المنتجة باستخدام عامل النمو التقليدي والتقنيات القائمة على المواد الكيميائية. تؤكد هذه الدراسة على الحاجة إلى التنظيم الزمني للتعبير الجيني أثناء قرارات مصير الخلية.

بالإضافة إلى التحكم في وقت تشغيل عوامل النسخ الرئيسية أثناء التمايز ، أظهرت دراسة حديثة أن بعض مسارات مصير الخلية تتطلب نبض التعبير عن عوامل النسخ الرئيسية [72]. في هذه الدراسة ، بدأ التعبير النابض لـ Gata6 في الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPS) في تكوين جميع الطبقات الجرثومية الثلاث مما أدى إلى تكوين نسيج متعدد الخلايا معقد ثلاثي الأبعاد ، أو عضوي ، أظهر برعم الكبد. مثل النمط الظاهري. بدون النبض ، تشكلت طبقة جرثومية واحدة فقط. تمكّن الدوائر الجينية من التحكم الدقيق في التعبير عن عوامل النسخ ، مما يشير إلى أن أنماط التعبير الجيني المحتملة التي يمكن تنفيذها باستخدام الدوائر الجينية لا حدود لها بشكل فعال. الأنماط بما في ذلك النبض والضبط والتذبذبات كلها في نطاق الاحتمالات. لذلك ، توفر الدوائر الجينية تحكمًا دقيقًا للغاية في التعبير الجيني ومصير الخلية الذي من المرجح أن يحول قابليتها للتطبيق في العلوم الأساسية والبحوث السريرية.

تكرار الوظائف الفسيولوجية في أنواع الخلايا البديلة

أدى التحكم الدقيق في كثافة ومدة وتوقيت التعبير الجيني إلى تطوير قدراتنا على توجيه مصير الخلايا الجذعية إلى السلالات المرغوبة ، بالإضافة إلى تطوير العضيات. باستخدام نفس الأدوات الجينية ، ابتكر علماء الأحياء التركيبية أيضًا خلايا علاجية قادرة على الاستشعار والاستجابة للإشارات المختلفة بطريقة علاجية [43،44،45، 86،87،88،89،90،91،92،93، 94،95،96،97،98،99،100،101،102،103،104]. على سبيل المثال ، في دراستين منفصلتين ، تم استخدام الدوائر الجينية لتنظيم مستويات الجلوكوز في مجرى الدم لدى الفئران المصابة بداء السكري. في الدراسة الأولى ، تم التحكم في إفراز وإفراز الببتيد الشبيه بالجلوكاجون 1 (GLP-1) ، وهو ببتيد لديه القدرة على خفض مستويات السكر في الدم عن طريق تعزيز إفراز الأنسولين [105] ، في الإنسان. الكلية الجنينية (HEK) 293 خلية باستخدام دائرة وراثية ذات تحكم في علم البصريات الوراثي [106]. سمحت هذه الدائرة الوراثية للخلايا المزروعة باكتشاف الضوء الأزرق ، واستجابة لذلك ، بدء نسخ GLP-1 ، مما تسبب في انخفاض مستويات الجلوكوز في الدم في الفئران المصابة بداء السكري. في الدراسة الثانية ، تم تصميم خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) بدائرة جينية تنتج الأنسولين استجابةً لانخفاض مستويات الأس الهيدروجيني. أظهرت هذه الدراسة التحكم في إنتاج الأنسولين عندما ينخفض ​​الرقم الهيدروجيني البيئي إلى ما دون النطاق الفسيولوجي [41]. عندما تم زرع هذه الخلايا المهندسة في الفئران المصابة بداء السكري ، تمكنت من استعادة مستويات الأنسولين والجلوكوز إلى نفس مستوى الفئران السليمة.

بالإضافة إلى هندسة الخلايا العلاجية لاضطرابات التمثيل الغذائي ، أظهرت دراسة حديثة استخدام دائرة وراثية لمنح خلايا HEK293 القدرة على التحكم في الاستجابة الالتهابية [107]. تتكون هذه الدائرة من ثلاث وحدات أساسية لاكتشاف الإشارات الالتهابية والاستجابة لها: جهاز استشعار لاستشعار الالتهاب يشير إلى مكبر للصوت مع ردود فعل إيجابية لضمان استدامة الاستجابة ومؤثر يحيد الاستجابة الالتهابية. تعتبر الخلايا العلاجية التي تتمتع بالقدرة على الحفاظ على استجابة الجسم الالتهابية تحت السيطرة تقدمًا مثيرًا في هذا المجال لأن هذه الأنواع من الخلايا يمكن زرعها بعد الجراحة لمنع الاستجابة الالتهابية المطولة من عرقلة قد يكون الشفاء مناسبًا والسماح بالتعافي. مستويات صحية من السيتوكينات الالتهابية.

الاتجاهات المستقبلية

حقق علماء الأحياء الاصطناعية في الثدييات خطوات كبيرة في هندسة أدوات وراثية جديدة لتنظيم التعبير الجيني بإحكام في أنواع الخلايا المختلفة. تم استخدام هذه الأدوات الجينية لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية لإنتاج سلالات خلوية مرغوبة ، ولصنع أشباه عضويات ، وهندسة الخلايا العلاجية لاستشعار المرض والاستجابة له. مع هذه الإنجازات تحت أحزمتنا ، من المنطقي أن علماء الأحياء الاصطناعية يمكنهم هندسة أنسجة صغيرة قابلة للزرع ، أو عضويات ، تم تصميمها لاستشعار المرض والاستجابة له.

