معلومة

شظايا منفصلة من الحمض النووي بحجم مختلف جدًا (قلة ولامدا-دنا)

شظايا منفصلة من الحمض النووي بحجم مختلف جدًا (قلة ولامدا-دنا)



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أقوم بإجراء تفاعل ربط على أحد الأطراف اللاصقة لـ lambda-DNA.

القلة القليلة للربط هي 25 نقطة أساس (10x زائدة) ، في حين أن lambda-DNA هي 48 كيلو بايت. أود استعادة الحمض النووي لامدا والتخلص من القلة الزائدة غير المتفاعلة. نظرًا لأوزانها الجزيئية المختلفة اختلافًا كبيرًا ، يجب أن يكون من السهل فصلها ، لكنني لم أجد منهجية قياسية عبر الإنترنت.

لا أريد تشغيل الجل وحجم العينة الإجمالي هو 0.5 مل. هناك بعض أعمدة الترشيح التي قد تعمل ، لكن حجم الإدخال لا يتجاوز 25 ميكرولتر (لدي 20 ضعفًا).

لست مضطرًا للتخلص منه الكل القلة ، وجود الحمض النووي لامدا أكثر بقليل من القلة في النهاية سيكون كافياً.

أي بروتوكول بسيط قد يعمل في هذه الحالة؟


قد يعمل عمود الدوران من أجل أغراضك حيث يمكنك القيام بجولات متعددة من الربط إذا كان حجمك كبيرًا جدًا بحيث لا يمكن ربطه في مسار واحد ، ولكن بالنسبة للحمض النووي بهذا الحجم ، فسيظل الكثير عالقًا في العمود بشكل لا رجعة فيه. انظر على سبيل المثال بروتوكول Monarch® PCR & DNA Clean Kit.

وبالتالي ، أوصي فقط بإجراء ترسيب الإيثانول ، والذي يفضل استعادة جزيئات الحمض النووي الأطول (انظر على سبيل المثال هذا البروتوكول).


أفضل 7 تقنيات مستخدمة في الهندسة الوراثية

تلقي هذه المقالة الضوء على أفضل سبع تقنيات مستخدمة في الهندسة الوراثية. التقنيات السبعة هي: (1) Agarose Gel Electrophoresis (2) عزل وتنقية الأحماض النووية (3) عزل الكروموسومات (4) تقنيات تنشيف الحمض النووي (5) تسلسل الحمض النووي (6) طرق بديلة لتسلسل الحمض النووي و (7) التوليف الكيميائي للحمض النووي.

تقنية # 1. Agarose Gel الكهربائي:

يشير الرحلان الكهربائي إلى حركة الجزيئات المشحونة في مجال كهربائي. تتحرك الجزيئات سالبة الشحنة نحو القطب الموجب بينما تهاجر الجزيئات المشحونة إيجابًا نحو القطب السالب.

الرحلان الكهربائي للهلام هو أسلوب تحليلي يستخدم بشكل روتيني لفصل / تنقية أجزاء معينة من الحمض النووي. يتكون الجل إما من بولي أكريلاميد أو الاغاروز. يستخدم الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE) لفصل أجزاء الحمض النووي الأصغر في حين أن الاغاروز الكهربائي والرحلان الشعيبي مناسبان لفصل شظايا الحمض النووي التي يتراوح حجمها من 100 زوج قاعدي إلى 20 كيلو بايت أزواج. يمكن أيضًا استخدام الرحلان الكهربائي للهلام لفصل جزيئات الحمض النووي الريبي.

Agarose هو عديد السكاريد مشتق من الأعشاب البحرية. يشكل مادة هلامية صلبة عند إذابته في محلول مائي بتركيزات تتراوح بين 0.5 و 2.0٪ (وزن / حجم). وتجدر الإشارة هنا إلى أن الاغاروز المستخدم في الرحلان الكهربائي هو شكل أكثر تنقية من الأجار بالمقارنة مع تلك المستخدمة لأغراض الاستزراع. يتم عرض عرض تخطيطي لوحدة الاغاروز الكهربائي للهلام في الشكل 7.1.

توضع عينات الحمض النووي في آبار سطح الهلام ويتم تشغيل مصدر الطاقة. نظرًا لأن الحمض النووي مشحون سالبًا ، تتحرك شظايا الحمض النووي عبر الهلام باتجاه القطب الموجب. معدل هجرة الحمض النووي يعتمد على الحجم والشكل. بشكل عام ، تتحرك الأجزاء الخطية الأصغر بشكل أسرع من الأجزاء الأكبر. وبالتالي ، يمكن استخدام الرحلان الكهربائي للهلام بشكل ملائم لفصل خليط من شظايا الحمض النووي ، بناءً على حجمها.

يشكل Agarose مواد هلامية بأحجام مسامية تتراوح قطرها من 100 إلى 300 نانومتر. يعتمد حجم المسام الفعلي على تركيز الاغاروز. يحدد حجم المسام نطاق شظايا الحمض النووي التي يمكن فصلها عن طريق الرحلان الكهربائي. على سبيل المثال ، يتم استخدام 0.3٪ agarose لفصل أجزاء DNA بين 5 و 50 كيلو بايت ، بينما يمكن لـ 5٪ agarose فصل جزيئات 100-500 زوج قاعدي.

يمكن مراقبة هجرة شظايا الحمض النووي أثناء مسار الرحلان الكهربائي باستخدام الأصباغ بمعدلات هجرة معروفة. تضاف هذه الأصباغ إلى عينات الحمض النووي قبل التحميل. يمكن الكشف عن نطاقات الحمض النووي عن طريق نقع الجل في محلول بروميد الإيثيديوم.

عندما يتم تنشيطها عن طريق الأشعة فوق البنفسجية ، فإن أزواج قاعدة الحمض النووي المرتبطة ببروميد الإيثيديوم تنبعث من الفلورة البرتقالية. وبهذه الطريقة يمكن التعرف على شظايا الحمض النووي المنفصلة في الرحلان الكهربائي [اغروس) (الشكل 7.2).

الرحلان الكهربائي للهلام النبضي (PFGE):

يمكن فصل جزيئات الحمض النووي كبيرة الحجم (10 ميغا بايت) في هلام الاغاروز باستخدام PFGE. أصبح هذا ممكنًا عن طريق التغيير الدوري لاتجاه هجرة الحمض النووي عن طريق تغيير اتجاه المجال الكهربائي فيما يتعلق بالهلام. مع تغير اتجاه المجال الكهربائي ، تحاذي جزيئات الحمض النووي نفسها وتهاجر في اتجاهات جديدة.

يتمثل القيد الرئيسي للرحلان الكهربائي للهلام في المجال النبضي في أن العينات لا تهاجر في خطوط مستقيمة. هذا يجعل التحليل الإضافي للحمض النووي أمرًا صعبًا إلى حد ما.

الرحلان الكهربي المتجانس المثبت على شكل محيطي (CHEF):

CHEF هي طريقة محسنة لتطبيق المجالات الكهربائية المتناوبة لفصل جزيئات الحمض النووي في الرحلان الكهربائي. في هذا النهج ، يتم تثبيت زاوية إعادة توجيه المجال الكهربائي عند 120 درجة مئوية (أو حتى عند 90 درجة) ويتم تنفيذ الرحلان الكهربائي. باستخدام CHEF ، يمكن فصل أجزاء كبيرة من الحمض النووي (200-300 كيلو بايت) بشكل روتيني في غضون ساعات.

رحلان جل بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE):

يتكون جل بولي أكريلاميد من سلاسل من مونومرات الأكريلاميد المرتبطة بوحدات ميثيلينبيساكريلاميد. يعتمد حجم مسام الجل على التركيز الكلي للمونومرات والروابط المتقاطعة. يستخدم الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE) لفصل جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة التي تختلف في الطول بواسطة نيوكليوتيد واحد فقط.

لا يمكن استخدام المواد الهلامية Agarose لهذا الغرض. وذلك لأن المواد الهلامية متعددة الأكريلاميد لها أحجام مسام أصغر من المواد الهلامية من مادة الاغاروز وتسمح بفصل دقيق لجزيئات الحمض النووي من 10 إلى 1500 زوج قاعدي. يعتبر التحليل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد تقنية رائعة للفصل الدقيق لجزيئات الحمض النووي التي تختلف عن بعضها البعض حتى بمقدار 1-3 نيوكليوتيدات. يستخدم PAGE في تسلسل الحمض النووي ولتحديد المنتجات المضخمة للحمض النووي عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).

استخدامات أخرى للهلام الكهربائي:

إلى جانب فصل شظايا الحمض النووي ، يعد الفصل الكهربائي للهلام مفيدًا أيضًا لفهم التكوين الجزيئي لجزيئات الحمض النووي وتفاعلات البروتين والحمض النووي. ويستند هذا الأخير على مبدأ أن ارتباط البروتين بالحمض النووي عادة ما يؤدي إلى تقليل الحركة الكهربي.

تتضمن تقنية الرحلان الكهربي لتفاعل الحمض النووي البروتيني إضافة بروتين مرغوب فيه إلى شظايا DNA مزدوجة الشريطة ، وفصل هذا الحمض النووي المعقد والعاري عن طريق الرحلان الكهربائي. يمكن تصور الأنماط المنفصلة لفهم تفاعلات البروتين والحمض النووي.

تقنية # 2. عزل وتنقية الأحماض النووية:

تتطلب جميع التجارب التي تتناول التلاعب الجيني تقريبًا أشكالًا نقية من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، أو حتى كليهما في بعض الأحيان. ومن ثم هناك حاجة لعزل موثوق للأحماض النووية من الخلايا. تتضمن تنقية الأحماض النووية بشكل عام ثلاث مراحل.

1. تكسير أو فتح الخلايا لكشف الأحماض النووية.

2. فصل الأحماض النووية عن المكونات الخلوية الأخرى.

3. استعادة الأحماض النووية بشكل نقي.

يتم استخدام إجراءات تحليلية تتضمن بضع خطوات إلى عدة خطوات لتنقية الأحماض النووية. في الواقع ، تتوفر الأدوات التجارية بسهولة هذه الأيام لتمكين تنقية الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من مصادر مختلفة. تم وصف المبادئ والإجراءات الأساسية لتنقية الحمض النووي بإيجاز.

تنقية الحمض النووي الخلوي:

تتمثل الخطوة الأولى لتنقية الحمض النووي في فتح الخلايا وإطلاق الحمض النووي. يجب أن تكون الطريقة لطيفة للحفاظ على الحمض النووي الأصلي. بسبب التباين في بنية الخلية ، تختلف طرق كسر الخلايا أيضًا.

يمكن تحلل الخلايا البكتيرية (مثل الإشريكية القولونية) بمزيج من العلاجات الأنزيمية والكيميائية. يتم استخدام إنزيم الليزوزيم والمادة الكيميائية إيثيلين ديامين رباعي أسيتات (EDTA) لهذا الغرض. يتبع ذلك إضافة منظف مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS).

يمكن فتح الخلايا الحيوانية ، وخاصة الخلايا الحيوانية المستزرعة ، بسهولة عن طريق المعالجة المباشرة للخلايا باستخدام المنظفات (SDS).

تتطلب الخلايا النباتية ذات الجدران الخلوية القوية معالجة قاسية حتى تنفتح. يتم تجميد الخلايا ثم طحنها في مدقة هاون ومدقة. هذه طريقة فعالة لكسر جدران السليلوز.

طرق تنقية الحمض النووي:

هناك طريقتان مختلفتان لتنقية الحمض النووي من المستخلصات الخلوية.

1. تنقية الحمض النووي عن طريق إزالة المكونات الخلوية:

يتضمن هذا التحلل أو الإزالة الكاملة لجميع المكونات الخلوية بخلاف الحمض النووي. هذا النهج مناسب إذا كانت الخلايا لا تحتوي على كميات كبيرة من الدهون والكربوهيدرات. يتم طرد المستخلص الخلوي بسرعة منخفضة لإزالة الحطام (مثل قطع جدار الخلية) الذي يشكل حبيبة في قاع الأنبوب.

يتم جمع المادة الطافية ومعالجتها بالفينول لترسيب البروتينات في الواجهة بين الطبقات العضوية والمائية. يتم جمع الطبقة المائية ، التي تحتوي على الأحماض النووية المذابة ، ومعالجتها باستخدام إنزيم الريبونوكلياز (RNase). يتحلل الحمض النووي الريبي بينما يظل الحمض النووي سليمًا. يمكن ترسيب هذا الحمض النووي عن طريق إضافة الإيثانول وعزله بعد الطرد المركزي ، وتعليقه في مخزن مؤقت مناسب.

2. التنقية المباشرة للحمض النووي:

في هذا النهج ، يتم إزالة الحمض النووي نفسه بشكل انتقائي من المستخلص الخلوي وعزله. هناك طريقتان للتنقية المباشرة للحمض النووي. في إحدى الطرق ، تؤدي إضافة منظف سيتيل ترايميثيل أمونيوم (CTAB) إلى تكوين مركب غير قابل للذوبان مع الأحماض النووية. يتم جمع هذا المركب في شكل راسب بعد الطرد المركزي وتعليقه في محلول عالي الملح لإطلاق الأحماض النووية. عن طريق العلاج مع RNase ، يتحلل الحمض النووي الريبي. يمكن عزل الحمض النووي النقي عن طريق ترسيب الإيثانول.

تعتمد التقنية الثانية على مبدأ الارتباط الوثيق بين جزيئات الحمض النووي والسيليكا في وجود عامل تغيير طبيعة مثل ثيوسيانات الغوانيدينيوم. يمكن تحقيق عزل الحمض النووي عن طريق الإضافة المباشرة لجزيئات السيليكا وثيوسيانات الغوانيدينيوم إلى المستخلص الخلوي ، متبوعًا بالطرد المركزي. بالتناوب ، يمكن استخدام عمود كروماتوجرافي يحتوي على السيليكا ، ومن خلاله يتم تمرير المستخلص وثيوسيانات الغوانيدينيوم. يرتبط الحمض النووي بجزيئات السيليكا الموجودة في العمود والتي يمكن استعادتها.

تنقية DNA البلازميد:

غالبًا ما تكون الأشكال النقية من DNA البلازميد مطلوبة في تجارب الهندسة الوراثية. الشرط الأساسي لعزل ناجح للحمض النووي للبلازميد هو التحلل المناسب واللطيف للخلايا المضيفة ، بحيث يتم إطلاق DNA البلازميد دون تلوث كبير للحمض النووي الصبغي.

يمكن إزالة الحمض النووي الصبغي للخلية المضيفة ذات الوزن الجزيئي المرتفع جنبًا إلى جنب مع حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عالي السرعة وعالي السرعة. ينتج عن هذا تكوين محلل تم تطهيره يمكن من خلاله عزل DNA البلازميد النقي. من بين الطرق العديدة المستخدمة لعزل DNA البلازميد ، تم وصف طريقتين بإيجاز.

طريقة الطرد المركزي Isopycnic:

تتم معالجة المحللة المزالة (المشار إليها أعلاه) بمحلول كلوريد السيزيوم (CsCI) الذي يحتوي على بروميد الإيثيديوم (EtBr). يمكن أن يرتبط EtBr بجزيئات DNA الخطية (شظايا DNA الصبغية والحمض النووي البلازميدي المفتوح) وليس مع DNA البلازميد الدائري. كثافة مركب DNA-EtBr أقل بكثير من DNA البلازميد. يمكن فصل DNA البلازميد الدائري بواسطة الطرد المركزي المتساوي في تدرج CsCI-EtBr (الشكل 7.3).

طريقة بيرنبويم ودولي:

تستخدم التقنية التي طورها بيرنبويم ودولي (1979) على نطاق واسع لتنقية DNA البلازميد. تعتمد هذه الطريقة على مبدأ وجود نطاق ضيق من الأس الهيدروجيني (12.0-12.5) يحدث فيه تمسخ الحمض النووي الخطي وليس الحمض النووي الدائري المغلق.

عندما تتعرض المحللة التي تم تطهيرها إلى درجة الحموضة القلوية المراقبة بعناية (12.0 إلى 12.5) ، تظل جزيئات DNA البلازميد في محلول بينما يتم تغيير خصائص جميع جزيئات الحمض النووي الأخرى وترسبها. يمكن إزالة هذا الراسب بالطرد المركزي. يمكن تركيز DNA البلازميد في المادة الطافية عن طريق ترسيب الإيثانول. في بعض الأحيان ، قد يكون من الضروري زيادة تنقية DNA البلازميد والذي يمكن تحقيقه عن طريق الترشيح الهلامي.

العوامل المؤثرة على تنقية DNA البلازميد:

هناك عدة عوامل تؤثر على تنقية DNA البلازميد. يتم وصف أهمها بإيجاز.

1. رقم نسخة البلازميد:

عدد البلازميدات الموجودة في الخلايا المضيفة في وقت الحصاد مهم. يتأثر عدد النسخ بدوره بوسط النمو والنمط الجيني للخلية المضيفة ومرحلة النمو. بشكل عام ، كلما زاد عدد النسخ ، كان إنتاج البلازميد عند التنقية أفضل.

