معلومة

تحسين نمو الإشريكية القولونية في D₂O (الماء الثقيل)

تحسين نمو الإشريكية القولونية في D₂O (الماء الثقيل)



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أرغب في العثور على طريقة لزيادة الكتلة الحيوية لـ D الخاص بي2يا الثقافات لأن طريقي الحالي لا ينتج ما يكفي من البروتين. أود أيضًا تقليل كمية H.2يا في ثقافتي.

منهجيتي الحالية هي نمو صغير بمقدار 3 مل بنسبة 75٪ د2نمت O و LB لمدة 9 ساعات تقريبًا. ثم يتم استخدام هذه الثقافة لبذر 20 مل 100٪ د2ثقافة O و M9 بين عشية وضحاها وهذه الثقافة بأكملها تستخدم لبذر 1L D2ثقافة O و M9.

شكرا على وقتك.


يبدو أنك تتجنب بشدة $ ^ 1 mathrm {H} $. قد ترغب في التفكير في طلاء نسخة طبق الأصل من تحويلاتك على لوحات $ mathrm {D} _2 mathrm {O} $ (اختيار $ mathrm {D} _2 mathrm {O} $ التسامح سابقًا.)

أفترض أنك تقوم بعمل بروتين NMR وتريد "وضع العلامات الثلاثية". اعتمادًا على مدى دقة ملصق الكربون الخاص بك ، قد ترغب في تنمية ثقافات البداية الخاصة بك على تحلل ثلاثي المسمى agal hydrolyzate (شيء مثل "Bioexpress.") يمكنك شراء بعض الأشياء غير المصنفة بسعر رخيص إلى حد ما ( 55 دولارًا أمريكيًا بسعر CIL مقابل 10 مل من 10x stock) وإذا نما مبتدئك جيدًا ، يمكنك الحصول على نفس الكمية من $ ^ 2 mathrm {H} $، $ ^ {13} mathrm {C} $، $ ^ {15} mathrm {N} $ مقابل حول 405 دولار.


تحسين نمو الإشريكية القولونية في D₂O (الماء الثقيل) - علم الأحياء

أ جامعة جراتس ، معهد العلوم البيولوجية الجزيئية ، NAWI Graz ، 8010 Graz ، النمسا ، ب BioTechMed Graz، 8010 Graz، النمسا، ج مجال التميز BioHealth & # 8211 جامعة غراتس ، غراتس ، النمسا ، د معهد لاو & # 8211Langevin ، 38043 غرونوبل ، فرنسا ، و ه جامعة تينيسي ، مركز التكنولوجيا الحيوية البيئية ، نوكسفيل ، تينيسي ، الولايات المتحدة الأمريكية
* البريد الإلكتروني بالمراسلات: [email protected]، [email protected]

نموذج متعدد المقاييس تم الإبلاغ عنه سابقًا للأشعة السينية ذات الزاوية الصغيرة (فائقة) (USAXS / SAXS) وتشتت النيوترونات صغير الزاوية (جدًا) (VSANS / SANS) للعيش الإشريكية القولونية تم تنقيحها على أساس القيود التركيبية / الأيضية والبنية التحتية. تم تصميم الجسم الخلوي ، كما تم وصفه سابقًا ، بواسطة شكل بيضاوي ذو قذائف متعددة. ومع ذلك ، تم استبدال الانتثار الناشئ من الأسواط بمصطلح يمثل نوى قليلة السكاريد في نشرة عديدات السكاريد الدهنية للغشاء الخارجي بما في ذلك المصطلح المتقاطع مع الجسم الخلوي. كان الدافع الرئيسي وراء ذلك هو تجارب (U) SAXS التي أظهرت تشتت البكتيريا الذي لا يمكن تمييزه في وجود وغياب السوط أو fimbrae. نجح النموذج المنقح في تركيب USAXS / SAXS وبيانات VSANS / SANS المتناقضة بشكل مختلف بكتريا قولونية ATCC 25922 على أربع درجات من حيث الحجم في مقياس الطول. على وجه التحديد ، يوفر هذا النهج نظرة ثاقبة تفصيلية عن السمات الهيكلية للغلاف الخلوي ، بما في ذلك مسافة الأغشية الداخلية والخارجية ، فضلاً عن كثافات طول الانتثار لجميع الأجزاء البكتيرية. تم أيضًا تطبيق النموذج بنجاح على بكتريا قولونية K12 ، المستخدمة في النمذجة الأصلية للمؤلفين ، وكذلك لاثنين آخرين بكتريا قولونية سلالات. تم الكشف عن اختلافات معنوية بين السلالات المختلفة من حيث حجم البكتريا ، والمسافة بين الغشاء وتقلباتها الموضعية. تؤكد هذه النتائج التطبيق العام للنهج الموضح هنا لدراسة كمية تأثير المركبات المبيدة للجراثيم على ميزات البنية التحتية للبكتيريا سالبة الجرام دون الحاجة إلى اللجوء إلى أي عوامل تلطيخ أو توسيم غازية.