بدلاً من محاولة إعادة إنشاء بنكرياس فاشل لمرضى السكري ، هل يمكننا هندسة الأنسجة الدهنية القابلة للزرع (الدهون) مع القدرة على تنظيم مستويات الجلوكوز في الدم؟ أظهرت الدراسات أنه يمكن حصاد دهون المريض وحقنها مرة أخرى في مفاصل الفرد للمساعدة في تخفيف آلام المفاصل [108]. في الواقع ، Lipogems هو نظام معتمد من FDA وهو عبارة عن أجزاء صغيرة من الدهون يتم إزالتها وغسلها وإعادة حقنها في مفاصل مختلفة لأولئك الذين يعانون من أمراض العمود الفقري أو آلام المفاصل أو التهاب المفاصل أو قطع الدوار [109،110،111،112]. يمكن للمرء أن يبدأ في تصوير الأنسجة الدهنية الاصطناعية المخصصة عن طريق صنع خلايا iPS أولاً من خلايا جلد المريض ، وبرمجتها بدوائر وراثية مختلفة: إحداها لدفع التمايز إلى الخلايا الدهنية ، والأخرى ببرنامج لتنظيم مستويات الجلوكوز في الدم ( الصورة 2). يمكن بعد ذلك حقن هذه الأنسجة الاصطناعية الصغيرة تحت الإبط ، أو في أماكن أخرى غير ملحوظة ، لتنظيم مستويات السكر في الدم على مدى فترات طويلة من الزمن. بالطبع ، بمجرد قبول فكرة الأنسجة الدهنية الاصطناعية القابلة للحقن ، يصبح من السهل تخيل هندسة الأعضاء الاصطناعية الأخرى (مثل الجلد) التي يمكن أن تعمل بطرق مختلفة لتحسين صحة الفرد.

الأنسجة الاصطناعية الهندسية لاستخدام الطب الشخصي. من المرجح أن تصبح هندسة الأنسجة الدهنية الاصطناعية لتنظيم مستويات الجلوكوز في الدم لدى مرضى السكري حقيقة واقعة في المستقبل القريب. في هذا العلاج الافتراضي ، تتم برمجة الخلايا الدهنية بدوائر وراثية قادرة على استشعار مستويات الجلوكوز ، وإذا تم استشعار مستويات عالية من الجلوكوز مبرمجة مسبقًا فسيولوجيًا ، فسوف تستجيب عن طريق إفراز كمية منظمة بإحكام من الأنسولين. يمكن زرع هذه الأنسجة الاصطناعية الصغيرة تحت الجلد في أماكن غير ملحوظة (على سبيل المثال في الإبط) ، لتنظيم مستويات الجلوكوز في الدم على مدى فترات طويلة من الزمن

تعتبر العضويات مجالًا آخر يمكن أن يكون لعلماء الأحياء الاصطناعية فيه تأثير كبير. على عكس الأنسجة المنقاة ، مثل الأنسجة الدهنية ، فإن العضيات هي نسخ مصغرة من عضو يمكن عزله من خلايا سلفية للأعضاء ، أو خلايا جذعية متعددة القدرات ، وتمييزها لتشكيل بنية شبيهة بالعضو. تمتلك هذه العضيات أنواعًا متعددة من الخلايا التي تنظم نفسها ذاتيًا لتكوين بنية مشابهة للعضو الموجود في الجسم الحي [113]. نظرًا لأن أنواع الخلايا المتعددة موجودة في العضيات ، فإن هذا يوفر فرصًا لهندسة تفاعلات أكثر تعقيدًا (مثل تكوين الأنماط الاصطناعية ، والتواصل المكاني والزمني بين أنواع الخلايا ، وما إلى ذلك) التي قد تكون مطلوبة لتلخيص الأعضاء الفاشلة التي لا يمكن استبدال وظيفتها بنسيج واحد . على سبيل المثال ، يمكن هندسة العضويات الاصطناعية باستخدام دوائر وراثية يمكنها محاكاة المسارات الصحية لتغيير الحالات المرضية الكامنة وإعادة توصيلها لاستعادة الحالة الصحية [114].


المتحدث الحيوي

كريس فويجت

حصل كريس فويجت على درجة البكالوريوس والرقم 8217 في الهندسة الكيميائية من جامعة ميتشيغان وعلى درجة الدكتوراه في الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية من معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا. كنا باحثًا ما بعد الدكتوراه في جامعة كاليفورنيا ، بيركلي ، ثم انضممنا إلى هيئة التدريس في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو. في عام 2011 ، التحق بالقسم & # 8230 مواصلة القراءة


الملخص

يمكن أن تؤدي تغييرات الإدخال المتعددة إلى اختلافات تبديل غير مرغوب فيها ، أو اخطاء، في إخراج الدوائر التوافقية الجينية. يمكن أن يكون لهذه الثغرات تأثيرات جذرية إذا تسبب ناتج الدائرة في تغييرات لا رجعة فيها داخل أو مع خلايا أخرى مثل سلسلة من الاستجابات ، أو موت الخلايا المبرمج ، أو إطلاق دواء في نسيج غير مستهدف. لذلك ، يمكن أن يكون تجنب الاختلاف غير المرغوب فيه في خرج الدائرة أمرًا حاسمًا للتشغيل الآمن للدائرة الجينية. تبحث هذه الورقة في أسباب اختلافات التبديل غير المرغوب فيها في الدوائر الجينية التوافقية باستخدام تحليل المخاطر ومولد نموذج ديناميكي جديد. يتم إجراء التحليل في دوائر وراثية تم بناؤها ونمذجة سابقًا مع سلوك خلل معروف. لا تتنبأ النماذج الديناميكية التي تم إنشاؤها بنفس الحالات الثابتة مثل النماذج السابقة فحسب ، بل يمكنها أيضًا التنبؤ بتغيرات التبديل غير المرغوب فيها التي تمت ملاحظتها تجريبياً. قد تتسبب تغييرات المدخلات المتعددة في حدوث خلل بسبب تأخيرات الانتشار داخل الدائرة. قد يؤدي تعديل تخطيط الدائرة لتغيير هذه التأخيرات إلى تغيير احتمالية حدوث بعض الثغرات ، ولكن لا يمكن القضاء على احتمال حدوث الخلل. بمعنى آخر ، لا يمكن القضاء على المخاطر الوظيفية. بدلاً من ذلك ، يجب تجنبها عن طريق تقييد تغييرات الإدخال المسموح بها على النظام. من ناحية أخرى ، يمكن تجنب المخاطر المنطقية باستخدام التوليف المنطقي الخالي من المخاطر. توضح هذه الورقة ذلك من خلال إظهار كيف يمكن إعادة تصميم دائرة مصممة باستخدام أداة أتمتة التصميم الجيني الشائعة للتخلص من المخاطر المنطقية.