2. تحضير محللة تم تطهيرها:

إن المنهجية المتبعة والعناية التي يتم اتخاذها لتحليل الخلايا المضيفة لإعداد محللة تم تطهيرها أمر مهم.

3. الخلايا المضيفة مع جين الطرف أ:

تمتلك الخلايا المضيفة من النوع البري جينًا نهائيًا يشفر إنزيم نوكلياز أنا. وظائف هذا الإنزيم غير معروفة بوضوح. ومع ذلك ، لوحظ أن سلالات الخلايا التي تحمل طفرات endA تعمل على تحسين استقرار وإنتاجية DNA البلازميد.

تنقية مرنا:

من بين الحمض النووي الريبي ، كثيرًا ما تكون mRNA مطلوبة في شكل نقي للتجارب الجينية. بعد أن تتعطل الخلايا عن طريق التحلل بتقنيات مختلفة ، يتم إزالة البروتين الخلوي عن طريق المعالجة بمزيج الفينول أو الفينول / الكلوروفورم. عند الطرد المركزي ، تتركز الأحماض النووية في الطور المائي العلوي والذي قد يترسب بعد ذلك باستخدام الأيزوبروبانول أو الإيثانول.

يمكن تحقيق تنقية mRNA عن طريق كروماتوجرافيا التقارب باستخدام oligo (dT) -cellulose (الشكل 7.4). يعتمد هذا على مبدأ أن السلولوز oligo (dT) يمكن أن يرتبط على وجه التحديد بذيول بولي (A) من mRNA حقيقية النواة. وبالتالي ، من خلال هذا النهج ، من الممكن عزل mRNA من DNA و rRNA و tRNA.

عندما يتم تمرير محلول الحمض النووي من خلال عمود كروموتوجرافي تقارب ، يرتبط oligo (dT) بذيول بولي (A) من الرنا المرسال. عن طريق غسل العمود بمخزن عالي الملح ، يمكن التخلص من الحمض النووي ، والرنا الريباسي ، والحمض النووي الريبي ، في حين أن الرنا المرسال مرتبط بإحكام. يمكن بعد ذلك التخلص من هذا الرنا المرسال عن طريق الغسيل باستخدام محلول منخفض الملح. يتم ترسيب mRNA مع الإيثانول ويتم جمعه بالطرد المركزي (الشكل 7.4).

تقنية # 3. عزل الكروموسومات:

لا يمكن فصل الكروموسومات الكبيرة من حقيقيات النوى عن طريق الرحلان الكهربائي التقليدي. يمكن فصل الكروموسومات الفردية لحقيقيات النوى عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) ، والمعروف أيضًا باسم قياس التدفق الخلوي أو التنميط النووي للتدفق.

فرز الخلايا باستخدام الإسفار:

لتنفيذ FACS ، يتم فتح الخلايا المنقسمة (مع الكروموسومات المكثفة) بعناية ، ويتم تحضير خليط من الكروموسومات السليمة. ثم يتم صبغ هذه الكروموسومات بصبغة الفلورسنت. كمية الصبغة التي ترتبط بالكروموسوم تعتمد على حجمها. وهكذا ، فإن الكروموسومات الأكبر (مع المزيد من الحمض النووي) تربط صبغة أكثر وتتألق أكثر سطوعًا من الأصغر.

يتم تخفيف الكروموسومات المختلطة بالصبغة وتمريرها من خلال فتحة دقيقة ينتج عنها تكوين تيار من القطرات. تحتوي كل قطرة على كروموسوم واحد. يتم الكشف عن تألق الكروموسومات بواسطة الليزر.

عندما يشير التألق إلى أن الكروموسوم المضاء بالليزر هو المطلوب ، يتم تطبيق الشحنة الكهربائية بشكل خاص على هذه القطرات (وليس غيرها) التي يتم شحنها. ينتج عن هذا انحراف للقطرات مع الكروموسوم المطلوب والذي يمكن فصله عن الباقي وتجميعه (الشكل 7.5). تمر القطرات غير المشحونة التي لا تحتوي على الكروموسوم المطلوب عبر وعاء تجميع النفايات.

مجموعة الكروموسومات ذات الحجم المماثل:

التطبيق المباشر لنظام مراقبة الأصول الميدانية (الموصوف أعلاه) غير مناسب لفصل الكروموسومات ذات الأحجام المماثلة ، على سبيل المثال الكروموسومات 21 و 22 في البشر. يمكن جمع هذه الكروموسومات باستخدام أصباغ خاصة (مثل Hoechst 33258 و chromomycin A3) التي ترتبط بالحمض النووي الغني بـ AT أو الحمض النووي الغني بالـ GC. ما تبقى من الإجراء هو نفسه الذي تم وصفه. من الملائم فصل اثنين أو أكثر من الكروموسومات ذات الأحجام المتماثلة بواسطة أصباغ مختلفة. هذا ممكن لأنه لا يحتمل أن يحتوي اثنان من الكروموسومات على محتويات GC / AT متطابقة.

تقنية # 4. تقنيات التنشيف بالحمض النووي:

تُستخدم تقنيات التنشيف على نطاق واسع كأدوات تحليلية لتحديد هوية شظايا الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المرغوبة من آلاف الجزيئات. يشير النشاف إلى عملية تثبيت عينة الأحماض النووية أو الدعم الصلب (أغشية النيتروسليلوز أو النايلون). ثم يتم استخدام الأحماض النووية المبللة كأهداف في تجارب التهجين لاكتشافها المحدد. يوضح الشكل 7.6 الخطوط العريضة لتقنية تنشيف الحمض النووي.

أنواع تقنيات التنشيف:

يتم سرد تقنيات النشاف الأكثر استخدامًا أدناه:

I. النشاف الجنوبي (للحمض النووي)

II. النشاف الشمالي (لـ RNA)

رابعا. تهجين المستعمرة واللويحات (خلايا من المستعمرة).

تم تسمية النشاف الجنوبي على اسم العالم إد ساوثرن (1975) الذي طوره. الأسماء الأخرى النشاف الشمالي والنشاف الغربي هي مصطلحات معملية مقبولة الآن. النشاف الغربي ينطوي على نقل البقع البروتينية وتحديدها باستخدام أجسام مضادة محددة.

يوضح الشكل 7.7 تمثيل تخطيطي لجهاز النشاف النموذجي.

أولا النشاف الجنوبي:

تقنية النشاف الجنوبي هي أول عملية تنشيف بالحمض النووي تم تطويرها في عام 1975 بواسطة Southern. تم وصفه في الشكل 7.8 ، ووصف بإيجاز.

يتم هضم الحمض النووي الجيني المعزول من الخلايا / الأنسجة بواحد أو أكثر من إنزيمات التقييد. يتم تحميل هذا الخليط في بئر في هلام الاغاروز أو بولي أكريلاميد ثم تعريضه لرحلان كهربائي. يهاجر الحمض النووي ، كونه سالبًا ، نحو القطب الموجب (القطب الموجب الشحنة) ، حيث تتحرك شظايا الحمض النووي الأصغر بشكل أسرع.

يتم تغيير طبيعة جزيئات الحمض النووي المفصولة عن طريق التعرض لقلوي معتدل ويتم نقلها إلى نيتروسليلوز أو ورق نايلون. ينتج عن هذا نسخة طبق الأصل من نمط أجزاء الحمض النووي الموجودة على الجل. يمكن تلدين الحمض النووي على الورق عند التعرض للحرارة (80 درجة مئوية). ثم يتم تعريض ورق النيتروسليلوز أو النايلون إلى تحقيقات (كدنا) المسمى. يتم تهجين هذه المجسات مع جزيئات الحمض النووي التكميلية على الورق. يتم تعريض الورق بعد الغسيل الشامل لفيلم الأشعة السينية لتطوير صورة الأشعة السينية. يكشف هذا عن نطاقات محددة تتوافق مع شظايا الحمض النووي التي يتعرف عليها مسبار (كدنا).

العوامل المؤثرة على النشاف الجنوبي:

1. الشروط الصارمة (التحكم في الصرامة):

يشير التشدد إلى الخصوصية التي يتم من خلالها الكشف عن تسلسل هدف DNA معين بواسطة المسبار. وبالتالي ، في ظل الظروف الصارمة العالية (درجة الحرارة المرتفعة وتركيز الملح المنخفض) فقط سلاسل الحمض النووي التكميلية تمامًا هي التي سترتبط وتهجن.

ومع ذلك ، فإن الشروط الصارمة المنخفضة ستسمح بتهجين المتواليات المتطابقة جزئيًا. لذلك ، فإن التحكم في الصرامة ضروري للغاية للكشف المحدد عن جزيئات الحمض النووي في النشاف الجنوبي.من خلال التحكم الجيد في الصرامة ، أصبح من الممكن الآن اكتشاف جزيء DNA مع اختلاف زوج أساسي واحد فقط.

2. أغشية لنقل اللطخة:

في السنوات الأولى ، تم استخدام النيتروسليلوز لتثبيت جزيئات الحمض النووي أثناء نقل اللطخة. عيب النيتروسليلوز هو أنه هش ويجب التعامل معه بعناية. في السنوات الأخيرة ، تستخدم معظم المعامل أغشية النايلون لأنها تمتلك قوة شد عالية وقدرة ربط أفضل للأحماض النووية.

تطبيقات النشاف الجنوبي:

تقنية النشاف الجنوبي محددة وحساسة للغاية ، على الرغم من أنها تقنية بسيطة.

يتم سرد بعض التطبيقات:

أ. إنها طريقة لا تقدر بثمن في تحليل الجينات.

ب. مهم لتأكيد نتائج استنساخ الحمض النووي.

ج. مفيد لرسم خرائط مواقع التقييد حول تسلسل جيني نسخة واحدة.

د. يطبق جنائياً لاكتشاف الكميات الدقيقة من الحمض النووي (لتحديد الأبوة واللصوص والمغتصبين وما إلى ذلك).

ه. مفيد للغاية في تحديد تعدد أشكال طول جزء القيد (RFLP) المرتبط بالظروف المرضية.

F. يمكن استخدام قطع الحمض النووي من نوع واحد (مثل الإنسان) لاكتشاف جزيئات الحمض النووي من الأنواع ذات الصلة (مثل الشمبانزي والبقرة). يشار إلى هذه التقنية باسم Zoo-blotting.

II. النشاف الشمالي:

النشاف الشمالي هو تقنية التحديد الدقيق لجزيئات الحمض النووي الريبي. الإجراء المتبع مشابه تقريبًا للإجراء الموصوف في عملية النشاف الجنوبي وهو موضح في الشكل 7.9. تخضع جزيئات الحمض النووي الريبي للرحلان الكهربي ، متبوعًا بنقل اللطخة والتهجين والتصوير الشعاعي الذاتي.

لا ترتبط جزيئات الحمض النووي الريبي بسهولة بورق النيتروسليلوز أو أغشية النايلون. يتم إجراء نقل جزيئات الحمض النووي الريبي الموضعي باستخدام ورق تفاعلي كيميائيًا تم تحضيره بواسطة ديازوتيزيشن لأمينو بنزيلوكسيميثيل لإنشاء ورق ديازوبنزيلوكسيميثيل (DBM). يمكن أن يرتبط الحمض النووي الريبي بشكل تساهمي بورق DBM.

طور بعض العمال في وقت لاحق ظروفًا مناسبة لطمس أشرطة الحمض النووي الريبي على ورق النيتروسليلوز ، وتعديل أغشية النايلون. تستخدم هذه الآن على نطاق واسع في نشاف الحمض النووي الريبي. تم إيقاف استخدام أوراق DBM تقريبًا. تتهجين جزيئات الحمض النووي الريبي المنقولة بالبقع مع مجسات الحمض النووي التي يمكن اكتشافها بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي.

النشاف الشمالي هو نظريًا تقنية جيدة لتحديد عدد الجينات (من خلال mRNA) الموجودة في DNA معين. لكن هذا ليس عمليًا حقًا لأن كل جين قد يؤدي إلى نسختين أو أكثر من نسخ الحمض النووي الريبي. عيب آخر هو وجود exons و introns.

ثالثا. النشاف:

النشاف النقطي هو تعديل لتقنيات النشاف الجنوبية والشمالية الموصوفة أعلاه. في هذا النهج ، يتم رصد الأحماض النووية (DNA أو RNA) مباشرة على المرشحات ، ولا تتعرض للرحلان الكهربي. إجراء التهجين هو نفسه كما في تقنيات النشاف الأصلية. تقنية النشاف النقطي مفيدة بشكل خاص في الحصول على البيانات الكمية لتقييم التعبير الجيني.

رابعا. النشاف الغربي:

النشاف الغربي ينطوي على تحديد البروتينات. من المفيد جدًا فهم وظائف الحمض النووي ، خاصة أثناء التلاعب بالجينات. تتضمن تقنية النشاف الغربي نقل شرائط البروتين الكهربية من هلام بولي أكريلاميد إلى غشاء النايلون أو النيتروسليلوز. يمكن الكشف عن هذه البروتينات من خلال تفاعلات بروتينية - ليجند محددة. تستخدم الأجسام المضادة أو الليكتين بشكل شائع لهذا الغرض.

التصوير الشعاعي الذاتي:

التصوير الشعاعي الذاتي هو عملية توطين وتسجيل علامة إشعاعية داخل عينة صلبة ، مع إنتاج صورة في مستحلب فوتوغرافي. تتكون هذه المستحلبات من بلورات هاليد الفضة المعلقة في الجيلاتين. عندما يمر جسيم p أو شعاع من علامة إشعاعية عبر المستحلبات ، يتم تحويل أيونات الفضة إلى ذرات فضية معدنية. ينتج عن هذا تطوير صورة مرئية يمكن اكتشافها بسهولة.

تصوير الإشعاع الذاتي المباشر:

يعتبر التصوير الإشعاعي الذاتي المباشر مناسبًا بشكل مثالي للكشف عن النويدات المشعة الباعثة للضوء من ضعيفة إلى متوسطة القوة (3 ساعات ، 14 درجة مئوية ، 35 درجة مئوية). في هذه التقنية ، يتم وضع العينة في اتصال مباشر مع الفيلم. ينتج عن الانبعاثات المشعة تطور المناطق السوداء.

التصوير الشعاعي الذاتي غير المباشر:

للكشف عن جسيمات بيتا عالية الطاقة (مثل 32 P ، 125 لتر) ، التصوير الشعاعي الذاتي المباشر غير مناسب. هذا لأن هذه الانبعاثات تمر عبر الفيلم وبعده ، ويضيع جزء كبير من الطاقة. يعد التصوير الشعاعي الذاتي غير المباشر مفيدًا في الكشف عن جسيمات بيتا عالية الطاقة. في هذه التقنية ، يتم تحويل طاقة الجسيم β أولاً إلى ضوء بواسطة جهاز وميض ، والذي يقوم بعد ذلك بإصدار فوتونات عند التعرض لمستحلب فوتوغرافي.

تطبيقات التصوير الشعاعي الذاتي:

كما تم وصفه سابقًا ، يرتبط التصوير الشعاعي الذاتي ارتباطًا وثيقًا بتقنيات النشاف للكشف عن الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي والبروتينات.

المستعمرة واللويحات النشاف:

النشاف المستعمرة واللويحات هو عملية تهجين لتحديد وتنقية المستعمرات (مثل الحيوانات المستنسخة البكتيرية). تم توضيح هذه التقنية في الشكل 7.10 ، وتم وصفها بإيجاز أدناه.

يتم زراعة البكتيريا المرغوبة كمستعمرات على طبق أجار. عندما يتم تراكب ورق ترشيح النيتروسليلوز على لوحة أجار ، يتم نقل المستعمرات. يتم تثبيتها بشكل دائم على الورق بالحرارة. عند العلاج بالقلويات (NaOH) ، يتم تغيير طبيعة الخلايا والحمض النووي.

عندما تتعرض بصمات الحمض النووي لمجسات محددة (علامة إشعاعية) ، يحدث التهجين. يمكن تحديد موقع المركب الهجين واكتشافه بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي. يمكن استخدام استراتيجية مماثلة (موصوفة أعلاه للبكتيريا) لتحديد العاثيات وأجزاء مكتبات العاثيات.

تقنية # 5. تسلسل الحمض النووي:

تحديد تسلسل النوكليوتيدات في جزيء الحمض النووي هو المطلب الأساسي والأساسي في التكنولوجيا الحيوية. يعد تسلسل الحمض النووي مهمًا لفهم وظائف الجينات وأساس الاضطرابات الموروثة. علاوة على ذلك ، فإن استنساخ الحمض النووي والتلاعب الجيني يتطلبان دائمًا معرفة تسلسل النوكليوتيدات الدقيق.

تقنية ماكسام وجيلبرت:

تم تطوير أول تقنية لتسلسل الحمض النووي ، باستخدام الكواشف الكيميائية ، بواسطة Maxam and Gilbert (1977). يتم وصف هذه الطريقة بإيجاز أدناه (الشكل 7.11).