1 المقدمة

الإشريكية القولونية من بين السلالات البكتيرية سالبة الجرام الأكثر دراسة في علوم الحياة ، مع تقارير عديدة عن هيكلها وتكوينها (Breed & # 38 Dotterrer، 1916 Lieb وآخرون. ، 1955 Maclean & # 38 Munson، 1961 Neidhardt وآخرون. ، 1990 Seltmann & # 38 Holst، 2002 Silhavy وآخرون. ، 2010). لقد كان المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) أداة لا غنى عنها لاشتقاق البنية التحتية للخلية ، بمعنى آخر. بنية جدار الخلية البكتيرية بسمك عشرات النانومتر (Milne & # 38 Subramaniam ، 2009). ومع ذلك ، فقد تطلب الأمر جهودًا كبيرة لتقليل القيود الناشئة عن الطبيعة الغازية لهذه التقنية (Hobot وآخرون. ، 1984 ماتياس وآخرون. ، 2003). علاوة على ذلك ، لا يسمح TEM بالدراسات الديناميكية للبنية التحتية الخلوية في ظل الظروف الفسيولوجية ذات الصلة وبالتالي نظرة ثاقبة في الوقت الفعلي على تعديل بكتريا قولونية عن طريق المركبات المبيدة للجراثيم ، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات. تجارب تشتت الزاوية الصغيرة التي تم حلها عبر الزمن (Huxley وآخرون. ، 1980) ، قادرة على التحقيق في التغايرات الهيكلية على المقاييس (الفرعية) الميكرومترية للأطوال الفرعية دون الحاجة إلى استخدام ملصقات ضخمة أو تقنيات تلطيخ غازية ، هي الحلول الممكنة لهذه المشكلة [انظر على سبيل المثال Zemb & # 38 Lindner (2002) للحصول على نظرة عامة حول تقنيات التشتت]. فيما يتعلق بتجارب التوازن الثابتة ، فقد تم استخدام نثر النيوترونات صغير الزاوية (SANS) ، على سبيل المثال ، لسبر استجابة أغشية الثايلاكويد في البلاستيدات الخضراء الحية للمنبهات الخارجية (Liberton وآخرون. ، 2013 ناجي وآخرون. ، 2014) ، بينما تم تطبيق تحليل مكون أساسي لبيانات تشتت الأشعة السينية ذات الزاوية الصغيرة (SAXS) للحصول على بعض الأفكار النوعية حول تأثير المضادات الحيوية على بكتريا قولونية (فون جوندلاش ، جاراموس ، جورنياك وآخرون. ، 2016 von Gundlach، Garamus، Willey وآخرون. , 2016 ).