كشف الباحثون عن مفاهيم جديدة لدارات الجينات الاصطناعية

يكشف بحث تيان ووانغ عن رؤى جديدة حول العلاقات المعقدة بين دوائر الجينات الاصطناعية والخلايا التي تستضيفها. الائتمان: Xiaojun Tian / ASU

تعمل الاكتشافات الحديثة التي قام بها فريقان بحثيان في كليات إيرا إيه فولتون للهندسة بجامعة ولاية أريزونا على تطوير مجال البيولوجيا التركيبية.

أجرى الأستاذ المساعد Xiaojun Tian والأستاذ المساعد Xiao Wang تعاونًا لمدة عام مع مجموعات المختبرات في كلية هندسة النظم البيولوجية والصحية ، وهي واحدة من مدارس Fulton الست. تم نشر نتائج بحثهم الجديد حول الطرق التي تتفاعل بها الدوائر الجينية المهندسة مع الخلايا البيولوجية المضيفة هذا الأسبوع في المجلة العلمية بيولوجيا الطبيعة الكيميائية.

تطبق البيولوجيا التركيبية طرقًا هندسية لتصميم شبكات بيولوجية جديدة أو إعادة تصميم جوانب الأنظمة البيولوجية الحالية. إنه مجال دراسي ناشئ بسرعة ، وقد تم إحراز العديد من التطورات المهمة خلال العشرين عامًا الماضية.

تضمن العمل المبكر إنشاء دوائر جينية اصطناعية ووضعها داخل خلايا مضيفة طبيعية.

يقول وانج: "لكن مفهوم الدائرة هنا مجرد فكرة مجردة". "Imagine a sequence of genetic segments in which the first one encodes or produces a particular protein. That protein, in turn, can either activate or inhibit the expression or protein production from another segment in the genetic sequence. If you keep expanding this idea, you can imagine it's like a network."

It is this chain of influence or inducement that is functioning as a circuit, rather than the physical connections within the genetic sequence. However, previous research has focused on just the behaviors of engineered genetic circuits themselves, with little attention to the background or context represented by host cells.

"It is hard to predict how these interactions affect the functions of the engineered genetic circuits," Tian says, "not to mention how to control them and make the circuits operate as desired within complicated, real-life environments."

Indeed, these synthetic gene circuits generally work only in a laboratory environment, not in more lifelike conditions. And this limitation greatly inhibits the application of engineered gene circuits in clinical settings.

Seeking to advance the field in that practical direction, the new research by Tian and Wang explored the relationship between the synthetic gene circuits and their host cells. Specifically, they examined the impact of "memory" circuits implanted within host cells, and the influence of gene circuit "topologies," or the architecture of interconnections among circuit components, in relation to host cell growth.

In the context of this work, the idea of memory relates to the continuation of influence or inducement within an engineered gene circuit even with the absence of a stimulus.

"Think about a light switch in your house," Wang says. "The light stays on even when you remove your finger from the switch. We refer to that persistent state as memory."

Tian and Wang's new research revealed that memory circuit topologies are significantly influenced by host cell behavior.

"We verified that influences are exchanged between the gene circuit and the host cell," Tian says. "That is, the circuit impacts the host cell, which in return has an impact on the circuit. It's like a loop.

"But we also demonstrated that the impact on a circuit's functionality is dependent on its topology," he says. "So, one circuit topology shows better performance than others within a dynamic host environment."

Their discovery relating circuit topology to a host cell's impact on circuit function is a first in the field of synthetic biology, and it expands meaningful scientific understanding of these complex interactions.

"It paves the way for building robust, engineered gene circuits," Tian says. "These could one day enhance interventions against the metastasis of cancer, for example, by slowing the ability of cancer cells to translate their development."

Progressing from the research that Tian and Wang have published includes examining the impact of adding additional synthetic gene circuits or modules into host cells, which substantially elevates the level of complexity as modules compete for resources within the cellular system.

Wang says that the School of Biological and Health Systems Engineering within the Fulton Schools is particularly well-placed for discoveries in synthetic biology.

"We have a critical mass of dedicated people who are strategically invested in advancing this area of research for the long term," he says. "So, we are seeking to be a leader in this field."


Synthetic biology, genetic engineering and you: Two-component signaling pathways as elements in synthetic circuit design

Schematics of native and transplanted two-component signaling pathways. (A) The native pathway consists of a receptor histidine kinase protein, which senses and propagates the signal to a cognate response regulator that regulates gene expression. (B) The envisioned adaptation to the mammalian host. Subscript “hum” indicates human-optimized codon sequence. DNAB, DNA binding. Pconst, constitutive mammalian promoter. P, phosphate Pmin, minimal mammalian promoter VP16, VP16 transactivator domain. Credit: Hansen J et al. (2014) Transplantation of prokaryotic two-component signaling pathways into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 111 (44):15705-15710.