يتم تمييز خيط من مصدر الحمض النووي في أحد طرفيه بـ 32 P. ثم يتم فصل خيوط الحمض النووي. يتم توزيع الحمض النووي المسمى في أربع عينات (في أنابيب منفصلة). تخضع كل عينة للعلاج بمادة كيميائية تدمر على وجه التحديد قاعدة (G ، C) أو قاعدتين (A + G ، T + C) في الحمض النووي. وبالتالي ، يتم هضم خيوط الحمض النووي جزئيًا في أربع عينات في المواقع G و A + G و T + C و C. ينتج عن ذلك تكوين سلسلة من الأجزاء ذات العلامات ذات الأطوال المتفاوتة.

يعتمد الطول الفعلي للجزء على الموقع الذي يتم فيه تدمير القاعدة من النهاية المسمى. وبالتالي ، على سبيل المثال ، إذا كانت هناك مخلفات C في المواضع 4 و 7 و 10 بعيدًا عن النهاية المسمى ، فإن معالجة الحمض النووي التي تدمر C على وجه التحديد ستعطي قطعًا مشقوقة بطول 3 و 6 و 9 قواعد. تخضع شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها في الأنابيب الأربعة لفرز كهربائي جنبًا إلى جنب ويتم الكشف عنها بواسطة التصوير الشعاعي التلقائي. يمكن بناء تسلسل القواعد في الحمض النووي من النطاقات الموجودة على الرحلان الكهربائي.

طريقة ديوكسينوكليوتيد:

حاليًا ، التقنية المفضلة لتحديد تسلسل النوكليوتيدات في الحمض النووي هي تلك التي طورها سانجر (1980). يُشار إلى هذا الإجراء الأنزيمي عادةً باسم طريقة ثنائي ديوكسينوكليوتيد أو طريقة إنهاء السلسلة (ملاحظة: فاز فريدريك سانجر بجائزة نوبل مرتين ، مرة لتحديد بنية البروتين ، والأنسولين للمرة الثانية لتسلسل النيوكليوتيدات في فيروس الحمض النووي الريبي).

ثنائي ديوكسينوكليوتيد عبارة عن جزيء كيميائي مصنوع في المختبر يفتقر إلى مجموعة الهيدروكسيل في كل من 2 & # 8242 و 3 & # 8242 كربون من السكر (الشكل 7.12). هذا على النقيض من ديوكسي ريبونوكليوتيد الطبيعي الذي يمتلك في 3 & # 8242 مجموعة هيدروكسيل على السكر.

دور إنهاء ديوكسينوكليوتيد:

في العملية الطبيعية لتكرار الحمض النووي ، يتم ربط ثلاثي فوسفات النوكليوزيد الوارد بمجموعة 5 & # 8242-فوسفات بمجموعة 3 & # 8242-هيدروكسيل من النوكليوتيدات الأخيرة من سلسلة النمو عندما يتم دمج ثنائي ديوكسينوكليوتيد في سلسلة النمو ، لا يحدث مزيد من النسخ المتماثل. هذا لأن ثنائي ديوكسينوكليوتيد ، الذي يفتقر إلى مجموعة 3 & # 8242-هيدروكسيل ، لا يمكن أن يشكل رابطة فسفودايستر وبالتالي ينتهي تخليق الحمض النووي.

طريقة التسلسل:

تم وصف عملية تسلسل الحمض النووي بطريقة ديوكسينوكليوتيد بإيجاز. يتم اختيار الحمض النووي أحادي الخيط المراد تسلسله كقالب. يتم إرفاقه بطبقة أولية (طول قصير من أليغنوكليوتيد الحمض النووي) مكمل لجزء صغير من القالب. تبدأ مجموعة 3 & # 8242-hydroxyl من التمهيدي تخليق الحمض النووي الجديد.

يتم تصنيع الحمض النووي في أربعة أنابيب تفاعل. يحتوي كل أنبوب على الحمض النووي المجهز ، ووحدة Klenow الفرعية (الجزء الأكبر من بوليميريز الحمض النووي للإشريكية القولونية) ، وأربعة ديوكسي ريبونوكليوتيدات (ddATP ، ddCTP ، ddGTP أو ddTTP). من الضروري وضع علامة إشعاعية (مع 32 P) التمهيدي أو واحد من deoxyribonucleotides.

مع اكتمال تخليق الحمض النووي الجديد ، يحتوي كل أنبوب على أجزاء من الحمض النووي ذات أطوال متفاوتة مرتبطة بالبادئة. دعونا ننظر في أول أنبوب رد فعل مع ديوكسيادينوسين (ddATP). في هذا الأنبوب ، ينتهي تخليق الحمض النووي متى أدرجت السلسلة المتنامية ddA (مكمل لـ dT على حبلا القالب). لذلك ، سيحتوي هذا الأنبوب على سلسلة من شظايا الحمض النووي بأطوال مختلفة ، كل منها ينتهي بـ ddA. بطريقة مبتذلة ، بالنسبة لأنابيب التفاعل الثلاثة الأخرى ، يتوقف تخليق الحمض النووي حيث يتم دمج ثنائي ديوكسينوكليوتيدات المعينة.

تركيب شظايا الدنا الجديدة في الأنابيب الأربعة موضحة في الشكل 7.13.

يتم تغيير طبيعة قطع الحمض النووي لإنتاج خيوط مجانية مع علامة إشعاعية. يتم فصل العينات من كل أنبوب بواسطة بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام. تعمل تقنية الفصل هذه على حل قطع الحمض النووي ، والتي تختلف في الحجم حتى عن طريق نيوكليوتيد واحد. سيكون أقصر DNA هو الأسرع تحركًا في الرحلان الكهربائي.

يتم تحديد تسلسل القواعد في جزء من الحمض النووي عن طريق تحديد النطاقات الكهربية (ذات العلامات الإشعاعية) بواسطة التصوير الإشعاعي التلقائي. في الشكل 7.14 ، يظهر تسلسل جزء الحمض النووي المركب حديثًا والمكمل لقطعة الحمض النووي الأصلية.

من المعتاد قراءة النطاقات من أسفل إلى أعلى في اتجاه 5 & # 8242 إلى 3 & # 8242. من خلال ملاحظة ترتيب النطاقات أولاً C ، والثاني G ، والثالث T وما إلى ذلك ، يمكن تحديد تسلسل الحمض النووي بدقة. يمكن تحديد ما يصل إلى 350 تسلسلًا أساسيًا لجزء من الحمض النووي بوضوح باستخدام التصوير الشعاعي التلقائي.

تعديلات طريقة ثنائي ديوكسينوكليوتيد:

استبدال 32 P-radiolabel بـ 33 P أو 35 S يحسن حدة الصور الشعاعية التلقائية. إن بوليميراز الحمض النووي للبكتيريا المحبة للحرارة ، Thermus aquaticus (بدلاً من جزء Klenow من E. coli DNA polymerase I) أو شكل معدل من phage T7 DNA polymerase (Sequenase) يحسن التقنية.

حدود طريقة ديوكسينوكليوتيد:

هناك نوعان أساسيان من القيود في هذه التقنيات. الحاجة إلى قالب DNA أحادي الخيط واستخدام مادة أولية لتسلسلات غير معروفة. يمكن التغلب على هذه المشاكل باستخدام العاثية M13.

الجراثيم م13 باعتباره ناقل تسلسل الاستنساخ والحمض النووي:

دورة حياة العاثية M.13 7.15. يحتوي هذا الفيروس على DNA دائري أحادي السلسلة. عندما تصيب الإشريكية القولونية ، يتم تصنيع الحمض النووي مزدوج الشريطة وهو شكل مكرر (RF). يتكرر RF DNA حتى يتم إنتاج 50-100 نسخة. الآن يتم تغيير طريقة النسخ المتماثل لتوليف جزيئات الحمض النووي أحادية الجديلة (ssDNA).

كل من ssDNA للعاثية M.13 مغلف بالبروتين. ثم تمر جسيمات الملتهمة بحرية عبر الغشاء ليتم إطلاقها. وهكذا ، فإن خلايا الإشريكية القولونية مصابة بـ M.13 يمكن أن تفرز باستمرار الجزيئات المعدية ، دون الخضوع لتحلل.

الجراثيم م13 يتم استخدامه باعتباره ناقل الاستنساخ وتسلسل الحمض النووي. هذا ممكن لأنه يمكن عزل النموذج التكراري مزدوج الشريطة واستخدامه كبلازميد ، في حين يمكن استخدام الحمض النووي أحادي السلسلة كقالب لتسلسل الحمض النووي. عادة ، يمكن استنساخ الحمض النووي المستهدف الذي يحتوي على أقل من 500 زوج قاعدي وتسلسله في الملتهمة M.13.

هذه الأشكال RF مزدوجة تقطعت بهم السبل من فج M13 يتم عزلها ويتم إدخال الحمض النووي المراد استنساخه. يتم إرجاع هذه العاثية التي يمكن مقارنتها بالبلازميد إلى الإشريكية القولونية. (يمكن فحص امتصاص العاثيات المزودة بإدخالات باستخدام علامة lac Z).

عندما تخضع العاثية لدورة حياتها (الشكل 7.15) ، يتم استرداد جزيئات الحمض النووي أحادية الجديلة من الحمض النووي المُدخل. يمكن تحديد تسلسل الحمض النووي أحادي الجديلة بطريقة ثنائي ديوكسينوكليوتيد. يعتبر التمهيدي المستخدم مكملًا لجزء من الملتهمة M13 DNA وهو قريب من نقطة الإدراج. لذلك ، يمكن استخدام أساس واحد لجزيئات DNA المختلفة التي يتم إدخالها. لتحديد تسلسل DNA أكبر (≤ 2000 نقطة أساس) ، من الضروري استنساخ قطع مختلفة من الحمض النووي. من تسلسل هذه الأجزاء (متداخلة بشكل متكرر) ، يمكن بناء التسلسل النهائي.

تسلسل الحمض النووي عن طريق المشي التمهيدي:

تم استخدام تقنية المشي التمهيدي أو تقنية التمديد التمهيدي لتحديد تسلسل القطع الطويلة من الحمض النووي (≥ 5000 نقطة أساس). في هذه الطريقة ، يتم تلدين الحمض النووي المستنسخ البلازميد المحتوي على الحمض النووي المستهدف باستخدام مادة أولية (أوليغنوكليوتيد اصطناعي). التمهيدي يرتبط بالحمض النووي القريب من الحمض النووي المُدخَل. الآن يتم تسلسل الحمض النووي المستهدف (250-350 نيوكليوتيدات) ، في أغلب الأحيان بطريقة ثنائي ديوكسينوكليوتيد (الموصوفة بالفعل).

من التسلسل الأساسي لجزء من الحمض النووي المستهدف (تم تحديده في الجولة الأولى) ، يتم اختيار التمهيدي الثاني. وهو عبارة عن أليغنوكليوتيد يرتبط بمنطقة 300 نيوكليوتيد تقريبًا بعيدًا عن الارتباط التمهيدي الأول. يمكن ترتيب الجزء التالي من الحمض النووي المستهدف بواسطة 250-300 قاعدة أخرى (الجولة الثانية).

سيكون هذا التسلسل مفيدًا في اختيار التمهيدي الثالث وتحديد القواعد التالية 250-350 (الجولة الثالثة). بهذه الطريقة ، يستمر المشي التمهيدي حتى يتم تسلسل الحمض النووي الهدف الكامل. ثلاث جولات من تقنية المشي التمهيدي لتسلسل الحمض النووي موضحة في الشكل 7.16.

المشي الكروموسوم في تسلسل الحمض النووي:

المشي الكروموسوم هو طريقة لتسلسل قواعد الحمض النووي التي يتم فيها تحليل الكروموسوم عن طريق مد طرف واحد للوصول إلى الطرف الآخر. تتضمن هذه التقنية بشكل أساسي التحرك بشكل منهجي على طول الكروموسوم من موقع معروف إلى مكان غير معروف ، وبالتالي تحديد تسلسل الحمض النووي. الطريقة المعتمدة في المشي الكروموسومي موضحة في الشكل 7.17 ، وموصوفة بإيجاز أدناه.

يمكن تسلسل جزء من الحمض النووي يحتوي على ما يقرب من 40000 زوج قاعدي. للبدء بعلامة تستخدم لتحديد مسبار الجين المناسب (من مكتبة مسبار الحمض النووي). يجب أن يحتوي هذا المسبار الجيني على قسم من الزوج الأساسي مطابق للأزواج الأساسية للعلامة. سيتم تهجين هذا المسبار الأولي فقط مع الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على الجزء A.

يمكن عزل هذا الجزء A واستنساخه واستخدامه كمسبار لاكتشاف الشظية B. يتم تكرار إجراء الاستنساخ والتحقيق مع الشظايا مرارًا وتكرارًا حتى يتم تهجين الجزء D مع الجزء E. كما هو واضح من الوصف أعلاه ، يستخدم المشي الكروموسوم مجسات مشتقة من نهايات الحيوانات المستنسخة المتداخلة لتسهيل المشي جنبًا إلى جنب مع تسلسل الحمض النووي. في عملية هذه المسيرة ، يمكن تحديد تسلسل الجين المستهدف المطلوب.

قفز الكروموسوم:

تتمثل الإستراتيجية المحسّنة للمشي الكروموسومي في قفز الكروموسوم. يمكن القفز على العديد من مناطق الحمض النووي التي يصعب استنساخها عن طريق المشي. يتضمن الإجراء تعميم الأجزاء الجينومية الكبيرة الناتجة عن هضم نوكليازات داخلية. ويتبع ذلك استنساخ المنطقة مما يؤدي إلى خفض إغلاق الجزء. من خلال هذا النهج ، يمكن تجميع تسلسلات الحمض النووي الموجودة في أماكن بعيدة معًا واستنساخها. يمكن بناء قفز الكروموسوم بهذه الطريقة واستخدامه في المشي لمسافات طويلة بالكروموسوم.

تطبيقات المشي والقفز على الكروموسومات:

تم التعرف على الجين المسؤول عن مرض التليف الكيسي (CF) عن طريق المشي والقفز على الكروموسومات. يسمى جين البروتين المسؤول عن التليف الكيسي بمنظم توصيل الغشاء العابر للتليف الكيسي (CFTR) ويقع على الذراع الطويلة للكروموسوم 7.

تسلسل الحمض النووي الآلي:

يتم تنفيذ تسلسل الحمض النووي في السنوات الأخيرة بواسطة مُسلسِل الحمض النووي الآلي. في هذه التقنية ، يتم ربط العلامات الفلورية بالنيوكليوتيدات المتسلسلة (ثنائي ديوكسينوكليوتيدات). يتم دمج هذه العلامة في جزيئات الحمض النووي ، مع إنهاء تخليق الخيوط الجديدة.

يتم استخدام أربعة أصباغ فلورية مختلفة لتحديد تفاعلات إنهاء التسلسل في هلام التسلسل. يتم فصل نطاقات الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي ويتم الكشف عنها بواسطة مضانها. في الآونة الأخيرة ، يتم استخدام أربعة أصباغ تظهر امتصاصًا قويًا في الليزر للتسلسل الآلي.

مزايا التسلسل الآلي:

إنها تقنية سريعة ودقيقة. يمكن لمسلسل الحمض النووي الآلي تسلسل بدقة تصل إلى 100،00 نيوكليوتيد في اليوم. يجب ألا تزيد التكلفة عن 0.2 لكل نوكليوتيد. تم استخدام تسلسل الحمض النووي الآلي بنجاح في مشروع الجينوم البشري.

تقنية # 6. طرق بديلة لتسلسل الحمض النووي:

طورت بعض مجموعات الباحثين طرقًا بديلة لطريقة سانجر لتسلسل الحمض النووي. لسوء الحظ ، على الرغم من الإثارة الأولية ، اختفت معظم هذه الأساليب من المشهد. هناك على الأقل طريقتان واعدتان إلى حد ما لتسلسل الحمض النووي - التسلسل الحراري ، والرقائق الجينية (المصفوفات الدقيقة).

التسلسل الحراري:

التسلسل الحراري هو طريقة لتسلسل الحمض النووي تعتمد على مبدأ تحديد أي من القواعد الأربعة (A ، G ، C ، T) يتم دمجها في كل خطوة أثناء نسخ قالب DNA. في هذه التقنية ، ينسخ القالب بطريقة مباشرة إلى الأمام دون إضافة dideoxy- نيوكليوتيدات (ddNTPs).

عندما يتم تصنيع الخيط الجديد ، يتم الكشف عن الترتيب الذي يتم به دمج الديوكسينوكليوتيدات (dNTPs) ، ويمكن قراءة التسلسل أثناء استمرار التفاعل (الشكل 7.18). يصبح تحديد الإضافة القاعدية ممكنًا نظرًا لأن إضافة النيوكليوتيد تكون مصحوبة بإطلاق جزيء من البيروفوسفات. يمكن الكشف عن ذلك عن طريق تقنية التلألؤ الكيميائي.

في إجراء التسلسل الحراري ، تتم إضافة كل dNTP على حدة (وليس الأربعة معًا) ، جنبًا إلى جنب مع إنزيم نيوكليوتيدات. هذا الإنزيم يحلل dNTP إذا لم يتم دمجه في حبلا DNA المركب حديثًا. بمجرد دمج النوكليوتيدات المناسبة في خيط الدنا الجديد ، يتم تحرير جزيء بيروفوسفات.