ومع ذلك ، فإن الحصول على نظرة كمية على البنية التحتية الدقيقة للخلية الحية باستخدام SAXS أو SANS يمثل تحديًا. هذا ببساطة لأن كلتا الطريقتين توفران متوسطًا عالميًا للمحتوى الخلوي بأكمله ، مما يجعل من الصعب للغاية تمييز المساهمين الفرديين (Semeraro وآخرون. ، 2020). يمكن معالجة ذلك من خلال الاستخدام المكثف لقدرات تباين التباين لـ SANS. على سبيل المثال النيكل وآخرون. (2017) كانت قادرة على النمو كاملة التالفة العصوية الرقيقة تتغذى بمزيج من الأحماض الدهنية البروتينية والمفسدة ، مما سمح لهم بإبراز المجالات النانومترية داخل الغشاء السيتوبلازمي للبكتيريا باستخدام SANS. ومع ذلك ، من الممكن أيضًا الحصول على نظرة ثاقبة حول البنية التحتية الخلوية دون الحاجة إلى نمو البكتيريا في D. 2 O. على وجه الخصوص ، أبلغنا مؤخرًا عن نموذج متعدد المقاييس يصف بنجاح شدة الحياة المتناثرة بكتريا قولونية K12 نشأت من تجارب Ultra-SAXS (USAXS) و SAXS و SANS في خمسة أيام 2 أوه 2 نسب O (Semeraro وآخرون. ، 2017). على وجه التحديد ، يطبق النموذج وصفًا أساسيًا & # 8211 قشرة لجسم الخلية ، ويتألف من فضاء سيتوبلازمي بيضاوي وجدار خلوي متعدد الطبقات ، ويتضمن مساهمات من السوط من حيث تجنب سلاسل البوليمر ذاتيًا (Doi & # 38 Edwards ، 1988). تم العثور على المكون الأخير ليساهم بشكل كبير في المقادير المتوسطة والعالية لمتجه الانتثار ف .

استمرار جهودنا لاستخدام تقنيات التشتت المرن لاستغلال البنية التحتية الدقيقة لـ بكتريا قولونية قادتنا إلى إجراء تجارب SAXS على بكتريا قولونية ATCC 25922 مع سوط عادي أو قصير ، و ATCC متحولة خالية من السوط & # 916 fliC مع النتيجة المدهشة لأنماط التشتت القابلة للتركيب بشكل أساسي (انظر الشكل S1 في المعلومات الداعمة). دفعنا هذا إلى مراجعة نموذج عامل الشكل التحليلي الخاص بنا بشكل شامل على أساس تقديرات قوية للتركيب الجزيئي للبكتيريا وتكاملها الهيكلي. تشمل هذه التقديرات الأحجام والأحجام والتركيزات والتوزيعات لجميع المكونات البكتيرية الرئيسية.

باختصار ، أهم التغييرات في نموذجنا البكتيري المنقح هي كما يلي: (1) تم اشتقاق قيود متوسط ​​كثافة طول التشتت (SLDs) لمقصورات الخلايا المختلفة من خلال اعتبار الجزيئات الكبيرة المكونة لها كأجسام منفصلة ، بما في ذلك تقديرات SLDs من الأيض. والأغشية (2) تم استبدال المساهمات من الأسواط بنوى قليلة السكاريد من عديدات السكاريد الدهنية (LPS) ، على غرار البوليمرات المطعمة و (3) تم تصميم الاختلافات في المسافة بين الأغشية بواسطة دالة توزيع احتمالية لوغاريتمية عادية (PDF) جنبًا إلى جنب مع إزالة التشتت المتعدد على نصف قطر الخلية من النموذج.

تم اختبار النموذج مقابل USAXS / SAXS وبيانات تشتت النيوترون بزاوية صغيرة جدًا (VSANS) / بيانات SANS بعشرة تباينات مختلفة من بكتريا قولونية ATCC 25922 ، ينتج عنه نوبات مرضية للغاية على النطاق الكامل لأحجام ناقلات الانتثار المسجلة (3 & # 8197 & # 215 & # 819710 & # 87223 & # 60 ف & # 60 7 & # 8197nm & # 87221). تتضمن هذه الاختبارات أيضًا نموذجًا أكثر تعقيدًا ، مع الأخذ في الاعتبار العصارة الخلوية ذات البنية غير المتجانسة وتتضمن على وجه التحديد الانتثار الناشئ عن الريبوسومات. أظهر تحليلنا ، مع ذلك ، أن مساهمة الريبوسوم في الانتثار الكلي تغمرها مساهمة جدار الخلية. تم أيضًا تطبيق النموذج الجديد بنجاح على بيانات USAXS / SAXS الخاصة بـ بكتريا قولونية تم استخدام K12 سابقًا لتصميم نموذجنا متعدد المقاييس (Semeraro وآخرون. ، 2017) ، بالإضافة إلى JW4283 الخالي من fimbra وسلالة Nissle 1917 ، مما يكشف عن اختلافات واضحة في ميزات البنية التحتية.