(Phys.org) —Two of the most exciting areas of science and technology, synthetic biology and genetic engineering, have just taken a step towards a brave new future in which large-scale synthetic biological circuits composed of bioengineered logic gates, orthogonal to (that is, independent of) the host in which they operate, will enable a range of applications that include biosensors, gene expression control, cell motility, programmable gene circuits for cell physiology control, and other sophisticated gene circuits. This capability is based on the use of two-component regulatory system – basic stimulus-response coupling mechanisms that allow organisms to sense and respond to changes in many different environmental conditions. These systems consist of a membrane-bound histidine kinase that senses a specific environmental stimulus and a corresponding response regulator that mediates the cellular response, primarily through differential expression of target genes. ((A histidine kinase, or HK, is a multifunctional, typically transmembrane, protein involved in signal transduction across the cellular membrane a response regulator, or RR, protein is the second component in two-component signal transduction systems.)

A particularly promising type of two-component regulatory system – two-component signaling pathways – are the prevalent signal processing modality in prokaryotes and are also found in low eukaryotes and plants, but absent from vertebrate cells. Recently, scientists in the Department of Biosystems Science and Engineering at Eidgenössische Technische Hochschule Zürich (ETH Zurich, or Swiss Federal Institute of Technology Zurich), Basel, Switzerland transplanted two-component pathways into a mammalian host, demonstrating that these pathways could be partially reconstituted in mammalian cell culture and used for programmable control of gene expression. They found that the core biochemical processes are maintained, and while the capacity to sense chemical ligands is diminished or obscured and the preservation of basic biochemical processes during mammalian pathway transplantation is not guaranteed, they were able to use the pathways for multi-input gene regulation and show that they can be used as building blocks for gene expression control in mammalian cells, thereby creating new investigative possibilities in synthetic circuit design.

Prof. Dr. Yaakov (Kobi) Benenson discussed the paper that he, graduate student Jonathan Hansen and their co-authors published in وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم. "The key step was to think about this possibility," Benenson tells Phys.org. "The idea occurred to me in the year 2007, when I was a Bauer Fellow at the Harvard FAS Center for Systems Biology. Michael Laub 1,2 , at the time also a Bauer fellow, worked on two-component signaling pathways in prokaryotes. I was exposed to this area through his research, and discussed with him the possibility of implementing these pathways in human cells." It was several years before Benenson and his group members started the project in their new lab at ETH Zurich. "The practical challenge to investigating whether the elements of prokaryotic two-component pathways are operational in mammalian cells was to first read a large volume of papers to identify the candidate pathways for trans-kingdom transplantation, and then to redesign them such that operation in mammalian cells was possible." The scientists built on their experience with mammalian gene circuit design to make a few informed decisions that turned out to be correct.

Benenson lists several other challenges the researchers faced, the first being using the pathways for multi-input gene regulation and showing that they can serve as a rich source of orthogonal building blocks for gene expression control in mammalian cells. The two challenges here, he notes, was to ensure that there was no crosstalk between the transplanted components, and that the observed prokaryote behavior is recapitulated in mammalian cells. Secondly, he continues, was implementing two-input logical AND-like gene regulation in mammalian cells. "Here in particular," Benenson says, "the challenge was the pathway's high sensitivity to low expression levels of the histidine kinase receptor. This made it difficult to achieve a low إيقاف state."

The third issue Benenson describes was based on implementing the three conditions – preserving pathway internal operations, pathway components being orthogonal to the host, and host to pathway components – needed to preserve basic biochemical processes during mammalian transplantation. "Given the vast differences in just about any aspect of biological processes between the two hosts, there was no guarantee that the processes occurring in bacteria would take place in mammalian cells," Benenson explains.

Logic with TCS. (A) NOR-gate circuit schematics comprising antibiotic-regulated HK and RR genes. (B) Quantitative data for antibiotic-regulated NarXL pathway. (C) Quantitative data for antibiotic-regulated DcuSR pathway. PI and ET are at 10 μg/mL and 4 μg/mL, respectively. Plasmid composition and output values are in SI Appendix, Tables S13 and S14. (D) (Top) Schematic representation of an OR gate between NarX and NarQ. (Bottom) Quantitative data and representative images. Plasmid composition and output values are in SI Appendix, Tables S15 and S16. In all panels the images are shown with red pseudocolor indicating DsRed Transfection marker, and cyan pseudocolor indicating AmCyan output. The resultant data are presented as mean ± SD of biological triplicates. Credit: Hansen J et al. (2014) Transplantation of prokaryotic two-component signaling pathways into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 111 (44):15705-15710.

The scientists addressed these challenges though a number of insights and innovations. "One approach was to perform accurate trans-kingdom transplantation by codon optimization and placing the expression of the pathway genes under mammalian promoters," Benenson recounts. (أ كودون is a sequence of three nucleotides that together form a unit of genetic code in a DNA or RNA molecule.) "Another key innovation was the development of the regulated promoter controlled by the phosphorylated response regulators, where we used a novel minimal core promoter sequence developed in our lab as well as experimenting with the number of binding site repeats upstream of this core promoter – and it turned out that having two or more binding sites is essential for strong induction." Benenson adds that research 3,4,5 about synthetic two-component signaling in plants published by the June Medford Lab was valuable resource – especially in clarifying the role of nuclear localization signals. (A nuclear localization signal, or NLS, is an amino acid sequence that tags a protein for import into the cell nucleus by nuclear transport.)

Benenson discussed several key aspects of the study detailed in their paper, the first being the finding that in mammalian cells, core prokaryotic two-component biochemical processes are maintained but the capacity to sense chemical ligands is diminished or obscured. "We observed constitutive strong signaling via the pathway once both the histidine kinase and the response regulator components were constitutively expressed," he explains. "In prokaryotes, signaling is typically induced upon external stimulation." This led the scientists to speculate that there are multiple cytoplasmic and environmental components in mammalian cells and their growth medium that might stimulate the HK receptors. "More research is needed to understand this phenomenon in full," Benenson adds.