يمكن تحويل هذا بواسطة إنزيم سلفوريلاز إلى وميض من الضوء (التلألؤ الكيميائي). من خلال إضافة كل dNTP على حدة ، واحدًا تلو الآخر ، يمكن اتباع ترتيب النيوكليوتيدات المضافة إلى خيط الحمض النووي المتنامي ، ويمكن تحديد التسلسل.

الكشف عن جزيء بيروفوسفات هو أساس تسلسل الحمض النووي ، ومن هنا جاء اسم التسلسل البيروفي. نظرًا لأن التسلسل الحراري لا يتطلب رحلانًا كهربائيًا أو أي تقنية أخرى لفصل أجزاء الحمض النووي ، فهو أسرع من تسلسل إنهاء السلسلة.

يتمثل القيد الرئيسي لتسلسل بايرو في أنه مناسب للكشف عن تسلسل حوالي 200 نيوكليوتيد. هذا أقل بكثير من طريقة سانجر. يتم إجراء العديد من التحسينات في التسلسل الحراري بحيث يمكن تسلسل جزيئات الحمض النووي الأطول بكثير. في الواقع ، يتوفر الآن نظام آلي لتسلسل بايرو.

رقائق الحمض النووي (المصفوفات الدقيقة):

رقائق الحمض النووي أو المصفوفات الدقيقة للحمض النووي هي تطورات حديثة لتسلسل الحمض النووي نتيجة للتقدم المحرز في الأتمتة والتصغير. تم تجميد عدد كبير من مجسات الحمض النووي ، كل واحد بتسلسل مختلف ، في مواضع محددة على السطح الصلب ، المكونة إما من النايلون أو الزجاج. يمكن أن تكون المجسات عبارة عن جزيئات DNA قصيرة مثل cDNAs أو oligo & shynucleotides الاصطناعية. لتحضير المصفوفات عالية الكثافة ، يتم تصنيع أليغنوكليوتيدات في الموقع على سطح الزجاج أو السيليكون. ينتج عن هذا شريحة قليلة النوكليوتيد بدلاً من شريحة DNA.

تقنية تسلسل الحمض النووي:

يمكن استخدام شريحة DNA تحمل مجموعة من قليل النوكليوتيدات المختلفة لتسلسل الحمض النووي. لهذا الغرض ، يتم تطبيق جزيء اختبار DNA المسمى الفلورسنت ، والذي سيتم تحديد تسلسله ، على الشريحة. يحدث التهجين بين التسلسلات التكميلية لجزيء اختبار DNA و oligonucleotides للرقاقة.

يمكن تحديد أوضاع هذه oligonucleotides المهجنة بواسطة الفحص المجهري (كنفوكل). يمثل كل أليغنوكليوتيد مهجن تسلسل 8 نيوكليوتيدات موجود في مسبار الحمض النووي. يمكن استنتاج تسلسل جزيء اختبار DNA من التداخلات بين متواليات قليلات النوكليوتيدات المهجنة (الشكل 7.19).

تطبيقات رقائق الحمض النووي:

كانت هناك العديد من النجاحات مع هذه التكنولوجيا الجديدة نسبيًا لرقائق الحمض النووي. بعضها مدرج في القائمة.

أ. تحديد الجينات المسؤولة عن تطور الجهاز العصبي.

ب. الكشف عن الجينات المسؤولة عن الأمراض الالتهابية.

ج. بناء المصفوفات الدقيقة لكل جين في جينوم الإشريكية القولونية ، وتقريبًا جميع جينات الخميرة Saccharomyces cerevisiae.

د. تم تحديد التعبير عن العديد من الجينات في بدائيات النوى.

ه. كشف وفحص تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs)

F. الكشف السريع عن الكائنات الحية الدقيقة لرصد البيئة.

مستقبل رقائق الحمض النووي:

يتمثل القيد الرئيسي لرقائق الحمض النووي في الوقت الحالي في عدم توفر صفائف الجينوم الكاملة لحقيقيات النوى الأعلى ، بما في ذلك البشر. ومن المتوقع أن تتوافر رقائق الحمض النووي هذه في غضون السنوات القليلة القادمة. سيساعد هذا علماء التكنولوجيا الحيوية على التقاط اللقطات الوظيفية للجينوم أثناء العمل من أجل الكائنات الحية الأعلى.

تقنية # 7. التوليف الكيميائي للحمض النووي:

أتاح التقدم في التقنيات المختبرية إمكانية تصنيع الحمض النووي كيميائيًا في فترة قصيرة. وبالتالي ، يمكن إنتاج أليغنوكليوتيدات لنحو 100 قاعدة في حوالي 10 ساعات. ساهم التوليف المختبري للحمض النووي (مؤخرًا باستخدام مُصنِّعات الدنا أو آلات الجينات) مع تسلسل محدد من النيوكليوتيدات ، بسرعة وبتكلفة زهيدة ، في الاستنساخ بشكل كبير. يعتمد التركيب الكيميائي للحمض النووي على القدرة على حماية الأطراف التفاعلية -5 & # 8242 و -3 & # 8242 عن طريق منعها (حمايتها).

طريقة الفوسفوراميديت:

طريقة الفوسفوراميديت هي التقنية المختارة ، المستخدمة حاليًا ، لتخليق الحمض النووي. يتم التوليف على نظام المرحلة الصلبة ، أي عن طريق ربط حبلا الحمض النووي المتنامي بدعامة صلبة ، في وعاء التفاعل. الإجراء يتضمن المراحل التالية.

1. ارتباط النيوكليوزيد بالدعم القوي:

يتم توصيل النيوكليوزيد الأولي (القاعدة + السكر) عند الطرف 3 & # 8242 بدعامة صلبة خاملة ، عادةً إلى خرز زجاجي ذات مسام موحدة ، يشار إليها باسم خرز زجاج المسام المتحكم به (CPG).

2. تحضير الفسفوراميديت:

لكل قاعدة من القواعد الأربعة (A و G و C و T) ، يمكن تصنيع الفوسفوراميديت. يتم تحقيق ذلك عن طريق ربط مجموعة dimethoxytrityl (DMT) بمجموعة 5 & # 8242-hydroxyl من deoxyribose ومجموعة diisopropylamine بمجموعة 3 & # 8242-phosphite من النيوكليوزيد. تحمي بقايا الميثيل مجموعة الفوسفيت 3 & # 8242. يوضح الشكل 7.20 التركيب العام للفوسفوراميديت.

سلائف نيوكليوتيد (أي فوسفوراميديت) مع أزواج 3 & # 8242-فوسفور مع 5 & # 8242-هيدروكسيل من النوكليوزيد الأولي المرتبط بخرز CPG.

4 - الأكسدة وإزالة الحماية:

يتأكسد الفوسفات ثلاثي التكافؤ غير المستقر إلى فوسفات مستقر خماسي التكافؤ. يتبع ذلك إزالة DMT الذي يحمي (إزالة الحماية) مجموعة 5-hydroxyl. للراحة ، تم اعتبار الأكسدة وإزالة الحماية معًا في الشكل 7.21 أيضًا ، وهما في الواقع تفاعلان مستقلان. تتم الآن إضافة سلائف نيوكليوتيد أخرى ويتم تكرار التفاعلات الموصوفة في الخطوتين 3 و 4.

الاقتران والأكسدة وإزالة الحماية هي الخطوات الثلاث في التفاعل الدوري لتخليق الحمض النووي بطريقة الفوسفوراميديت. تتكرر الدورات مرارًا وتكرارًا لتكوين الحمض النووي المطلوب. في النهاية ، تتم إزالة قليل النوكليوتيد المكتمل من دعامة الزجاج ويتم شق المجموعات التي تحمي القواعد والفوسفات.

تطبيقات قليلات النوكليوتيدات المركبة:

تمتلك أليغنوكليوتيدات المُصنَّعة كيميائيًا عددًا من الاستخدامات في التكنولوجيا الحيوية.

1. الوصلات والمحولات هي أليغنوكليوتيدات شائعة الاستخدام في تحضير الحمض النووي المؤتلف

2. يمكن استخدام الدنا المركب كيميائيًا مع تسلسل معروف لتخليق البروتينات / عديد الببتيدات.

3. يمكن تصنيع مجسات الحمض النووي ، وخاصة مجسات قليل النوكليوتيد أحادي الخيط ، في المختبر. يعتمد هذا على تسلسل كودون mRNA والذي بدوره يعتمد على تسلسل الأحماض الأمينية.

4. تُستخدم أليغنوكليوتيدات أحادية الجديلة كطعامات أولية في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).

5. للطفرات في المختبر ، يتم استخدام أليغنوكليوتيدات أحادية السلسلة.

توليف الجينات:

الجين عبارة عن دنا مزدوج الشريطة يمكن تصنيع اثنين من النكليوتيدات التكميلية أحادية السلسلة ، بشكل منفصل ، وعند التلدين فإنها تشكل خيوط مزدوجة. يمكن تحقيق ذلك بسهولة بالنسبة للجينات الأصغر (60-90 زوجًا أساسيًا). ومع ذلك ، فإن تركيب الجينات الأطول (& gt 300 bp) يرتبط ببعض الصعوبات العملية.

هذا يرجع أساسًا إلى حقيقة أن كفاءة الاقتران للتخليق الكيميائي للحمض النووي لا تصل أبدًا إلى 100٪. للتغلب على هذه المشكلة ، يتم تصنيع وتجميع أجزاء صغيرة من الحمض النووي (الشكل 7.22). يتم ختم النكات باستخدام T4 DNA ligase.

هناك طريقة أخرى لتركيب الجينات وهي إنتاج أليغنوكليوتيدات متداخلة تحتوي على فجوات كبيرة عند التلدين. يمكن سد هذه الفجوات بالتوليف الأنزيمي للحمض النووي بواسطة بوليميراز الدنا - أثناء توليف الجينات في المختبر ، يجب توخي أقصى درجات الحذر لمعرفة أن النيوكليوتيدات في التسلسل الصحيح (يمكن التحقق من ذلك عن طريق تقنية تسلسل الحمض النووي). كان العالم الهندي المولد والأمريكي هار جوبيند خورانا وزملاؤه أول من صنع جين الحمض النووي الريبي (tRNA) كامل لخميرة ألانيل الحمض الريبي النووي النقال في عام 1972.


أفضل 4 أدوات في الهندسة الوراثية

يتضمن إنشاء مكتبة الجينوم استنساخ الحمض النووي الجيني الكامل. لذلك ، فإن مكتبة الجينوم عبارة عن مجموعة من جزيء الحمض النووي المؤتلف (البلازميدات ، العاثيات) بحيث يمثل المجموع الكلي لإدراج الحمض النووي في هذه المجموعة الجينوم الكامل للكائن الحي. اعتمادًا على حجم الجينوم ، بدائية النواة أو حقيقية النواة ، يمكن اختيار ناقل. بهذه الطريقة يمكن تقطيع الجينوم بأكمله إلى قطع واستنساخه في ناقلات أو عن طريق تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن الإشارة إلى هذا باسم الاستنساخ الجيني.

يتضمن تكوين مكتبة الجينوم الخطوات التالية:

1. عزل الكروموسومات DNA

2. يتم تجزئة الحمض النووي عن طريق القص الميكانيكي أو الصوتنة أو باستخدام نوكلياز داخلي مناسب للهضم الجزئي للحمض النووي (الشكل 15.1). يولد القص الميكانيكي نهايات حادة بينما ينتج نوكلياز داخلي نهايات متماسكة. يتم تجنب الهضم الكامل لأنه يولد شظايا غير متجانسة في الحجم بحيث لا يمكن استخدامها.

3. ربط شظايا الحمض النووي - يخضع الهضم الجزئي للحمض النووي الجيني للرحلان الكهربي لجيل الاغاروز لفصل الأجزاء بالحجم المطلوب. يتم التخلص من شظايا الحجم المناسب من الجل. ثم يتم إدخال هذه الأجزاء في ناقل مناسب. يتم قطع هذه النواقل بنفس إنزيمات التقييد. بعد ذلك يتم ربط شظايا الحمض النووي في ناقل باستخدام DNA ligase (الشكل 15.2). من خلال هذه التقنية يمكن إدخال حوالي 25 كيلو بايت من شظايا الحمض النووي في النواقل.

4. تحديد الاستنساخ المطلوب - تحديد المستعمرة البكتيرية التي تحتوي على جزء الحمض النووي المطلوب عن طريق استخدام مسبار تهجين مناسب في تهجين المستعمرة. قد يكون المسبار هو mRNA للجين ، أو cDNA من mRNA الخاص به ، أو جين متماثل من كائن حي آخر ، أو oligonucleotide اصطناعي يمثل تسلسل جزء من جزء الجين / DNA المطلوب. من أجل الكشف عن التهجين ، يجب تسمية المسبار عادة بنظير مشع.

نظم النواقل البديلة لصنع مكتبة الجينوم:

بالنسبة إلى بدائيات النوى (الجينومات الأصغر) قادرة على تكوين مكتبات جينية في البلازميدات. يُدرج البلازميد بشكل طبيعي -5-10 كيلو بايت ، لذلك تحتاج فقط إلى بضعة آلاف من المؤتلف لمكتبة تمثيلية. حقيقيات النوى (جينومات أكبر) ، تحتاج حقًا إلى نواقل يمكنها حمل شظايا DNA أكبر بكثير (الجدول 15.1).

يُظهر Bacteriophage lambda عدوى أكثر فاعلية للإشريكية القولونية مما يمكن تحقيقه عن طريق التحول البلازميد. يرتبط Phage lambda بالمستقبلات الموجودة على سطح الإشريكية القولونية ويحقن الحمض النووي. تعد الإصابة بلمدا أكثر فاعلية من التحول البلازميدي ويمكن الحصول عليها # 8211

10 9 لويحات لكل ميكروجرام من الحمض النووي ، مقابل

10 6 مستعمرات لكل ميكروجرام من DNA البلازميد.

عندما تتلاشى الخلايا البكتيرية ، تتشكل لوحة ، والتي تنتشر مع إصابة المزيد من الخلايا بالعدوى. تحتوي اللويحة على الجسيمات الفيروسية المعدية أو الفيروسات وكل منها يمثل استنساخًا فرديًا من لامدا (على غرار مستعمرة بكتيرية تمثل استنساخ بلازميد فردي).

المظهر هو دائرة واضحة في & # 8216 كلاود & # 8217 من الخلايا البكتيرية (البكتيريا & # 8216lawn & # 8217) (الشكل 15.3). إذا حضنت لفترات طويلة ، ستستمر هذه الدوائر في النمو (تحتوي على المزيد والمزيد من الجزيئات الفيروسية) وتنتشر حتى يتم القضاء على جميع الخلايا البكتيرية. لاختيار نسخة واحدة من لامدا ، تكون اللوحة & # 8216 مثقوبة & # 8217 من لوحة أجار وتخزينها في محلول قابض. يمكن بعد ذلك استخدام هذا لإصابة المزيد من الخلايا البكتيرية ولتكرار المزيد من الحمض النووي لامدا المؤتلف.

نواقل لعمل مكتبات ذات إدخالات أكبر:

تُستخدم مكتبات Cosmid لاستنساخ الجينات ذات الإنترونات الكبيرة ولتسلسل أجزاء أكبر من الجينوم. نواقل Cosmid هي هجينة من البلازميد والعاثية lambda λ DNA (صغير

5 كيلو بايت بلازميد يحتوي على أصل البلازميد للتكاثر (أوري) ، وجين مقاوم للمضادات الحيوية مثل أمبير وموقع تقييد مناسب للاستنساخ جنبًا إلى جنب مع تسلسل COS من phage DNA). بسبب تسلسل COS ، يمكن تعبئة المؤتلفات الكونية في جزيئات فيروسية (مما يسمح بتحويل عالي الكفاءة).

نظرًا لأن معظم المكتبات الجينومية في ناقل كوزميد ، فقد تم التخلص من DNA DNA ويمكن استبداله بالحمض النووي ذي الأهمية ، طالما أنه لا يتجاوز حد 50 كيلو بايت للتعبئة في الرأس الفيروسي. أحجام الإدخال من 35-45 كيلو بايت. نظرًا لأن الحمض النووي المؤتلف لا يشفر أي بروتينات لامدا ، فإن الكوسميدات لا يشكلون جزيئات فيروسية (أو لويحات) بل يشكلون بلازميدات دائرية كبيرة ويمكن اختيار المستعمرات التي تنشأ على ألواح المضادات الحيوية ، مثل غيرها من محولات DNA البلازميد.

يمكن التلاعب بالمستنسخات الكونية بطريقة مماثلة ، مما يتيح سهولة عزل البلازميد. نظرًا لأن العديد من الجينات حقيقية النواة بترتيب 30 & # 8211 40 كيلو بايت ، تزداد احتمالية الحصول على استنساخ DNA يحتوي على التسلسل الجيني بأكمله بشكل ملحوظ عند استخدام مكتبة cosmid.

تُستخدم مكتبات YAC لاستنساخ أجزاء كبيرة جدًا من الحمض النووي (أكثر من 1 ميجا بايت) ، وهي مفيدة لاستنساخ الجينات الكبيرة (مثل جين التليف الكيسي 250 كيلو بايت) ولإنشاء مكتبات من النسخ الكبيرة المتداخلة ، مثل الكروموسومات الفردية المعزولة من الكائنات الحية (مكتبات الكروموسومات). تم استخدام هذه على نطاق واسع لرسم خرائط جينومات الكائنات الحية المعقدة (مثل الإنسان العاقل).