ويتمحور الورقة على النحو التالي. أولاً ، نلخص بإيجاز الطرق والعينات التجريبية ، قبل أن نوضح بالتفصيل النمذجة المنقحة في القسم 3 ، بما في ذلك قائمة شاملة بالبيانات التركيبية في المعلومات الداعمة. يصف القسم 4 نموذجًا تحليليًا للتشتت من محاسبة عصارة خلوية غير متجانسة للريبوسومات ويلخص القسم 5 المعلمات المعنية واستراتيجية التحسين المطبقة. نتائج تطبيق النمذجة على بيانات تجريبية خماسية مختلفة بكتريا قولونية يتم وصف السلالات ومناقشتها في القسم 6 ، قبل أن ننتهي في القسم 7.

2. المواد والأساليب

2.1. العينات البكتيرية

المستعمرات البكتيرية بكتريا قولونية سلالات ATCC 25922 ، K12 5K ، K12 JW4283 (بابا وآخرون. ، 2006) و Nissle 1917 (Sonnenborn ، 2016) في أطباق ليسوجيني مرق (LB) & # 8211agar (كارل روث ، كارلسروه ، ألمانيا) عند 310 & # 8197K. تم اشتقاق الثقافات الليلية (ONCs) من هذه المستعمرات عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في 3 & # 8197 مل من وسط LB (Luria / Miller ، Carl Roth) في أنابيب مخروطية معقمة من البولي بروبيلين (15 & # 8197 مل) ، مما يسمح بالنمو في ظل الظروف الهوائية لمدة 12 & # 821116 & # 8197h في حاضنة اهتزاز عند 310 & # 8197K. تم تحضير الثقافات الرئيسية عن طريق تعليق قسامة من ONCs في 10 & # 8197ml من وسط LB في 50 & # 8197ml من أنابيب مخروطية معقمة من البولي بروبيلين ، مما يسمح بنمو البكتيريا في نفس الظروف المطبقة على ONCs حتى منتصف مرحلة النمو الأسي. تم بعد ذلك غسل الخلايا على الفور مرتين وإعادة تعليقها في محلول ملحي خالٍ من المغذيات ومتساوي التوتر (PBS) (محلول الفوسفات 20 & # 8197m م ، NaCl 130 & # 8197m م ) عند درجة الحموضة 7.4 (سيجما ألدريتش ، فيينا ، النمسا). تم استخدام قياسات العكارة للسيطرة على تركيز البكتيريا. قيم الكثافة البصرية عند الطول الموجي & # 955 = 600 & # 8197 نانومتر (OD 600 ) باستخدام مقياس الطيف الضوئي Thermo Spectronic Genesys 20 (Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) [OD 600 = 1 & # 160 & # 8771 8 & # 8197 & # 215 & # 819710 8 وحدات تشكيل مستعمرات (CFU) لكل مليلتر]. في هذه العينات ، 1 & # 8197CFU يتوافق مع خلية واحدة. في حالة العينات المحتوية على د 2 O ، تم غسل المعلقات البكتيرية مرتين باستخدام PBS أو 90 & # 8197wt٪ D 2 O حلول PBS ، من أجل الحصول على اثنين من حلول المخزون المركز لكلا ظروف المخزن المؤقت. تم خلط هذين المخزنين وتخفيفهما إلى التراكيز البكتيرية المطلوبة و D. 2 محتويات O حسب الإعدادات التجريبية.

تم تحضير عينات ATCC بأقصى قدر من العناية من أجل الحفاظ على سلامة السوط. تم تحضير خلايا ATCC ذات الأسواط المجزأة ميكانيكيًا عن طريق قص التعليق خمس مرات من خلال حقنة 3 & # 8197 مل مزودة بإبرة قياس 22 ، كما وصفها تيرنر وآخرون. (2012). تم غسل المعلق في برنامج تلفزيوني للتخلص من شظايا السوط في المادة الطافية.