A fascinating aspect of two-component signaling is the support for complex logic signal integration in mammalian cells. "The two-component system naturally lends itself to performing two-input logic, because the expression of both histidine kinase and response regulator genes is required for downstream gene activation. While the natural way to control the pathway is via appropriate ligand or stimulus, another way to utilize this feature is by controlling the expression of these genes via gene regulatory tools, for example transcriptional regulation. In addition, having multiple pathways operating in parallel allows scaling of this approach to larger logic cascades.

In their paper, the scientists tie the two preceding points together by discussing the ability of two-component signaling to implement AND, NOR, and OR gates using constitutive and inducible histidine kinases and response regulators. "The core requirement of two-components naturally lends itself to an AND-like logic behavior," Benenson notes. "By appropriate wiring of upstream gene regulation, the gate can be converted into the NOR gate OR gates are possible with pathways of known cross-reactivity – for example, when two different histidine kinase receptors activate the same response regulator."

Activity of mutant TCS components. Full-length, truncated, and mutant TCS genes are shown with each protein domain color-coded and labeled. Experimental data are given below. Each bar represents mean ± SD of a biological triplicate. The output values for NarX + NarL and NarL are from Fig. 3B they are displayed again for side-by-side comparison. Plasmid composition and output values are in SI Appendix, Tables S17 and S18. TM, transmembrane domain. Credit: Hansen J et al. (2014) Transplantation of prokaryotic two-component signaling pathways into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 111 (44):15705-15710.

The researchers also state in their paper that their findings open new avenues in synthetic circuit design, citing the example of using histidine kinases as biosensors for cytoplasmic metabolites لو cytoplasmic metabolites or media components can be responsible for histidine kinase activation. Benenson expands on this and gives additional examples of novel synthetic biology and genetic engineering technologies and applications that may be possible due to their results. "Apart from potential use as biosensors, new avenues arise due to the fact that these pathways enable AND, OR and NOR logic," he tells Phys.org. "Due to the multiple existing pathways that exhibit minimal cross-talk, large logic circuits can be envisaged via cascading of multiple pathways." Specifically, he points out that while building AND gates in mammalian cells is difficult, they are very useful because they produce an output when multiple conditions hold simultaneously – so having the building blocks of two-component pathways will facilitate the construction of such gates for precise actuation in mammalian cells. "In addition, we showed that certain response regulator mutants can act as efficient constitutive activators, meaning that the plethora of response regulators can therefore generate large sets of orthogonal transcriptional activators for gene circuits of increasing sophistication."

When asked if a longer-term implication of their study might be that an ability to implement robust logic circuits in mammalian cells could lead to a novel translational approach to medical protocols, Benenson replied, "I think that this novel methodology will mesh with existing synthetic biology tools to enable better, more robust, and more programmable gene circuits for rational control of cell physiology, including the control of cell fate or the detection of pathological cell states. Being a signaling cascade, transplanted two-component pathways might improve the speed of information processing in these circuits and enable new ways to sense metabolites." That said, he points that metabolite sensing will have to be experimentally demonstrated.

As to the planned next steps in their research, the scientists plan to investigate the sensory function of HKs, which Benenson says was obscured in their experiments to date. "We also plan to test how building blocks derived from the two-component pathways can lead to the construction of large synthetic circuits," he adds. "In the long run, it would be intriguing to see if more complex pathways based on two-component systems, such as chemotaxis, can be similarly transplanted and perhaps coupled with cell motility machinery." (انجذاب كيميائي is movement of somatic cells, bacteria, and other single-cell or multicellular organisms in response to a chemical stimulus.)

Regarding other areas of research that might benefit from their study, Benenson tells Phys.org that their discovery that key steps of two-component signaling are functional in human cells "can enable a clean cell-based model system for researchers who investigate these pathways. Usually," he adds, "such studies involved labor-intensive purification of protein components, because it is difficult to study these pathways in isolation in bacteria where tens of pathways coexist. We showed that the components can be expressed in human cells, and cross-talk as well as mutant behavior mirrors those found in prokaryotes. We also found one instance of previously-unreported crosstalk, and we suspect that it might also manifest itself in prokaryotes. This," he concludes, "would be an interesting area to pursue."

1 Two-component signal transduction pathways regulating growth and cell cycle progression in a bacterium: a system-level analysis, بلوس علم الأحياء (2005) 3(10):e334, doi:10.1371/journal.pbio.0030334

2 Specificity in Two-Component Signal Transduction Pathways, Annual Review of Genetics (2007) Vol. 41, pp 121–145, doi:10.1146/annurev.genet.41.042007.170548

3 Developing a Synthetic Signal Transduction System in Plants, Methods in Enzymology, Academic Press, 2011, Volume 497, Synthetic Biology, Part A, Chapter 25, Pages 581-602

4 Programmable Ligand Detection System in Plants through a Synthetic Signal Transduction Pathway, PLoSOne 6 (2011) e16292, doi:10.1371/journal.pone.0016292

5 Engineering Key Components in a Synthetic Eukaryotic Signal Transduction Pathway, بيولوجيا النظم الجزيئية (2009) 5:270, doi:10.1038/msb.2009.28


Synthetic Biology Comes into Its Own

Richard A. Muscat
Jun 1, 2016

© ISTOCK.COM/FATIDO/FEORIS

E very two hours in Matthew Bennett&rsquos Rice University lab, cyan and yellow lights flashed in synchronization. Bennett and his team had engineered 12 components to generate the coordinated oscillations. This circuit wasn&rsquot electronic, however it was biological. Two populations of بكتريا قولونية, each carrying a synthetic gene circuit, cycled in synchronous pulses every 14 hours.
Bennett&rsquos work, published last year in علم, 1 is a key application of modern synthetic biology: taking biological components and linking them together to form novel functional circuits. Instead of a program coded in Java and executed by a computer&rsquos working memory, commands were written in DNA and carried out by the microbes&rsquo cellular machinery. LEDs were replaced with fluorescent proteins, and molecular signaling cascades served as the system&rsquos wires.