YACs عبارة عن كروموسومات خميرة اصطناعية وهجينة من DNA البلازميد البكتيري و DNA الخميرة. تم دمج المكونات المطلوبة لتكرار / فصل كروموسومات الخميرة الطبيعية مع DNA E. coli plasmid. تزرع YACs في الخميرة Saccharomomyces cerevesiae وبالتالي تحتوي على علامات قابلة للتحديد مناسبة للنظام المضيف. بدلاً من اختيار المضادات الحيوية ، تمكّن الواسمات التي يمكن تحديدها من الخميرة من نمو المحول على وسائط انتقائية تفتقر إلى مغذيات محددة. (غير المتحولون غير قادرين على النمو). سلالات الخميرة المستخدمة هي مساعدة التغذية & # 8211 أي أنها غير قادرة على صنع مركب معين.

على سبيل المثال ، يمكن لطفرات Trpl & # 8217t أن تصنع التربتوفان ، لذلك لا يمكن أن تنمو إلا على الوسائط المكملة بالتريبتوفان. إذا تم تحويل السلالة الطافرة باستخدام YAC الذي يحتوي على جين Trpl سليم ، فإن هذا سيعوض الجين غير النشط (المكمل) وتكون الخلية المنقولة قادرة على النمو على الوسائط التي تفتقر إلى التربتوفان.

لم يعد يتم استخدام YACs على نطاق واسع بعد الآن بسبب المشاكل المتأصلة. على سبيل المثال ، يمكن أن تحتوي استنساخ YAC على أجزاء غير متجاورة من الجينوم. هذا يعني أنه يمكن دمج 2 أو أكثر من شظايا الحمض النووي من أجزاء منفصلة من الجينوم في YAC فردي (لأنها قادرة على دعم إدخالات كبيرة إلى حد ما). المشكلة الثانية هي أن YACs غير مستقرة وكثيراً ما تفقد أجزاء من الحمض النووي أثناء التكاثر.

تُستخدم مكتبات BAC أيضًا في استنساخ أجزاء كبيرة جدًا من الحمض النووي ، وكانت مفيدة بشكل خاص في تسلسل الجينومات الكبيرة. BACs هي كروموسومات اصطناعية بكتيرية ، وتعتمد على بلازميد بكتيري كبير يحدث بشكل طبيعي ، وهو العامل F. يمكن أن تستوعب نواقل BAC إدخالات الحمض النووي حتى 300 كيلو بايت ، ولا تزال محترمة إلى حد ما عند الحاجة إلى استنساخ جينات كبيرة أو تعيين الجينومات المعقدة وتسلسلها. تتمتع BACs بالعديد من المزايا مقارنة بـ YACs ، مما يعني أنها تُستخدم على نطاق واسع الآن. تم ترتيب معظم الجينوم البشري باستخدام BAC بدلاً من استنساخ YAC.

أداة # 2. [كدنا] و [كدنا]المكتبة:

الحمض النووي التكميلي (cDNA) هو DNA اصطناعي مصنوع من mRNA باستخدام إنزيم خاص يسمى النسخ العكسي (بوليميراز DNA المعتمد على RNA الذي اكتشفه Temin و Baltimore في عام 1970). في الأصل تم عزل هذا الإنزيم من فيروسات reterovirus. يقوم هذا الإنزيم بتفاعلات مماثلة مثل بوليميريز الحمض النووي ويتطلب برايمر مع طرف حر 3 & # 8242 OH. باستخدام mRNA كقالب ، يقوم إنزيم النسخ العكسي بتركيب جزيء DNA واحد مجدول يمكن استخدامه بعد ذلك كقالب للحمض النووي مزدوج الشريطة (الشكل 15.4). نظرًا لأنه مصنوع من mRNA ، فإن (كدنا) يخلو من كل من التسلسل التنظيمي المنبع والمصب ومن الإنترونات.

هذا يعني أنه يمكن ترجمة cDNA من حقيقيات النوى إلى بروتين وظيفي في البكتيريا ، وهي ميزة مهمة عند التعبير عن جينات حقيقية النواة في المضيف البكتيري. يتم تهجين سلسلة oligo (dT) القصيرة إلى ذيل poly (A) من حبلا mRNA. يعمل جزء oligo (dT) كتمهيدي لعمل النسخ العكسي ، والذي يستخدم mRNA كقالب لتخليق حبلا cDNA. ينتهي [كدنا] الناتج في حلقة دبوس الشعر. عندما يتحلل mRNA ، من هجين RNA-DNA ، عن طريق العلاج مع NaOH أو RNase H ، يتم ترك قطعة قصيرة من RNA. تصبح حلقة دبوس الشعر هذه أساسًا لبوليميراز الحمض النووي I ، والذي يكمل خيط الحمض النووي المقترن.

ثم يتم شق الحلقة بواسطة نوكلياز SI (الذي يعمل فقط على الحلقة المفردة المجدولة) لإنتاج جزيء cDNA مزدوج تقطعت به السبل. يمكن إدخال هذا الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل في نواقل البلازميد ، والكونسميد ، والعاثية لامدا ، وناقلات الاستنساخ عن طريق الربط غير الحاد.

مكتبة (كدنا) هي مجموعة من المتحولات البكتيرية أو محللات الملتهمة حيث يتم تمثيل كل مرنا معزول من كائن أو نسيج كإدخال (كدنا) في بلازميد أو ناقل فج. يعتمد تواتر cDNA المحدد في مثل هذه المكتبة على تواتر mRNA المعني في هذا النسيج.

أداة # 3. تحليل الجينات ونصوص الجينات:

تتضمن تقنية الحمض النووي المؤتلف توطين الجين محل الاهتمام. يمكن عزل هذا الجين أو تصنيعه قبل التلاعب به واستخدامه للتحول الذي يؤدي إلى إنتاج نباتات وحيوانات معدلة وراثيًا. تم استخدام تقنيات مختلفة لعزل أنواع مختلفة من الجينات مثل جين RNA الريبوسومي ، وجين الصفات المظهرية مع منتج جيني غير معروف ، لمنتجات بروتينية معينة ، والجينات التي تنطوي على وظائف تنظيمية ، على سبيل المثال جينات المروج إلخ.

عزل جينات RNA الريبوسوم:

يصنع الحمض النووي الريبوزي 80 ٪ من إجمالي الحمض النووي الريبي ويتم تصنيعه على الجين الريباسي الذي يمكن عزله. كان عزل هذا الجين سهلاً نظرًا لبعض خصائص خصائص الرنا الريباسي (أ) توجد جينات الريبوم في نسخ متعددة (ب) الفرق بين جينات الريبوسوم والجينات الأخرى ، نظرًا لمحتوى G + C المرتفع نسبيًا في الرنا الريباسي. تم عزل الجين الريبوزومي لأول مرة في عام 1965 من قبل إتش والاس و M.L. بيرنستيل في برمائي يدعى Xenopus.

الخطوات المختلفة التي ينطوي عليها عزل جينات الرنا الريباسي هي كما يلي:

1. يتم عزل الرنا الريباسي من الريبوسومات ويتم تسميتها إشعاعيًا عن طريق السماح لها بالتكاثر في وسط يحتوي على يوريدين ثلاثي.

2. يتم عزل الحمض النووي الريبوزومي عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة (محتوى G + C العالي من rDNA يجعل من السهل فصله عن طريق الطرد المركزي عن باقي الحمض النووي) متبوعًا بتمسخه.

3. يتم بعد ذلك تثبيت الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل على ورق الترشيح ويتم إضافة الحمض النووي الريبي المسمى إلى الورق.

4. الآن يحدث تهجين DNA و RNA ويتم غسل الحمض النووي الريبي الزائد المسمى.

5. يتم قياس النشاط الإشعاعي والهجين المزدوج الذي عند التمسخ سيعطي الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل والذي يمكن جعله مزدوجًا. هذه هي الطريقة التي يمكن بها عزل جين الرنا الريباسي.

عزل جين بروتينات معينة:

هذا ممكن عن طريق استخدام إنزيم النسخ العكسي. يمكن لهذا الإنزيم أن يصنع نسخة / مكملة من الحمض النووي (كدنا) من الحمض النووي الريبي. لذلك من الضروري أن تكون تقنيات عزل الرنا المرسال متاحة.

الخطوات المختلفة المتبعة هي كما يلي:

1. يتم تنقية منتج البروتين من الجين.

2. يتم إنتاج الأجسام المضادة ضد هذه المنتجات البروتينية عن طريق تحصين الحيوانات مثل الأرانب والفئران.

3. يتم ترسيب polysomes التي تشارك في تصنيع بروتينات معينة. يتم ذلك بمساعدة الأجسام المضادة المنتجة.

4. يتم عزل مرنا وتنقيته من الكسور المتعددة. يستخدم هذا الرنا المرسال لتوليف [كدنا].

5. يتم بعد ذلك إدراج هذه (كدنا) في نواقل الاستنساخ لإعداد مكتبة (كدنا). بعد ذلك ، يتم إجراء التحليل المناعي والكهربائي لمنتجات الترجمة لاستنساخ cDNA ، لتحديد استنساخ cDNA المحدد ، الذي يحتوي على جين لبروتين معين مهم.

6. ثم يتم اختيار مجسات (كدنا) محددة لتحديد وعزل الجين من الحمض النووي الجيني من خلال فحص مكتبة جينومية كاملة أو جزئية.

عزل جين من منتجات غير معروفة (بتعبير خاص بالأنسجة):

من السهل عزل منتجات الجينات الخاصة بالأنسجة. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن جينات تخزين البروتينات فقط في البذور النامية ، ويتم التعبير عن جين الغلوبين في كريات الدم الحمراء. يمكن عزل هذه الجينات بسهولة لأن mRNA المستخرج من مثل هذه الأنسجة سيكون إلى حد كبير الجين محل الاهتمام. يمكن القضاء على mRNA الأخرى ، والتي يمكن تحديدها عن طريق عزل ومقارنة mRNA من الأنسجة حيث لا يتم التعبير عن هذا الجين. ثم يتم استخدام هذا الرنا المرسال المعزول لتخليق (كدنا) باستخدام إنزيم النسخ العكسي. ثم تكون العملية هي نفسها الموصوفة في عزل الجينات لبروتينات معينة معروفة.

عزل الجينات باستخدام مجسات DNA و RNA:

إذا كانت المجسات الجزيئية المحددة (مجسات DNA و RNA) متوفرة ، فيمكن استخدامها لعزل جينات معينة. يمكن الحصول على هذه المجسات إما من أنواع نباتية أخرى أو يمكن تصنيعها بشكل مصطنع باستخدام جزء من تسلسل الأحماض الأمينية لمنتج البروتين للجين المعني. تسمى المجسات التي تم الحصول عليها من أحد الأنواع النباتية والمستخدمة لأنواع نباتية أخرى بالمسابير غير المتجانسة.

تم العثور على هذه المجسات غير المتجانسة لتكون فعالة في تحديد استنساخ الجينات أثناء تهجين المستعمرة أو تهجين اللويحات أو على لطخة جنوبية. على سبيل المثال ، تم عزل الجين الخاص بـ chalcone synthase من Antirrhinum majus و Petunia hybrida باستخدام مسبار غير متجانس من البقدونس. تستخدم المجسات غير المتجانسة بشكل عام مع مكتبة (كدنا).

الآن مع معرفتنا بتوليف مجسات (كدنا) ، يمكن أن تكون هذه المجسات مفيدة في تركيب المجسات الاصطناعية. في هذا الإجراء ، يتم استخدام البروتين المنقى باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد للتسلسل الدقيق لـ 5-15 من الأحماض الأمينية المتتالية ، ويمكن استخدام هذه المعلومات لتخليق قليل النيوكليوتيدات المقابلة باستخدام مُصنِّع الحمض النووي المؤتمت. يمكن بعد ذلك استخدام قليل النوكليوتيدات مباشرة لفحص cDNA أو مكتبة الجينوم لعزل الجين محل الاهتمام.

أداة # 4. تهجين المستعمرات:

تهجين المستعمرات هو فحص مكتبة مع مسبار مُسمى (مُشع ، مضيء حيوي ، إلخ) لتحديد تسلسل معين من DNA ، RNA ، إنزيم ، بروتين ، أو جسم مضاد (الشكل 15.5).

للتهجين سمتان مهمتان:

1. تفاعلات التهجين هي مجسات محددة سترتبط فقط بالمواقع التي تحتوي على تسلسلات مكملة.

2. تحدث تفاعلات التهجين في وجود كميات كبيرة من الجزيئات المتشابهة ولكن غير المتطابقة مع الموقع. هذا يعني أن المسبار يمكنه العثور على جزيء واحد من الهدف في خليط من ملايين الجزيئات ذات الصلة ولكن غير المكملة.

تسمح هذه الخصوصية للفرد بالعثور على تسلسل محدد في خليط معقد مليء بالتسلسلات المتشابهة. تسمح تقنية التهجين أيضًا للعلماء باختيار الجزيء ذي الأهمية من خلائط معقدة للغاية ودراسة الجزيء بمفرده.

طريقة تهجين المستعمرة:

الخطوات التالية مطلوبة:

1. عزل وتنمو الثقافات في وسط مناسب (أجار).

2. نقل عينة من المستعمرات على مصفوفة صلبة مثل النيتروسليلوز أو غشاء النايلون.

3. يتم تحليل الخلايا الموجودة على الغشاء ثم يتم تغيير طبيعة الحمض النووي.

4. يضاف مسبار ذو علامة إلى المصفوفة ويحدث التهجين.

5. يتم شطف القالب لإزالة جزيئات المسبار غير المهجنة.

6. بالنسبة للتحقيقات المشعة ، يستخدم المرء التصوير الشعاعي الذاتي ويتم وضع المصفوفة على فيلم الأشعة السينية.

7. لوحظ الفيلم للبقع السوداء التي تتوافق مع المستعمرات المهجنة بالمسبار.

8. قارن فيلم الأشعة السينية باللوحة الرئيسية لمعرفة المستعمرات التي بها مسبار تهجين. هذه هي المستعمرات التي احتوت على التسلسل المحدد الذي تم تهجينه بالفعل مع المسبار.

9. يمكن تربية المستعمرات الموجودة على اللوحة الرئيسية التي لها التسلسل المطلوب إذا رغبت في ذلك.

مزايا:

1. يسمح لك باختيار جزيء واحد من بين ملايين الجزيئات.

2. لا يتطلب عزل الأحماض النووية.

3. من الممكن استزراع وتحديد الكائنات الدقيقة التي تحتوي على التسلسل المهجن.

سلبيات:

1. تستغرق الطوائف وقتًا طويلاً ، وتستغرق وقتًا في احتضانها وظهور التهجين على فيلم الأشعة السينية.

2. عند تحديد الكائنات الحية الدقيقة ، لن ينجح الإجراء إلا إذا كانت الكائنات الحية تنمو وتشكل مستعمرة يمكن اكتشافها.


شظايا منفصلة من الحمض النووي بحجم مختلف جدًا (قلة ولامدا-دنا) - علم الأحياء

1.أ. في الحمض النووي بتكوين قاعدي مثل A + T = G + C ، ما هو متوسط ​​طول الجزء عند قطع الحمض النووي سابقة بمعنى البيئة RI؟ مع هين dIII؟ مع هين dII؟ مع Hpa II؟

ب. تتعلق إجاباتك في (أ) بعدد المواقع المتوقعة في قطعة معينة من الحمض النووي (كيف؟). كم عدد المواقع لكل إنزيم تتوقع أن تجده في & # 955 DNA (48502 بت في الثانية يكون تكوين الأساس الأساسي حوالي 50٪ AT)؟

2. يشير هذا السؤال إلى الرسم البياني أعلاه. يُظهر السطر الأول خريطة تقييد لجزء من الجينوم (DNA الجينومي) يحتوي على rx الجين (جين افتراضي). تُظهر المربعات المفتوحة في مخطط الحمض النووي الجينومي مواقع الإكسونات. لديك استنساخ (كامل الطول) cDNA مصنوع من mRNA المنسوخ من جين rx.