ATCC 25922 & # 916 fliC تم إنشاء السلالة عن طريق توصيل الملتهمة كما وصفها Silhavy وآخرون. (1984). تم نشر فجوة P1vir على سلالة YK4516 (Komeda وآخرون. ، 1980) باستخدام طريقة المحللة. يحتوي YK4516 على إدخال Tn10 بتنسيق fliC (fliC5303 :: Tn10) وتم شراؤه من The Coli Genetic Stock Center (جامعة ييل ، نيو هافن ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية). سلالة ATCC 25922 بمثابة المتلقي. تم اختيار المحولات على لوحات تحتوي على التتراسيكلين (10 & # 8197 & # 181g & # 8197ml & # 87221) و fli & # 8722 تم تأكيد النمط الظاهري عن طريق الإكتشاف على ألواح أجار شبه صلبة (0.3٪ أغروس).

2.2. الإعداد التجريبية

2.2.1. USAXS

تم إجراء قياسات USAXS / SAXS على خط أشعة TRUSAXS (ID02) في ESRF ، غرونوبل ، فرنسا. تستخدم الأداة شعاعًا أحادي اللون يتم موازنته في تكوين الثقب. تم إجراء القياسات بطول موجة 0.0995 & # 8197 نانومتر ومسافات من عينة إلى كاشف 30.8 و 3.0 و 1.2 & # 8197 م ، تغطي مساحة ف نطاق 0.001 & # 82117 & # 8197nm & # 87221 (Narayanan وآخرون. ، 2018). تم الحصول على أنماط التشتت ثنائية الأبعاد المقاسة على كاشف Rayonix MX170 ، وتم تطبيعها إلى المقياس المطلق ومتوسط ​​السمت للحصول على ملفات تعريف USAXS / SAXS أحادية البعد المقابلة. تم طرح الخلفية التراكمية الطبيعية من المخزن المؤقت وخلية العينة والأداة للحصول على النهائي أنا ( ف ). تم قياس العينات ذات التركيز البكتيري لـ & # 876410 10 & # 8197cells & # 8197ml & # 87221 عند 310 & # 8197K وتم احتواؤها في الشعيرات الدموية الكوارتز بقطر 2 & # 8197 مم ، مثبتة على إعداد تدفق من أجل زيادة دقة الخلفية الطرح.

2.2.2. VSANS

تم الحصول على قياسات VSANS / SANS على أداة D11 في معهد Laue & # 8211Langevin (ILL) ، غرونوبل ، فرنسا ، باستخدام كاشف متعدد الأسلاك 3 He من 256 & # 8197 & # 215 & # 8197256 & # 8197 بكسل (3.75 & # 8197 & # 215 & # 81973.75 & # 8197 مم). أربعة إعدادات مختلفة (مسافات من عينة إلى كاشف 2 و 8 و 20.5 و 39 & # 8197 م مع موازاة مقابلة تبلغ 5.5 و 8 و 20.5 و 40.5 & # 8197 م ، على التوالي) ، بطول موجة & # 955 = 0.56 & # 8197 نانومتر ( & # 916 & # 955 / & # 955 = 9٪) ، تغطية أ ف نطاق 0.014 & # 82113 نانومتر & # 87221. لتصل إلى مستوى منخفض للغاية ف ، مزيج من الطول الموجي الكبير (& # 955 = 2.1 نانومتر) ، اثنان يركزان MgF 2 عدسات ومرآة لإلغاء تأثيرات الجاذبية الضارة (فقدان النيوترونات في الموازاة وفقدان الدقة بسبب تلطخ الجاذبية على الكاشف) تم استخدام الإعداد الذي وصفه Cubitt وآخرون. (2011). تم قياس العينات (التركيز & # 876410 10 & # 8197cells & # 8197ml & # 87221) عند 310 & # 8197K واحتوت في قوالب كوارتز هيلما 120-QS على شكل بانجو بمسار 2 & # 8197 مم. تم تثبيتها على حامل عينة دوار ، مما منع البكتيريا من الترسب. تم تقليل البيانات مع خروف برنامج من ILL ، وأداء المجال المسطح ، والزاوية الصلبة ، والوقت الميت وتصحيح الإرسال ، والتطبيع عن طريق تدفق الحادث (عبر شاشة) ، وطرح المساهمة من خلية فارغة. الإعداد والبيانات التجريبية متاحة على https://doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-03-910.