Stripped back to its most basic components, a synthetic or natural biological network consists of a gene that either.

The first synthetic networks were created in 2000, when researchers built an oscillator and others constructed a bistable switch in بكتريا قولونية. In an oscillator circuit, three genes form a cascade, in which each gene triggers the inactivation of the next gene. In the case of the landmark oscillator constructed by Rockefeller University’s Stanislas Leibler, then at Princeton, and his graduate student Michael Elowitz, one of the three repressor genes was also linked to green fluorescent protein (GFP), resulting in visible pulses of light. 2 A bistable switch, on the other hand, consists of just two genes that inactivate each other. When one gene is on, the other is off. Due to variation in the expression of the active gene, the inactive gene occasionally gets the chance to switch on and suppress the expression of the first gene. Like Leibler and Elowitz, MIT bioengineer James Collins and his grad student Tim Gardner, then at Boston University, linked one of the genes with a sequence encoding GFP, and they were able to see the cells switch between states. 3 (See “Tinkering With Life,” العالم, October 2011.)

Since these early studies, engineers, computer scientists, mathematicians, and physicists have been applying their expertise to engineer synthetic gene networks. In addition to supporting the creation of novel functions, synthetic networks can also give insight into how naturally occurring ones work. As physicist Richard Feynman once wrote on his office blackboard, “What I cannot create, I do not understand.” Studying gene circuits in their natural context is complicated by the complex cellular environment in which they function reconstructing and tuning gene interactions in vitro can provide a simplified model for how equivalent networks behave in nature. (See illustration below.)

“Naturally occurring gene oscillators, especially the circadian oscillator that regulates our daily rhythms, are hard to study,” says Bennett. “We can easily make changes and fine-tune synthetic gene circuits in ways that are difficult in natural systems. Though our synthetic circuits are inherently different from their natural counterparts, we can use them to study some of the basic principles of how genes dynamically regulate each other.”

Stripped back to its most basic com­ponents, a synthetic or natural biologi­cal network consists of a gene that either switches another gene on or turns it off.

Researchers at the J. Craig Venter Institute (JCVI) in San Diego have even gone so far as to create the smallest functional genome to date, a mycoplasma bacterium consisting of just 473 genes. 4 This stripped-down cell can now provide insights into what each of the genes and their respective proteins are doing to keep the organism alive.

Building man-made circuits can also lead to something entirely new, Bennett adds. “I try to find ways to engineer a new synthetic circuit that can mimic the unexplained phenomenon, even if my solution is not the same as nature’s. Sometimes this leads to new insights into the natural circuit and sometimes not. Either way it’s exciting.”

Genetic networking

In the early 2000s, Uri Alon of the Weizmann Institute of Science in Israel and colleagues studied the connections between genes in بكتريا قولونية, discovering common motifs, or patterns of gene connectivity. Importantly, the researchers found that these motifs occurred more often than could be expected if you took the same number of genes and randomly connected them, suggesting that biological networks have evolved these patterns. 5 After early studies demonstrated researchers’ ability to create novel gene circuits, many synthetic biologists began making synthetic replicas of these natural motifs.

DECIPHERING THE NETWORK: A naturally occurring gene network consists of many interacting genes that can activate or repress each other (top). But embedded within a larger network, their function can be hard to study. Synthetic biology can simplify the study of such gene interactions by engineering analogous circuits separate from the larger network (bottom).
See full infographic: WEB COURTESY OF RICHARD MUSCAT

By isolating a subset of genes and inserting them into a new cell, synthetic biologists can assemble a motif that has little interaction with the molecular machinery of that cell the genes are considered orthogonal. For example, viral promoters—sequences of DNA that drive gene expression—can be used to express GFP, a gene taken from jellyfish, inside mammalian cells. Modifications to promoters can allow them to be controlled by signaling molecules, not only allowing novel genes to be expressed, but giving synthetic biologists the ability to switch them on and off.

One of the simplest signaling motifs involves a gene that either activates or represses بحد ذاتها. Positive autoregulation is when a protein triggers its own expression. At first, due to the absence or very low concentration of protein, its expression is very low. After a while, however, an intermediate level of the protein builds up, speeding up the rise in expression levels. The overall effect of positive autoregulation is thus a delay before the gene reaches normal expression rates. 6 Conversely, negative regulation, when a gene inhibits its own expression, allows the fast activation of a gene upon exposure to a signaling molecule, but then slows its own production once it reaches a critical level, allowing it to rapidly reach a steady state. 7 (See illustration below.)

Another common motif includes the interaction of several genes forming feed-forward loops, in which one gene activates or represses the expression of another only under certain conditions. Synthetic implementation of one particular feed-forward loop has been shown to produce a pulse of gene activation—a large peak of gene expression followed by steady state expression. 8

Autoregulation and feed-forward loops highlight how synthetic biology can create direct replicas of naturally occurring circuits to understand their function. However, synthetic biologists also have engineered a number of novel behaviors in cells: for example, different types of computation. One of the choices a synthetic biologist might make when constructing a synthetic circuit is whether to make it digital (i.e., on/off) or analog (varying levels of output). Researchers have constructed digital circuits implementing Boolean computations such as AND/OR and NOT/NOR logic with up to 10 regulators and 55 component parts in بكتريا قولونية. 9 Of course, many genes are not expressed in a digital manner neither completely on nor completely off, they are, rather, expressed dynamically over a range of levels. As a result, synthetic biologists are increasingly taking inspiration from nature and designing computational circuits in analog, implementing functions such as addition, subtraction, and division. 10