أ. يتم هضم الحمض النووي الجيني مع هين dIII وتم فحصها باستخدام cDNA المسمى إشعاعياً بواسطة إجراء التهجين الجنوبي. ما حجم الشظايا المهجنة؟ ما حجم الأجزاء المهجنة إذا تم قطع الحمض النووي الجيني بدلاً من ذلك سابقة بمعنى البيئة RI؟ إذا تم قطع الحمض النووي الجيني هين dIII وأمبير Pvu الثاني؟

ب. تمت إضافة الوصلات مع مواقع Eco RI إلى نهايات rx كدنا. تم بعد ذلك ربط جزء cDNA الناتج في موقع EcoRI لـ pBR322. (ملاحظة: سلالة بكتريا قولونية المستخدمة لا تحتوي على إنزيمات تقييد أو تعديل للتداخل مع ما يلي.) إذا كان استنساخ pBR322 cDNA يحتوي على rx يتم هضمه مع سابقة بمعنى البيئة RI ، يتم فصل الشظايا على هلام agarose ونقلها إلى nitrocellulose كما هو الحال في النقل الجنوبي ، ويتم تهجين المرشح إلى cDNA ذي العلامات الإشعاعية ، ما حجم الأجزاء التي سيتم تهجينها؟ ما حجم الأجزاء التي سيتم تهجينها إذا كان pBR322 rx يتم قطع استنساخ مع كليهما سابقة بمعنى البيئة RI و هين dIII؟

ج. يتم هضم استنساخ pBR322 rx (كدنا) مع هين dIII وجزء 1 كيلو بايت معزول ومميز إشعاعياً. ثم يتم تهجين هذه القطعة إلى لطخة جنوبية من الحمض النووي الجيني. ما حجم الأجزاء التي سيتم تهجينها إذا تم قطع الحمض النووي الجيني سابقة بمعنى البيئةRI؟

د. مرض بيلة الخصية هو اضطراب متنحي يكون فيه منتج الجين rx معيبًا. تم هضم الحمض النووي من دم شخص مصاب بعشرات من الإنزيمات المقيدة وتم فحصه باستخدام rx cDNA عن طريق التحليل الجنوبي. تم ردع الملغومة أن exon الثاني كان مفقودًا تمامًا ولا توجد شظايا جينومية أخرى مفقودة أو متأثرة. في هذه الحالة ، ما حجم الأجزاء التي تتوقعها في تجربة النقل الجنوبية باستخدام الحمض النووي الريبي من النوع البري كمسبار يتم فيه هضم DN A الجيني من المريض باستخدام Hin dIII؟

ه. تم فحص أليل آخر في فرد مصاب ببول مختبري. في هذه الحالة كان المحقق كسولًا وقام بتجربة واحدة فقط. تم هضم الحمض النووي الجينومي من الشخص المصاب Pvuالثاني وتحليلها عن طريق النقل الجنوبي باستخدام النوع البري (كدنا) كمسبار. لوحظ جزء واحد من حوالي 6.4 كيلو بايت. ما هو السبب المحتمل للأليل؟ هل يمكن أن يكون هذا الأليل هو نفسه الموصوف في (د)؟ لماذا لماذا لا؟

3. افترض أنك قمت باستنساخ (كدنا) لجين بشري. تقطع الحمض النووي الجيني البشري به سابقة بمعنى البيئة RI ووجد أن جزءًا واحدًا فقط يتهجين مع المسبار الخاص بك. يمكنك استنساخ هذا الجزء ، وعزل الحمض النووي ، وقطع الحمض النووي به هبا و / أو مبو (نوعان من نوكليازات التقييد الأخرى). يتم فصل الأجزاء الناتجة على مادة هلامية بالنتائج التالية (تشير الأرقام إلى أحجام الشظايا بالكيلوباس).

تم مسح هذا الجل إلى النيتروسليلوز وتم فحصه باستخدام cDNA الذي تم تمييزه إشعاعيًا. العصابات المصنفة كانت:

أ. باستخدام هذه البيانات ، ارسم خريطة تقييد لملف سابقة بمعنى البيئة جزء RI (تأكد من الإشارة الكل من مواقع التقييد المعروفة).

ب. باستخدام بيانات التهجين ، استنتج ما إذا كان الجين يحتوي على أي إنترونات أم لا. اشرح اجابتك. (إذا كان هناك أي إنترونات ، فماذا يمكنك أن تقول عن عددها؟)

ج. اسم واحد الطريقة التي من شأنها أن تسمح ل [كدنا] أن يتم وسم إشعاعيًا ووصف أساس هذه الطريقة.

4 ا. ابحث عن مواقع التعرف على بام مرحبا و Bgl II وقارن التسلسلات التي يتعرف عليها هذان الإنزيمان والنهايات الناتجة & quot ؛ ما هي أوجه التشابه والاختلاف التي تراها؟

ب. إذا كان للبلازميد 5 كيلو بايت واحد فقط بام HI تسلسل واحد فقط Bgl التسلسل الثاني (مفصولة بمقدار 0.5 كيلو بايت) ، كيف يمكنك صنع بلازميد يفتقر إلى بام أهلا-Bgl الجزء الثاني. [تلميحات: (أ) قد تضطر إلى تنقية بعض الحمض النووي - كيف ستفعل ذلك؟ (ب) البلازميدات عبارة عن دوائر مغلقة.]

ج. كم العدد بام هل سيكون لمواقع HI البلازميد الناتج؟ كم العدد Bgl الثاني المواقع؟

د. إذا احتفظ البلازميد الناتج بمقاومة الأدوية ، فكيف يمكنك استخدام النتائج في (ج) لتبسيط البناء في (ب). (تلميح: يمكن أن تتحول البلازميدات السليمة فقط بكتريا قولونية.)

5. افترض أنك تحاول استنساخ جين عن طريق الدخول ذبابة الفاكهة. على الرغم من أنه لم يتم استنساخ أي جينات قريبة ، إلا أن هناك عددًا قليلاً من عمليات الحذف والانتقال التي تم تحديدها والتي تضع جينك قريبًا جدًا من بعض الجينات المستنسخة. كيف يمكنك استخدام هذه المعلومات لمساعدة & quotwalk & quot في الجين الخاص بك (ربما عن طريق & quotjumping & quot)؟

6. عندما يكون جزء جينومي 10 كيلو بايت من الحمض النووي من C. ايليجانس تم هضمه مع مجموعات مختلفة من إنزيمات التقييد المشار إليها ، وشوهدت الأجزاء التالية (تظهر الأرقام بجوار العصابات شدتها النسبية). ح = هيند الثالث ، ه = سابقة بمعنى البيئة RI ، P = PST أنا

أ. ارسم خريطة تقييد للجزء. اشرح اجابتك.

ب. كيف يمكنك استخدام الحمض النووي الجينومي لإثبات (دون القيام بأي استنساخ) أن هذا الحمض النووي قام بترميز mRNA بمقدار 4 كيلو بايت؟ افترض أن لديك مخزونًا من الرنا المرسال والحمض النووي الجيني وجميع المواد الكيميائية والمعدات اللازمة. يجب أن تكون مختصرا.

ج. يتم عزل 4 كيلو بايت (كدنا) واستخدامها لفحص إنزيم تقييد الحمض النووي المهضوم أعلاه. تتم الإشارة إلى النطاقات المُصنَّفة بعلامات نجمية (لا يُشار إلى شدة وسم هذه النطاقات). أين خريطة (كدنا) على الحمض النووي الجينومي؟ اشرح اجابتك.

7. لكل مما يلي وصف الإجراء (الإجراءات) التجريبية التي ستستخدمها. كن موجز. قم بتسمية الإجراء وفي جملة أو اثنتين أخبر كيف يعمل.

أ. بعد عزل الأحماض النووية عن بعض الخلايا ، كيف تحصل على محلول يحتوي على الحمض النووي الريبي فقط؟ الحمض النووي فقط؟

ب. تعطي عينة الحمض النووي رباطًا واحدًا على هلام الاغاروز ، لكنك تشك في أن هذه الفرقة قد تحتوي بالفعل على حمضين نوويين مختلفين من نفس الحجم. ما التجربة التي يمكنك القيام بها لاختبار هذه الفرضية (غير مسموح بالتسلسل)؟

ج. لقد قمت للتو باستنساخ جين في أنواع معينة انيقة والعثور على اثنين من الجينات المماثلة الأخرى (متجانسات) في C. ايليجانس الجينوم. عندما تقارن تسلسلات النوكليوتيدات المشفرة بواسطة هذه الجينات ، تجد أن عدة مناطق من الحمض النووي متطابقة من جين إلى آخر. ما هي الطريقتان المختلفتان جدًا اللتان يمكنك استخدامهما لتحديد ترميز الحمض النووي المتماثل في ذبابة الفاكهة?

د. كيف يمكنك تحديد ما إذا كان الجين (الحمض النووي الذي تمتلكه) مقسمًا بدلاً من ذلك لصنع أكثر من مرنا واحد بأحجام مختلفة ؟.

ه. تحصل على ملف C. ايليجانس متحولة تستمر في إنتاج ذرية ذاتية لها نمط ظاهري متحور وبعضها ليس كذلك ، أي أن السلالة لا تتكاثر بشكل صحيح. تشك في أن جميع الحيوانات لها نفس النمط الجيني ولكنها تظهر اختراقًا غير كامل. كيف يمكنك إثبات اختراق غير كامل؟

8. ما هو RT-PCR (تفاعل النسخ العكسي - البوليميراز المتسلسل) وما هو استخدامه؟

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 كيلو بايت

ب = بام موقع HI = سابقة بمعنى البيئة موقع RI H = هين موقع dIII

9. أعلاه توجد خريطة تقييد لجزء من الحمض النووي الجيني. الصندوقان المفتوحان هما exons لـ mRNA. في الأسئلة التالية ، سوف تحتاج إلى رسم مظهر المواد الهلامية من مادة الاغاروز أو صور الأشعة الذاتية لمرشحات النيتروسليلوز التي تحتوي على شظايا مفصولة بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. لكل منها يشير على اليسار إلى مقياس حجم الشظايا.

أ. ما هو نمط النطاق الذي سينتج عنه هلام الاغاروز عندما يتم تقييد الجزء الجينومي بـ i) بام مرحبا الثاني) هين الثالث والثاني) سابقة بمعنى البيئة RI (الرابع) هين dIII و سابقة بمعنى البيئة RI؟

ب. الأجزاء التي تم إنشاؤها بواسطة بام تم عزل HI الهضم ووسم إشعاعيًا عن طريق ترجمة نيك. تم عزل mRNA من الكبد ، الذي يعبر عن هذا الجين ، ومن الدماغ الذي لا يعبر عنه. تم تشغيل العديد من المواد الهلامية من الاغاروز بمسار منفصل للكبد والدماغ. تم نقل mRNAs المنفصلة من المواد الهلامية إلى النيتروسليلوز. تم تهجين مرشحات النيتروسليلوز المختلفة بشكل منفصل باستخدام واحد من بام شظايا HI من الحمض النووي الجيني (جميع بام تم استخدام شظايا HI). صف أو رسم تخطيطي لنتائج هذه التجربة.

ج. يتكون هجين DNA-RNA من DNA موسوم إشعاعيًا من هذا الاستنساخ و mRNA من الحمض النووي. يتم هضم هذا الهجين باستخدام نوكلياز S1. يتم تشغيل المادة الناتجة على هلام الاغاروز وتنشيفها إلى النيتروسليلوز. ارسم مخططًا لنمط النشاط الإشعاعي.

د. عندما تم استخدام الاستنساخ بأكمله لمقايسة النسخ (مثل التحول بوساطة الحمض النووي للخلايا أو في المختبر نظام النسخ) ، تم نسخ الحمض النووي بدقة. عندما 12 كيلو بايت هين تم استخدام جزء dIII ، ولم يتم نسخ الحمض النووي. قدم شرحًا غير بديهي للنتيجة.

10. أجب بصواب أو خطأ. إذا كانت العبارة صحيحة ، فشرح أو أعط مثالاً داعمًا. إذا كانت العبارة FALSE ، فقم إما بتصحيح العبارة أو إعطاء مثال مضاد.

تُفضل نواقل البلازميد للاستنساخ على النواقل التي تتضمن لامدا فج لأنها يمكن أن تحتوي على كميات أكبر من الحمض النووي.


وصف مختصر للرسومات

الرسومات المصاحبة ، التي تم دمجها في هذه المواصفات وتشكل جزءًا منها ، توضح تجسيدات وميزات الاختراع ، وتوفر البيانات الداعمة للوصف المكتوب ، بالإضافة إلى الوصف المكتوب ، تعمل على شرح مبادئ معينة للاختراع.

تين. 1 ، اللوحات A-D ، تصور سلسلة من الخطوات التي يمكن إجراؤها لإنشاء مركب ترانسبوزيز ، وربط المركب بركيزة صلبة ، واستخدام المركب المرتبط بالركيزة الصلبة لتفتيت الحمض النووي وإنتاج شظايا الحمض النووي المرتبطة بالركيزة الصلبة.

تين. 2 يصور استخدام الحمض النووي المرتبط بالركيزة الصلبة للتضخيم في المختبر.

تين. 3 يصور صورة لجيل الاغاروز الملون للحمض النووي ، مما يدل على أن مركبات ترانسبوزيز ("Vibhar") مع قليل النوكليوتيدات الخاصة بالترانسبوزيز والتي تكونت في محلولات الخلية الخام ومرتبطة بركيزة صلبة ، ومعزولة من المحللات في الشكل المرتبط ( على سبيل المثال ، المجمعات المنقاة المعطلة) يمكن استخدامها لتجزئة الحمض النووي المستهدف (DNA lambda DNA) ويمكن تضخيم الأجزاء بشكل خاص في PCR. محتويات الممر: lysates of بكتريا قولونية الخلايا التي تعبر عن Vibhar transposase (الممر 3) أو lysates من خلايا التحكم السلبية التي لا تعبر عن Vibhar transposase (الممرات 2 و 4 و 5) المطبقة مع الحمض النووي المستهدف (الممران 3 و 5) أو بدون الحمض النووي المستهدف (الممران 2 و 4) . للمقارنة ، تم تشغيل 1 كيلو بايت + سلم DNA (Life Technologies ، كارلسباد ، كاليفورنيا) على الممر 1.

تين. يصف الشكل 4 بشكل تخطيطي بعض عمليات النقل النموذجية التي يشملها الاختراع الحالي. عندما يكون transposase عبارة عن وهم من اثنين أو أكثر من الترانسبوزسات ، يتم تصوير التسلسلات المدمجة المختلفة في ظلال مختلفة من اللون الرمادي ، يشير التعليق التوضيحي على الجانب الأيسر إلى ترتيب التسلسلات. 1. أ (فيبهار + نملة) ، فيبريو هارفي transposase (YP_001446289 SEQ ID NO: 1) بامتداد طرف C لـ GGGRQIKIWFQNRRMKWKKEN (رقم معرف التسلسل: 2) - يتم توفير التسلسل الكامل كمعرف التسلسل رقم: 3 2. L (Vibhar + Lef) فيبريو هارفي transposase بامتداد طرف C لـ GGGKKKRKRER (رقم معرف التسلسل: 4) - يتم توفير التسلسل الكامل كمعرف التسلسل: 5 3. S (Vibhar + Sox) فيبريو هارفي transposase بامتداد طرف C لـ GGGKYRPRRRKQ (رقم معرف التسلسل: 6) - يتم توفير التسلسل الكامل كرقم معرف التسلسل: 7 4. 5B-بكتيريا ضوئية عميقة SS9 ترانسبوزيز (YP_133439 رقم معرف التسلسل: 8) 5. 5 لتر فيبريو هارفي transposase مع المجال الطرفي C الخاص به الذي تم استبداله بالمجال الطرفي C المقابل من بكتيريا ضوئية عميقة SS9 transposase (تسلسل كامل من الوهم مقدم كمعرف التسلسل رقم: 9) 6. V6 ، فيبريو هارفي ترانسبوزيز (YP_001446289 رقم معرف التسلسل: 1) 7. ضمة الكوليرا ترانسبوزيز V51 (ZP_04918286.1 رقم معرف التسلسل: 10) 8. ضمة الكوليرا تم تغيير V51 Transposase (ZP_04918286.1) مع الأحماض الأمينية لتتوافق مع اهتزازات ترانسبوزيز SWAT-3 البكتيري (ZP_01815141.1 تسلسل كامل من الوهم المقدم كمعرف التسلسل رقم: 11) 9. فيبريو harveyi transposase مع مجالها الطرفي C الذي تم استبداله بالمجال المطابق C من عائلة IS4 transposase TnpA [البكتيريا المستروحة subsp. المستروحة شارع. فيلادلفيا 1] (التسلسل الوهمي الكامل مقدم كرقم تعريف التسلسل: 12) 10. فيبريو هارفي transposase مع المجال الطرفي C الخاص به الذي تم استبداله بالمجال الطرفي C المقابل من ضمة الكوليرا ترانسبوزيز V51 (تسلسل خيالي كامل مقدم كمعرف التسلسل رقم: 13) 11. فيبريو هارفي transposase مع المجال الطرفي C الخاص به الذي تم استبداله بالمجال الطرفي C المقابل من اهتزازات ترانسبوزيز SWAT-3 الجرثومي (تسلسل خيمري كامل ZP_01815141.1 مقدم كمعرف التسلسل رقم: 14).

تين. 5 يصور المحولات والبادئات لتضخيم PCR ، و oligonucleotides للتسلسل على أدوات Illumina. AgP1 = رقم معرف التسلسل: 15 3bio = رقم معرف التسلسل: 16 3i0 = رقم معرف التسلسل: 17 AgP2 = رقم معرف التسلسل: 18 8i1 = رقم معرف التسلسل: 19 8i0 = رقم معرف التسلسل: 20 i1 = رقم معرف التسلسل: 21 i2 = رقم معرف التسلسل: 22 i3 = رقم معرف التسلسل: 23 i4 = رقم معرف التسلسل: 24 i5 = رقم معرف التسلسل: 25 i6 = رقم معرف التسلسل: 26 i7 = رقم معرف التسلسل: 27 i8 = رقم معرف التسلسل: 28 3iS = رقم معرف التسلسل: 29 8iS = رقم معرف التسلسل: 30 Rp1 = رقم معرف التسلسل: 31 Rp2 = رقم معرف التسلسل: 32 InP = رقم معرف التسلسل: 33.

تين. 6 يصور صورة لهلام الاغاروز الملون للحمض النووي ، مما يدل على أن مجموعة متنوعة من معقدات ترانسبوزيز الصلبة المرتبطة بالركيزة ، بما في ذلك معقدات ترانسبوزيز المؤتلفة / الكيميرية ، يمكن استخدامها لتجزئة الحمض النووي لامدا الهدف وتضخيم الحمض النووي المجزأ عند ارتباطه بالركيزة الصلبة . للمقارنة ، تم تشغيل 1 كيلو بايت + سلم DNA (Life Technologies ، كارلسباد ، كاليفورنيا) على المواد الهلامية جنبًا إلى جنب مع الأجزاء. تتوافق أكواد العينات المقدمة أعلاه آبار الهلام مع الرموز الواردة في الشكل FIG. 4.

تين. 7 يصور صورة هلام الاغاروز الملون للحمض النووي ، مما يدل على أن مجموعة متنوعة من معقدات ترانسبوزيز الصلبة المرتبطة بالركيزة ، بما في ذلك معقدات ترانسبوزيز المؤتلفة / الكيميرية ، يمكن استخدامها لتجزئة الهدف بكتريا قولونية الحمض النووي وتضخيم الحمض النووي المجزأ عند ارتباطه بالركيزة الصلبة ، وأن التضخيم لا يعتمد على أي مزيج بوليميراز أو بوليميراز معين. تتوافق أكواد العينات المقدمة أعلاه آبار الهلام مع الرموز الواردة في الشكل FIG. 4. الأوزان الجزيئية موضحة على يمين الهلام.M = مكبر باستخدام PICOMAXX ™ (Agilent Technologies، Inc.) U = مكبر باستخدام PFUULTRA ™ HF (Agilent Technologies، Inc.).

تين. يُظهر الشكل 8 مخططًا كهربائيًا للمحلل الحيوي لشظايا الحمض النووي قبل تقديمها للتسلسل. تتوافق أرقام العينات مع الأرقام الواردة في الشكل FIG. 4.

تين. 9 يظهر تسلسل شظايا الحمض النووي من بكتريا قولونية الجينوم (Genbank CP000946) الذي تم الحصول عليه باستخدام ترانسبوزسات مختلفة ، محاذاة على بكتريا قولونية الجينوم وتم تقديمه عبر برنامج عارض الجينوم التفاعلي (Robinson et al.، Nature Biotechnology 29، 24-26، 2011). يشار إلى محتويات العينة وتتوافق مع التركيبات الواردة في الشكل. 4.

تين. يوضح الشكل 10 مؤامرات تحيز GC لشظايا DNA المتسلسلة من بكتريا قولونية الجينوم (Genbank CP000946) الذي تم الحصول عليه باستخدام ترانسبوزسات مختلفة. تتوافق أكواد العينات من قطع الأراضي مع الرموز الواردة في الشكل FIG. 4.


الوحدة 3

معرفة النقاط المتساوية الكهربية للقطعة المعنية.

قياس أحجام العصابات على الجل

إزالة العصابات من الجل وتهجينها بخيط معروف من الحمض النووي مكمل للجين المعني

تحديد الأوزان الجزيئية للشظايا المعنية

معلومات عن أخصائيو تقويم الجينات البكتيرية

قاعدة بيانات EST للجينوم البشري

بيانات ميكروأري للأنسجة التي يتم التعبير عن الجين فيها

بيانات حول وراثة علامات SNP في العائلات المصابة بالمرض

كبير ، منظم بشكل أساسي في وحدات النسخ أحادية النواة بدون إنترونات.

صغيرة ، منظمة بشكل أساسي في وحدات النسخ أحادية النواة ذات الإنترونات.

كبير ، منظم بشكل أساسي في وحدات النسخ متعدد السلاسل بدون إنترونات.

صغير ، مع كثافة جينية عالية.

كبير ، منظم بشكل أساسي في وحدات النسخ أحادية النواة بدون إنترونات.

صغيرة ، منظمة بشكل أساسي في وحدات النسخ أحادية النواة ذات الإنترونات.

كبير ، منظم بشكل أساسي في وحدات النسخ متعدد السلاسل بدون إنترونات.

صغيرة ، منظمة بشكل أساسي في وحدات النسخ متعددة السلاسل بدون إنترونات.

تستخدم لهضم جزيئات الحمض النووي بشكل عشوائي.

كلها معدلة وراثيًا.

يقوم بتهجين الحمض النووي المرتبط بالفلتر باستخدام مسبار الحمض النووي.

تهجين الحمض النووي الريبي المرشح بواسطة مسبار الحمض النووي.

يفحص بدائل الأحماض الأمينية بالمسابير المشعة.

يشق الحمض النووي الريبي مع نوكليازات تقييدية.

تستخدم بدائيات النوى شفرة جينية مختلفة عن تلك الخاصة بحقيقيات النوى

لا تستطيع البكتيريا إزالة الإنترونات حقيقية النواة.

لا تستطيع بوليميراز الحمض النووي الريبي البكتيري أن تجعل الحمض النووي الريبي مكملاً للحمض النووي للثدييات

البروتينين لهما وظائف متطابقة.

ليس للبروتينين أصل مشترك.

يشترك البروتينان في أصل مشترك.

يحتوي البروتينان على هياكل ثلاثية متطابقة.

ضروري للنسخ الفعال للحمض النووي للخلية في الطور البيني

تقنية لتضخيم تسلسل الحمض النووي في المختبر

أحد عناصر التحكم في دورة الخلية

كل كوزميد يتكاثر بشكل غير تلقائي.

تستمر العاثيات اللايسوجينية في دمج الحمض النووي الخاص بها في كروموسوم المضيف ، وبالتالي تقليل عدد الحيوانات المستنسخة المؤتلفة المطلوبة.

يمكن لكل ناقل أن يأخذ جزءًا صغيرًا نسبيًا من الحمض النووي حقيقي النواة.

كل منتج ربط هو تسلسل محدد.

تحقق مما إذا كانت قاعدة بيانات EST تحتوي على تسلسلات في المنطقة.

تحقق مما إذا كانت قاعدة بيانات SNP تحتوي على تسلسلات في المنطقة.

مسح المنطقة لتسلسل المروج.

جزء 8 كيلو بايت و 2 كيلو بايت

جزء 10 كيلو بايت و 2 كيلو بايت

قم بإنشاء خريطة مادية لـ 3.3 مليار زوج أساسي في الجينوم البشري.

جمع عينات من الخلايا من جميع أنحاء العالم من أجل الحفاظ على التنوع الجيني البشري.

جمع بذور النباتات لتقليل تأثير النشاط البشري على انقراض النبات.


1. تطبيقات تحليلية لتحديد النتائج التجريبية

توفر التطبيقات التحليلية للرحلان الكهربائي للحمض النووي طرقًا لفحص النتائج التجريبية لخطوة سابقة قبل متابعة سير العمل أو مجموعة أخرى من التجارب. يعتمد هذا النهج في المقام الأول على تقييم وجود أو عدم وجود النطاقات المرغوبة في المواد الهلامية ، وكثافتها ، وأنماط الهجرة ، والتنقل ، والتهجين ، كما هو موضح أدناه.

أ. تحديد النجاح في تجارب التخليق الأنزيمي والهضم والاستنساخ

عادة ما يتم إجراء التحليل الكهربي للأحماض النووية فورًا بعد الأساليب التالية (شكل 1) لتحديد النجاح والكفاءة التجريبية:

  • ال تفاعل البلمرة المتسلسل ، أو PCR، تضخيم نسخة واحدة من التسلسل المستهدف لملايين النسخ ، في غضون ساعات قليلة. يتم إجراء الرحلان الكهربائي بعد نقطة النهاية PCR ، لتأكيد تضخيم الهدف وعائده. (تعرف على المزيد: أساسيات وتطبيقات PCR)
  • بعد، بعدما الهضم التقييد، وهي تفاعلات مع إنزيمات التقييد لشق تسلسلات معينة على ركائز الحمض النووي ، يتم تشغيل العينات على مادة هلامية لتحديد نمط انقسام الحمض النووي (بالإضافة إلى مدى اكتمال عملية الهضم). (تعرف على المزيد: أساسيات وتطبيقات إنزيم التقييد)
  • في الاستنساخ الجزيئي، يتم إدخال جزء من الحمض النووي في ناقل عبر عملية تسمى ربط. في بعض الحالات ، يمكن إجراء الفصل الكهربائي بعد الربط لتقييم كفاءة التفاعل (الشكل 2). ثم يتم استخدام المنتج المرتبط لتحويل الخلايا الفعالة لكائن استنساخ ، مثل بكتريا قولونية، للتكاثر ، وبعد ذلك يتم فحص المستعمرات المتكونة لتحديد ما إذا كانت تحمل المتجه مع الإدخال المطلوب. PCR والهضم المقيد ، وكلاهما غالبًا ما يشتمل على الرحلان الكهربي كجزء من سير العمل ، هما من الأساليب الشائعة المستخدمة في فحص المستعمرة. (تعرف على المزيد: أساسيات الاستنساخ الجزيئي وأساسيات التحويل وطرق فحص المستعمرات) هي توليف الحمض النووي المكمل لقالب الحمض النووي الريبي (cDNA) ، بواسطة إنزيم يسمى النسخ العكسي. بعد توليف (كدنا) وإزالة قالب الحمض النووي الريبي ، يمكن تشغيل المنتج على هلام تغيير طبيعة لتقييم كفاءة التفاعل. تكون الطريقة أكثر فائدة عندما يتم نسخ تسلسل أو طول معروف من RNA عكسيًا. (تعرف على المزيد: أساسيات النسخ العكسي وتطبيقاته) هو تخليق RNA من قالب DNA ، بواسطة بوليميراز RNA. بعد إزالة قالب الحمض النووي ، يمكن تشغيل الحمض النووي الريبي المُصنَّع على مادة هلامية مبطلة للطبيعة لتحديد النجاح. (يتعلم أكثر: في المختبر أساسيات النسخ)

الشكل 1. تطبيقات البيولوجيا الجزيئية الشائعة التي يمكن فيها استخدام الرحلان الكهربائي لتحديد نجاح التجربة.

الشكل 2. كفاءة الربط التي تحددها الرحلان الكهربائي للهلام. تم شق Lambda DNA لأول مرة باستخدام HindIII ، وهو إنزيم تقييد خاص بالموقع من النوع الثاني (الخط 1). تم فحص العينة وتحليلها بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام (الممر 2) وكان الحمض النووي المرتبط بالكامل هو النطاق الأبرز.

ب. تحديد كمية عينات الحمض النووي بالحلل الكهربائي للهلام

يمكن استخدام الرحلان الكهربائي لتحديد نطاقات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ذات الأهمية من خلال استخدام معيار أو سلم يحتوي على كمية معروفة من كل جزء. يمكن انحراف طريقة القياس الكمي الطيفي المستخدمة على نطاق واسع بسبب وجود الملوثات مثل النيوكليوتيدات والبادئات والأنواع الأخرى. يفصل الرحلان الكهربائي عينة الاهتمام عن هذه الملوثات ، مما يوفر إستراتيجية كمية بديلة موثوقة.

يتم قياس كمية الهلام من خلال مقارنة شدة النطاق في العينة بشريط في السلم مشابه في الحجم لتقدير كمية العينة (الشكل 3 أ). من الناحية المثالية ، عند استخدام سلم مصمم للتقدير الكمي ، يجب تحميل كميات متفاوتة من السلم لرسم منحنى قياسي للكمية مقابل الشدة ، للحصول على تقدير أكثر دقة (الشكل 3 ب). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي تلطيخ الأحماض النووية بصبغة فلورية ذات حساسية عالية ونطاق ديناميكي واسع إلى زيادة تحسين كمية الهلام. تم تجهيز بعض أجهزة التصوير بالجيل ببرمجيات تحليل لتقدير كميات أبسط للعينات في الهلام ، في حين أن البعض الآخر لديه اتصال سحابي لتخزين البيانات.

الشكل 3. (أ) تحديد كمية الهلام باستخدام شظايا بكميات معروفة. (ب) منحنى قياسي لتقدير الهلام.

ج. تحليل نقاوة العينة وسلامتها وتجزئتها وكفاءة تركيبها

يمكن استخدام الرحلان الكهربائي للهلام لتقييم نقاوة وسلامة عينات الحمض النووي بعد الاستخلاص من مصادرها ، بالإضافة إلى نجاح تفتيت العينة ، والنسبة المئوية لأوليغنوكليوتيدات كاملة الطول بعد التوليف.

  • يمكن اكتشاف الحمض النووي الجيني الذي يلوث عينات الحمض النووي الريبي ، والعكس بالعكس ، باستخدام الفصل الكهربائي للهلام لفحصه نقاء العينة (الشكل 4 أ). سيعتمد اكتشاف الأنواع الملوثة على حساسية بقعة الحمض النووي المستخدمة ، بالإضافة إلى كمية الملوثات.
  • باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام ، فإن سلامة مجموع الحمض النووي الريبي بعد الاستخراج ، يمكن فحصها عن طريق تقييم الشدة النسبية لـ 28S و 18S rRNAs ، مع نسبة 2: 1 تشير إلى الحمض النووي الريبي السليم. يشير وجود المسحات ، خاصة عند الأوزان الجزيئية المنخفضة ، إلى تدهور الحمض النووي الريبي (الشكل 4 ب).
  • تتطلب بعض البروتوكولات تفتيت عينات الحمض النووي، كما هو الحال في إعداد مدخلات العينة للترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) وتسلسل الجيل التالي (NGS) ، للحصول على أحجام الأجزاء المناسبة للخطوة التالية. يمكن فحص كفاءة تجزئة العينة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام (الشكل 4 ج).
  • بعد التوليف ، ستحتوي منتجات قليل النوكليوتيد على متواليات كاملة الطول وكذلك مقطوعة أو متتالية فشل (أي ، n – 1 ، n – 2 ، إلخ) ، بسبب كفاءة اقتران التوليف التي تبلغ 100٪. الرحلان الكهربائي هو إحدى الطرق للتمييز بين المنتجات كاملة الطول وتسلسلات الفشل بناءً على حجم وتشكيل قليل النوكليوتيدات بأطوال مختلفة.

الشكل 4. الرحلان الكهربائي الهلامي في تحديد درجة نقاء العينة وسلامتها وتجزئتها.(أ) تم تحليل الحمض النووي الجيني المستخرج والحمض النووي الريبي الكلي على مواد هلامية منفصلة. تشير الأسهم الحمراء إلى تلوث الحمض النووي الريبي والحمض النووي الجيني على التوالي. لا يمكن اكتشاف تلوث الحمض النووي الريبي (RNA) إلا في بداية الرحلان الكهربائي (5 دقائق تشغيل). (ب) تم تقييم عينتين من الحمض النووي الريبي المنقى للتأكد من سلامتها عن طريق الرحلان الكهربائي وتحليل الرنا الريباسي 28S و 18S. (ج) تم تحديد كفاءة تفتيت الحمض النووي وتوزيع الحمض النووي المجزأ على مادة هلامية. (M = معيار الوزن الجزيئي. تم تشغيل عينات الحمض النووي الريبي على المواد الهلامية التي تغير طبيعة المواد الهلامية.)

د. الكشف عن التسلسلات ذات الأهمية في خليط من العينات

يعتبر الفصل الكهربائي للهلام جزءًا مهمًا من سير العمل في اكتشاف التسلسلات المستهدفة في مجموعة من الأحماض النووية عن طريق التهجين بالمسبار (الأشكال 5 و 6). المجسات عبارة عن أحماض نووية أحادية السلسلة من تسلسلات معروفة مصممة لربط تسلسلات الهدف على وجه التحديد عبر التكامل الأساسي.

  • لتحليل جزء الحمض النووي ، يعد تحليل تعدد الأشكال لطول جزء الإنزيم المقيد (RFLP) واللطخة الجنوبية هما طريقتان معروفتان يستخدم فيهما الرحلان الكهربائي لفصل العينات قبل الكشف عن الهدف (الشكل 5).

الشكل 5. تُستخدم اللطخات الجنوبية والشمالية لاكتشاف تسلسلات معينة من الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، على التوالي ، في مجموعة عينات.

  • لتحليل شظايا الحمض النووي الريبي ، تعتمد اختبارات حماية البقع الشمالية والنوكلياز (NPA) أيضًا على تهجين المسبار لاكتشاف التسلسلات ذات الأهمية. تتبع اللطخة الشمالية نفس سير العمل مثل الجنوب ، باستثناء الإدخال هو RNA (الشكل 5). في مقايسة حماية الريبونوكلياز (RPA) ، ترتبط مجسات الحمض النووي الريبي بالتسلسلات المستهدفة في خليط العينة. يتم بعد ذلك هضم الرناوات المتبقية أحادية الشريطة ، مثل المجسات والقوالب غير المنضمة ، ونواتجها المتدلية بواسطة الريبونوكليازات مثل مزيج RNase A / T1. ثم يتم تشغيل المجسات والعينات المقيدة على مادة هلامية لاكتشاف الأهداف وتحليلها في نهاية المطاف.