More than 15 years of constructing such biological gene networks has made waves in a wide variety of scientific fields. For example, Mary Dunlop of the University of Vermont is taking advantage of feedback circuits in the design of biofuel-producing bacteria. Her group has modified بكتريا قولونية to express biofuels such as alcohols, diesels, or jet fuels that are exported from the cell by efflux pumps. Too much biofuel accumulating in a cell is toxic, and expression of too many efflux pumps places a strain on the cell. Either of these problems can prevent cell growth and the production of more biofuel. Through mathematical simulation, Dunlop has demonstrated that a negative-feedback sensor could control the balance by delaying pump expression until it is needed, when there is enough biofuel inside the cell to necessitate pumping it out. 11

DYNAMIC GENE EXPRESSION: A number of motifs that appear in naturally occurring networks have been reconstructed in synthetic circuits. Positive autoregulation (left) occurs when a gene is activated by its own product this results in delayed activation. (The black dotted line provides a comparison to gene activation with no autoregulation.) Conversely, negative autoregulation occurs when a gene represses its own expression (middle), allowing its rapid activation until it reaches a steady state, and then preventing overexpression. Finally, a combination of several genes can form a motif known as a feed-forward loop (right). Depending on the way the genes are connected, activating a single gene triggers the simultaneous activation and repression of another gene, causing a pulse in expression followed by a lower steady state.
See full infographic: WEB COURTESY OF RICHARD MUSCAT

Synthetic circuits are also showing potential as valuable tools for diagnosing and treating disease. In one study, researchers created synthetic circuits designed to detect combinations of microRNAs associated with a particular case of cervical cancer, and inserted the circuits into cancer and noncancer cell lines. Using a combination of AND and OR logic allowed the detection of specific combinations of different microRNA species only present in HeLa cells. If the right microRNA combination was detected, the synthetic circuit expressed a gene that caused the cells to die. 12

While many technical challenges stand in the way of applying synthetic biology techniques in treating patients, a more near-term application may come in the form of paper-based diagnostics. In 2014, Collins and his colleagues at Harvard and Boston Universities developed synthetic gene circuits that function outside of cells and can be embedded in paper, which changes color through the expression of fluorescent proteins if certain markers are present in the sample. In this proof-of-concept study, the researchers showed that such paper-based diagnostics could be designed for a diverse range of applications, from glucose detection to the identification of different strains of Ebola virus, with outputs that can be seen by eye or a cheap microscope. 13 This year, the team updated the test to detect 24 RNA sequences found in the Zika genome when a target RNA is present, a series of interactions turns the paper purple. 14 Paper-based diagnostics are easy to store through freeze-drying and to move to low-resource settings out of the lab, and researchers are now working to design such diagnostics for use in the field.

Working in tandem

BACTERIAL MOSAIC: Two populations of E. coli fluoresce yellow and cyan in unison as they activate or repress the other’s expression as well as their own. (See illustration below.) SCIENCE, 349:986-89, 2015, COURTESY OF MATTHEW BENNETT The examples described so far have been of genetic circuits operating in isolation inside many identical cells or outside cells altogether. In nature, however, cells don’t exist in a vacuum rather, small signaling molecules that can be easily transmitted across cell membranes allow cells to communicate with their neighbors.

In the case of the oscillator created in 2000, each individual cell in a population of bacteria would act in isolation, with one cell oscillating out of phase from its neighbors. Ten years later, University of California, San Diego’s Jeff Hasty and his colleagues used small signaling molecules that could pass out of one cell and into another to regulate the gene network within that cell. As a result, the oscillations of entire populations of bacteria were linked together and cycled in unison. 15

Bennett’s group at Rice University took this idea one step further when they made use of two interacting populations of بكتريا قولونية carrying different genetic circuits to coordinate the long-term, stable oscillations of fluorescent protein expression. One population of bacteria acted as an activator strain while the other population acted as a repressor strain. The activator strain produced a signaling molecule that activated even more of its own signal production, triggering activation of the repressor strain. When activated, the repressor strain produced another signaling molecule that repressed both itself and the activator strain. Each strain also produced an enzyme that degraded the signaling molecules in the system, preventing the buildup of leftover signal.

“We took the circuitry of a single strain oscillator and reconfigured it so that two strains must work together to achieve the oscillations,” Bennett explains. “It’s similar to taking a book and giving the even pages to one person and the odd pages to another. To either individual, their portion of the book is useless. But if the two can communicate and work together, the book will make sense.”

COORDINATED OSCILLATIONS: Two populations of bacteria interact via signaling molecules to coordinate expression of fluorescent proteins. When using positive and negative autoregulation (top), the oscillations are robust as the two populations grow. The negative feedback loop of the repressor strain and the positive feedback loop of the activator strain thus reinforce oscillations when feedback is removed from the circuit (bottom), oscillations are less coordinated and prone to failure. “You can think of feedback loops as self-correction mechanisms,” says Bennett. “They are constantly assessing the current performance of the circuit and make changes if necessary.”
See full infographic: WEB COURTESY OF RICHARD MUSCAT

As each strain is activated, a fluorescent molecule is produced: cyan in the activator strain and yellow in the repressor strain. When mixed together, both populations are activated and repressed in unison, causing fluorescent oscillations over the entire cell population. When one strain is grown in isolation, no oscillations are observed.

Applying principles of basic gene motifs such as feedback loops with cell population biology can thus expand the repertoire of synthetic biologists looking to create novel genetic circuits. Likewise, implementing synthetic biological circuits in mixed cell populations that have coordinated behavior might illustrate ways in which complex synthetic tissues and organs could be engineered.

The decreasing cost of DNA synthesis and sequencing, the ability to share plasmids, the creation of databases describing genetic components, and the development of novel techniques to easily assemble and edit genomes have greatly accelerated progress in this area. As researchers engineer new genetic components, the relatively new field of synthetic biology could soon begin to bear actionable fruit, with applications that include compound synthesis, diagnostics, and even medical treatments. In addition, the design and study of synthetic systems will continue to give us a deeper understanding of the biology that exists around us.