الشكل 6. مقايسة حماية نوكلياز.

ه. تقييم تكوين الحمض النووي ومركب الحمض النووي والبروتين

كما نوقش في قسم اعتبارات الرحلان الكهربي ، قد يُظهر DNA البلازميد من نفس التسلسل حركات كهربية مختلفة ، اعتمادًا على التشكل. يمكن استخدام هذه الخاصية لتقييم شكل الحمض النووي ، وكذلك مستوى البلازميدات السليمة بعد الاستخراج.

تهاجر شظايا الحمض النووي ، عند ارتباطها بالبروتينات ، بشكل أبطأ في الرحلان الكهربي أكثر من كونها غير مرتبطة. تُعرف الطريقة التي تُعرف رسميًا باسم مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) ، ويُشار إلى الطريقة القائمة على هذا المبدأ عادةً باسم التحول الهلامي أو مقايسة تأخر الهلام ، نظرًا لأن البروتينات المرتبطة تحول أو تؤخر هجرة شظايا الحمض النووي في المواد الهلامية (الشكل 7). لذلك ، يمكن أن توفر خطوة الفصل الكهربائي للمقايسة "لقطة" للتوازن بين الحمض النووي المرتبط والحر في العينة. بالنسبة لـ EMSA ، يجب استخدام عازلة منخفضة القوة الأيونية في كل من تحضير الهلام وتشغيل الرحلان الكهربائي للمساعدة في تثبيت مجمع الحمض النووي والبروتين أثناء الرحلان الكهربي.

الشكل 7. فحص التحول الحركية الكهربي.


لماذا النشاف الجنوبي مهم؟

الصورة 5:اللطخة الجنوبية هي أحد الإجراءات المستخدمة في اختبار الأبوة.
مصدر الصورة:slideplayer.com

النشاف الجنوبي مهم لأنه مفيد في مجالات الاهتمام المختلفة مثل:

  1. يتم استخدامه في الكشف عن الحمض النووي في عينة معينة مثل بصمة الحمض النووي في الطب الشرعي.
  2. يفيد في عزل وتحديد الجين المعني.
  3. في الطب الشرعي ، يعتبر النشاف الجنوبي أحد الإجراءات الشائعة الاستخدام ، خاصة في:
    1. تحديد الهوية الجنائية
    2. تحديد الضحية

    نقاش

    تقدم طريقة إعداد المكتبة الموصوفة هنا العديد من الفوائد على إعداد مكتبة DNA أحادية السلسلة في أول تطبيق لها. الطريقة الجديدة تعتمد على المتاح على نطاق واسع وغير مكلفة T4 DNA ligase بدلاً من CircLigase ، مما يقلل التكاليف بشكل كبير (انظر الجدول التكميلي S4 لمقارنة تكاليف الكاشف) ويجعل الطريقة أكثر قوة مع كميات أكبر من إدخال DNA. على الرغم من أن ssDNA2.0 يأتي أيضًا مع انخفاض طفيف في عدد خطوات التفاعل ، إلا أن إعداد المكتبة أحادية السلسلة يظل مستهلكًا للوقت أكثر من الطرق المزدوجة ، مما يحد من عدد العينات التي يمكن معالجتها بواسطة المصاصات اليدوية. ومع ذلك ، وبغض النظر عن اختيار البروتوكولات ، يصعب تحضير عينة عالية الإنتاجية دون استخدام أنظمة أتمتة المختبرات. تكمن أهم ميزة لـ ssDNA2.0 من وجهة نظرنا في إزالة خطوة الحضانة ذات درجة الحرارة العالية الممتدة التي تتطلبها CircLigase ، مما يجعل الطريقة متوافقة مع الأتمتة على منصات معالجة السوائل المفتوحة ويفتح إمكانية إعداد المكتبة في صفيحة ميكروية صيغة.

    نعتقد أن جوهر الطريقة هو ربط الحمض النووي أحادي الشريطة بأوليغنوكليوتيدات منشقة تحمل قواعد متدهورة - كما تم وصفه لأول مرة في تجارب إثبات المبدأ بواسطة Kwok وآخرون. (19) - يحمل إمكانات غير مستخدمة لتطوير طرق في البيولوجيا الجزيئية. لاحظنا أنه يمكن تحقيق ربط عالي الكفاءة باستخدام تسلسلات محول تم اختيارها عشوائيًا وأن فصل المحول وأوليغنوكليوتيد المنشق لا يضعف فعالية استراتيجية الربط هذه. علاوة على ذلك ، يشير تحليل بيانات التسلسل إلى أن تحيزات الربط يتم تقليلها عند استخدام الشظايا التي تحمل سبعة أو ثمانية قواعد متدهورة. نوضح أيضًا أن ربط الحمض النووي المشقوق هو الأكثر فعالية مع متقبلي التعقيد العالي التسلسل ، مثل شظايا الحمض النووي الجيني المعزولة من الأنسجة البيولوجية. قد يتطلب تسلسل الحمض النووي منخفض التعقيد باستخدام ssDNA2.0 ، على سبيل المثال لمراقبة جودة تخليق قليل النوكليوتيد ، استخدام كميات منخفضة نسبيًا من DNA المدخلات لضمان توفر ما يكفي من الشظايا ذات التشابه التسلسلي مع السلاسل المستقبلة للربط.

    توفر دراستنا أيضًا مقارنة أكثر شمولاً لإعداد مكتبة فردية ومزدوجة تقطعت بهم السبل عما تم إجراؤه سابقًا (9 ، 10 ، 13). تم التركيز في هذه الدراسات بشكل أساسي على خصائص التسلسلات التي تم الحصول عليها ، على سبيل المثال توزيع حجمها أو نسب تسلسل الحمض النووي الميكروبي الداخلي والملوث. ومع ذلك ، فإن أحد المعلمات الرئيسية التي تحدد نجاح إعداد المكتبة هو محتوى الجزيئات الفريدة في كل مكتبة (يشار إليها غالبًا باسم تعقيد المكتبة). باستثناء دراسة واحدة على عينات FFPE (13) ، لم يتم تقييم هذه المعلمة أو مجرد استقراء من استنساخ قراءات التسلسل استنادًا إلى بيانات التسلسل الضحلة جدًا. نحن نصر على أنه يجب تحديد عدد جزيئات المكتبة قبل التضخيم والتسلسل عند تقييم أداء طرق إعداد المكتبة. يعد PCR الكمي مناسبًا تمامًا لهذا الغرض (38) ، لأنه يتيح إجراء مقارنات مباشرة بين عائدات المكتبة. من خلال تقديم تقديرات لتعقيد المكتبة بشكل مستقل عن التسلسل ، نظهر بشكل قاطع أن إعداد مكتبة أحادية الجديلة يزيد من عائدات المكتبة من الحمض النووي القديم بترتيب واحد تقريبًا من حيث الحجم وبعامل ∼1.4 للحمض النووي الخالي من الخلايا مقارنة بأفضل ثنائي تقطعت به السبل طريقة. يكون الاختلاف أكثر دراماتيكية بالنسبة للعينات الثابتة بالفورمالين ، حيث يستعيد إعداد المكتبة أحادي الجديلة ما يصل إلى 3100 مرة من الجزيئات. تتماشى هذه الملاحظة مع تقرير حديث حيث وجد أن إعداد مكتبة أحادية الجديلة يزيد من عدد جزيئات المكتبة من أنسجة FFPE بمتوسط ​​900 ضعف مقارنة بالطرق المزدوجة التي تقطعت بهم السبل (13). ومع ذلك ، على عكس عينات FFPE ، التي يتم تثبيتها عادةً في الفورمالين لساعات أو أيام ، تم تخزين العينات المستخدمة هنا في الفورمالين لسنوات عديدة ، مما يشير إلى أنه حتى المواد المحفوظة في ظل هذه الظروف غير المواتية للغاية يمكن إتاحتها للدراسات الجينية.

    أخيرًا ، يوضح عملنا إلى أي مدى تؤثر تفاصيل إعداد المكتبة ، مثل اختيار الإنزيمات ، على خصائص التسلسلات التي تم الحصول عليها من الحمض النووي المتدهور. على سبيل المثال ، تم استخدام الارتفاع في تواتر الاستبدالات التي يسببها نزع الأمين بالقرب من نهاية متواليات الحمض النووي لاستنتاج طول الأجزاء المتدلية أحادية الجديلة في الحمض النووي القديم (30 ، 39) ومع ذلك ، فإن تواتر هذه الاستبدالات في المواضع النهائية لـ تعتمد محاذاة التسلسل وتراجعها نحو الجزء الداخلي من التسلسل بشكل كبير على كل من ligase المستخدم لربط المحولات في إعداد المكتبة وعلى البوليميراز المستخدم لنسخ خيوط القالب. يجب أن تؤخذ إمكانية التحيز في استخراج الحمض النووي وإعداد المكتبة ، والتي لا تزال غير مفهومة بشكل عام ، في الاعتبار عند استنتاج معلمات تلف الحمض النووي من بيانات تسلسل الحمض النووي القديم.


    مختبر 6 & # 038 البيولوجيا الجزيئية

    لدراسة بنية ووظيفة جين واحد لترميز البروتين ، يجب على المرء أن يعد الجين في شكل نقي. تحتوي خلايا الفقاريات على ما يكفي من الحمض النووي لترميز أكثر من 00000 بروتين ، لذلك ليس من العملي جدًا عزل الجين عن طريق الإجراءات الكيميائية الحيوية التقليدية. هذا هو السبب في أن تقنية الحمض النووي المؤتلف مهمة جدًا بحيث يمكن استخدامها لعزل جين معين وتضخيمه ببساطة نسبيًا.
    البلازميدات ، جزيئات DNA دائرية صغيرة ، عادة ما تكون صبغية إضافية توجد بصرف النظر عن الكروموسومات في معظم الأنواع البكتيرية. لا تعد البلازميدات ضرورية لبقاء البكتيريا المضيفة ، ولكنها يمكن أن تحتوي على جينات تمكن البكتيريا من البقاء في بيئات معينة.إذا كانت الخلية البكتيرية تحتوي على بلازميد يحمل جينًا يمنح مقاومة للمضادات الحيوية ، فيمكن لهذه الخلية أن تعيش في وجود الدواء.
    يمكن إدخال البلازميدات في الخلايا البكتيرية عن طريق عملية التحول. يمكن للبكتيريا الموضوعة في محلول كلوريد الكالسيوم أن تأخذ جزيئات DNA البلازميد. بهذه الطريقة ، يمكن تحضير كميات كبيرة من DNA البلازميد المحدد ، لأن خلية واحدة محولة تؤدي إلى ظهور خلايا مكررة تحتوي أيضًا على جزيء DNA البلازميد.
    تعتبر البلازميدات مهمة جدًا لعلماء الأحياء الجزيئية لأنها تعمل كجزيئات حاملة للجينات تسمى نواقل الاستنساخ. يمكن ربط الجين محل الاهتمام في ناقل الحمض النووي لتشكيل جزيء هجين أو مؤتلف يمكن أن يتكاثر في البكتيريا. عند تحضير جزيء الحمض النووي المؤتلف ، يلزم إجراء لقطع نواقل الاستنساخ وجزيئات الحمض النووي الخلوية في مواضع دقيقة.
    نوكليازات التقييد مهمة لتقنية الحمض النووي المؤتلف لأنها تقطع الحمض النووي في مواقع محددة. عادة ما تصنع هذه الإنزيمات من قبل أنواع بكتيرية حيث تقوم بتحطيم الحمض النووي الغريب داخل الخلية البكتيرية. تتعرف معظم إنزيمات التقييد على تسلسل محدد من النيوكليوتيدات في الحمض النووي وتقطع الحلزون المزدوج الطويل للحمض النووي إلى أجزاء تقييدية ، والتي يتم قياسها في عملية الاغاروز الكهربائي للهلام.

    مقدمة: التمرين 6 ب: الحمض النووي البصمات

    الرحلان الكهربائي هو حركة الجسيمات المشحونة في المحلول تحت تأثير المجال الكهربائي. في الرحلان الكهربائي للهلام ، يعتبر هلام الاغاروز هو وسيط التثبيت الذي يعمل كمصفوفة للمخزن الذي تنتقل فيه جزيئات العينة. يتم غمر الجل في المخزن المؤقت داخل خلية الهلام الكهربي. يتم تحميل العينات في آبار العينة في الهلام ، ويتم تمرير التيار الكهربائي عبر الهلام.
    جزيئات الحمض النووي مشحونة سلبًا بسبب الشحنات السالبة على مجموعة الفوسفات. في هذا التمرين ، تنتقل الأحماض النووية عبر مسام الهلام من الطرف السلبي نحو النهاية الإيجابية. تتحرك جزيئات الحمض النووي الكبيرة بشكل أبطأ من الجزيئات الأصغر ، لذلك يتم فرز الجزيئات وفقًا للحجم.

    الهدف: تمرين 6 أ


    أناتقصي المفاهيم الجينية الأساسية عن طريق تحويل الخلايا البكتيرية عن طريق إدخال جين مقاوم للأمبيسيلين في خلايا الإشريكية القولونية.

    الهدف: تمرين 6 ب

    التحقيق في المفاهيم الجينية الأساسية باستخدام الإنزيمات المقيدة لهضم DNA lambda وفصل وتحديد أجزاء الحمض النووي باستخدام الفصل الكهربائي للهلام.

    المواد والطرق: تمرين 6 أ


    تضمنت المواد المستخدمة في هذا التمرين: 2 صفيحة أجار لوريا ، 2 صفيحة أجار لوريا مع الأمبيسيلين ، 2 أنابيب طرد مركزي دقيق ، حلقة تلقيح ، 1 رشاش للبكتيريا ، مشابك دقيقة معقمة ، كلوريد الكالسيوم ، مرق لوريا ، بلازميد pUC8 ، موقد بنسن ، لوح تسخين ، الجليد ، حمام الماء.
    تم وضع علامة على أنبوبي الطرد المركزي الصغري! تمت إضافة I + & # 8221 و! 1- 1 ، و 250IJI كلوريد الكالسيوم البارد لكل منهما باستخدام ماصة. تمت إضافة مستعمرة كبيرة من البكتيريا لكل أنبوب مع حلقة تلقيح معقمة. تم استخدام ميكروبيبيت لنقل 10IJI من محلول pUCS البلازميد إلى أنبوب! I + & # 8221. تم تحضين كلا الأنبوبين على الجليد لمدة 15 دقيقة ، و في هذه الأثناء ، تم تسمية لوحي أجار Luria & # 8220 + & # 8221 و & # 8220 - & # 8221 وكذلك لوحتا Luria مع الأمبيسلين. تمت إزالة الأنابيب من الجليد ووضعها في حمام ماء ساخن 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. ثم أزيلت الأنابيب من الحمام المائي ووضعت على الجليد لمدة دقيقتين. تم استخدام ميكروبيبيت لإضافة 250IJI Luria مرق لكل أنبوب. تم استخدام ميكروبيبيت آخر لإضافة 100IJI من محلول! I + & # 8221 إلى اللوحين I + & # 8221 و 1oomicroliters من المحلول إلى اللوحين & # 8220 - & # 8221. تم حرق البكتيريا للتعقيم ، وبعد التبريد ، تم استخدامها لنشر الخلايا على كامل سطح الصفائح. بعد خمس دقائق ، تم وضع الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية ، مقلوبة ، طوال الليل.

    المواد والطرق: تمرين 6 ب


    تضمنت المواد المستخدمة في هذا التمرين: 8٪ هلام الاغاروز ، غرفتا رحلان كهربائي ، حزمة طاقة ، عازلة تشغيل- تريس ، مرشح دقيق ونصائح ، صينية تلطيخ ، صبغة ميثيلين زرقاء ، قفازات ، مآزر ، 4 عينات من الحمض النووي مقطوعة بإنزيمات مقيدة ، صينية قنينة ، أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، الورق ، قلم الرصاص ، الماء المقطر ، الملعقة ، حاوية بلاستيكية للتخلص ، شريط لاصق ، صندوق إضاءة ، مسطرة ، ورق رسم بياني شبه Iog. تم وضع الجل ، الموجود على علبة الهلام ، في وسط الحجرة ، مع الجانب الجيد للجيل بالقرب من القطب الأسود. تمت إضافة ما يقرب من 350 مل من المخزن المؤقت إلى الغرفة. من كل عينة DNA ، تم تحميل 10 ميكرولتر في حارة الهلام المقابلة مع ميكروبيبيت. تم توصيل أسلاك الطاقة بالتوصيلات المناسبة ، وتم تشغيل مصدر الطاقة على 50 فولت. تم السماح للعينات بالترحيل لمدة ثلاث ساعات. ثم تمت إزالة الجل وصبغه وتقطيعه طوال الليل. تم عرض الجل على لوحة ضوئية ، وتم قياس مسافات انتقال النطاق.


    شاهد الفيديو: ملخص محاضرة: دعوى الحمض النووي DNA في إثبات أصول العرب ونفيها (أغسطس 2022).