“I take a great deal of inspiration from nature,” says Bennett. “Sometimes I see a circuit that is well-characterized and wonder if we can build it just as well as nature. Other times, I look at a phenomenon in nature that is unexplained. Then I get really excited.”

Richard A. Muscat works at the London-based Cancer Research UK, bringing together multidisciplinary teams of researchers using engineering and physical sciences to find new ways to tackle cancer.


Cell circuits remember their history: Engineers design new synthetic biology circuits that combine memory and logic

Engineers at MIT have developed genetic circuits in bacterial cells that not only perform logic functions, but also remember the results. Credit: LIANG ZONG AND YAN LIANG

MIT engineers have created genetic circuits in bacterial cells that not only perform logic functions, but also remember the results, which are encoded in the cell's DNA and passed on for dozens of generations.

The circuits, described in the Feb. 10 online edition of التكنولوجيا الحيوية الطبيعة, could be used as long-term environmental sensors, efficient controls for biomanufacturing, or to program stem cells to differentiate into other cell types.

"Almost all of the previous work in synthetic biology that we're aware of has either focused on logic components or on memory modules that just encode memory. We think complex computation will involve combining both logic and memory, and that's why we built this particular framework to do so," says Timothy Lu, an MIT assistant professor of electrical engineering and computer science and biological engineering and senior author of the Nature Biotechnology paper.

Lead author of the paper is MIT postdoc Piro Siuti. Undergraduate John Yazbek is also an author.

Synthetic biologists use interchangeable genetic parts to design circuits that perform a specific function, such as detecting a chemical in the environment. In that type of circuit, the target chemical would generate a specific response, such as production of green fluorescent protein (GFP).

Circuits can also be designed for any type of Boolean logic function, such as AND gates and OR gates. Using those kinds of gates, circuits can detect multiple inputs. In most of the previously engineered cellular logic circuits, the end product is generated only as long as the original stimuli are present: Once they disappear, the circuit shuts off until another stimulus comes along.

Lu and his colleagues set out to design a circuit that would be irreversibly altered by the original stimulus, creating a permanent memory of the event. To do this, they drew on memory circuits that Lu and colleagues designed in 2009. Those circuits depend on enzymes known as recombinases, which can cut out stretches of DNA, flip them, or insert them. Sequential activation of those enzymes allows the circuits to count events happening inside a cell.

Lu designed the new circuits so that the memory function is built into the logic gate itself. With a typical cellular AND gate, the two necessary inputs activate proteins that together turn on expression of an output gene. However, in the new circuits, the inputs stably alter regions of DNA that control GFP production. These regions, known as promoters, recruit the cellular proteins responsible for transcribing the GFP gene into messenger RNA, which then directs protein assembly.

For example, in one circuit described in the paper, two DNA sequences called terminators are interposed between the promoter and the output gene (GFP, in this case). Each of these terminators inhibits the transcription of the output gene and can be flipped by a different recombinase enzyme, making the terminator inactive.

Each of the circuit's two inputs turns on production of one of the recombinase enzymes needed to flip a terminator. In the absence of either input, GFP production is blocked. If both are present, both terminators are flipped, resulting in their inactivation and subsequent production of GFP.

Once the DNA terminator sequences are flipped, they can't return to their original state—the memory of the logic gate activation is permanently stored in the DNA sequence. The sequence also gets passed on for at least 90 generations. Scientists wanting to read the cell's history can either measure its GFP output, which will stay on continuously, or if the cell has died, they can retrieve the memory by sequencing its DNA.

Using this design strategy, the researchers can create all two-input logic gates and implement sequential logic systems. "It's really easy to swap things in and out," says Lu, who is also a member of MIT's Synthetic Biology Center. "If you start off with a standard parts library, you can use a one-step reaction to assemble any kind of function that you want."

Such circuits could also be used to create a type of circuit known as a digital-to-analog converter. This kind of circuit takes digital inputs—for example, the presence or absence of single chemicals—and converts them to an analog output, which can be a range of values, such as continuous levels of gene expression.

For example, if the cell has two circuits, each of which expresses GFP at different levels when they are activated by their specific input, those inputs can produce four different analog output levels. Moreover, by measuring how much GFP is produced, the researchers can figure out which of the inputs were present.

That type of circuit could offer better control over the production of cells that generate biofuels, drugs or other useful compounds. Instead of creating circuits that are always on, or using promoters that need continuous inputs to control their output levels, scientists could transiently program the circuit to produce at a certain level. The cells and their progeny would always remember that level, without needing any more information.

Used as environmental sensors, such circuits could also provide very precise long-term memory. "You could have different digital signals you wanted to sense, and just have one analog output that summarizes everything that was happening inside," Lu says.

This platform could also allow scientists to more accurately control the fate of stem cells as they develop into other cell types. Lu is now working on engineering cells to follow sequential development steps, depending on what kinds of inputs they receive from the environment.

Michael Jewett, an assistant professor of chemical and biological engineering at Northwestern University, says the new design represents a "huge advancement in DNA-encoded memory storage."

"I anticipate that the innovations reported here will help to inspire larger synthetic biology efforts that push the limits of engineered biological systems," says Jewett, who was not involved in the research.


This work was supported by US Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) 1KM and SD2 awards HR0011-15-C-0084 and FA8750-17-C-0229 (C.A.V., A.E.B., and Y.P.), National Science Foundation Award CCF-1807575 (C.A.V.), U Colorado-Boulder/Dept of Energy subaward DE-SC0018368 (C.A.V., J.S.), and a Samsung Scholarship (Y.P.).

YP and CAV conceived the study and designed the experiments YP performed all the experiments JS designed and constructed plasmid-based genetic circuits used in the study YP and TEG developed new terminator prediction pipeline YP and AEB performed the RNA sequencing data analysis and YP, AEB, and CAV wrote the manuscript with input from all the authors.


شاهد الفيديو: Breadboard tutorial: How to use a breadboard for beginners (أغسطس 2022).