2.2.3. ساكسس داخلي

تم استخدام الكاميرا المدمجة SAXSpace (Anton Paar ، Graz ، النمسا) المزودة بنظام كاشف Eiger R 1 M (Dectris ، Baden-Daettwil ، سويسرا) في تجارب SAXS المعملية. Cu & # 8197 ك & # 945 (& # 955 = 1.54 & # 197) تم توفير الأشعة السينية بواسطة 30 & # 8197W-Genix 3D microfocus X-ray Genix (Xenocs ، Sassenage ، فرنسا). تم أخذ العينات في الشعيرات الدموية الزجاجية (القطر: 1 & # 8197mm Anton Paar) وتمت معايرتها عند 310 & # 8197K لمدة 10 & # 8197 دقيقة قبل القياس باستخدام مرحلة عينة يتحكم فيها بلتيير (TC 150 ، Anton Paar). كان إجمالي وقت التعرض 30 & # 8197 دقيقة (6 إطارات من 5 & # 8197 دقيقة) ، مع ضبط مسافة العينة إلى الكاشف على 308 & # 8197 ملم. تم إجراء تقليل البيانات ، بما في ذلك تكامل البيانات القطاعية والتصحيحات لنقل العينات وتشتت الخلفية ، باستخدام البرنامج تحليل ساكس (انطون بار).

2.2.4. تفكك الضوء الديناميكي

تم إجراء القياسات باستخدام Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalytical ، Malvern ، UK). تم تعليق عينات ATCC 25922 و K12 5K (التركيز & # 876410 7 & # 8197cells & # 8197ml & # 87221) في أكواخ زجاجية بطول مسار 1 & # 8197 سم ومعايرة عند 310 & # 8197K. قدم هذا التركيز البكتيري نسبة إشارة إلى ضوضاء مثالية وتجنب تأثيرات التشتت المتعدد. تم تحليل البيانات تلقائيًا بواسطة البرنامج المزود (Malvern) ، والذي قدم ، من خلال تحليل تراكمي قياسي ، توزيعًا احتماليًا أحاديًا للتعداد البكتيري كدالة في نصف القطر الهيدروديناميكي ص ح . كان لكل توزيع متوسط ​​مؤشر تشتت متعدد قدره & # 87640.25 ، بسبب الاختلافات في أطوال الخلايا أثناء النمو والانقسام. متوسط ص ح تم حساب القيم والأخطاء المرتبطة بها من 18 قياسًا (ستة إطارات من ثلاثة أحجام عينات مختلفة). أدى عدم وجود مصادر الطاقة في برنامج تلفزيوني والدوامة القوية للعينات (تجزئة الأسواط) إلى تقليل حركية الخلية إلى الحد الأدنى ، مما يجعل المشي العشوائي البراوني هو الديناميكيات السائدة لهذه العينة.

3. مساهمات التشتت الشاملة والنمذجة التركيبية

يمكن اشتقاق وصف شامل للتشتت المرن من الخلايا بدائية النواة سالبة الجرام المعقدة من خلال النظر أولاً في مكوناتها الجزيئية وفوق الجزيئية السائدة ، ولكل منها نطاق محدد جيدًا من الأطوال والأحجام والكثافات ، والتي تعمل كدليل لبناء شامل نموذج عامل الشكل. تستند تقديرات مساهمة التشتت المطبقة هنا إلى أحدث التقارير التجريبية والحسابية في بكتريا قولونية ، بما في ذلك مكونات الخلايا المعزولة. على وجه التحديد ، استخدمنا المعلومات التركيبية والهيكلية حول بكتريا قولونية وجدارها الخلوي (Neidhardt وآخرون. ، 1990 Seltmann & # 38 Holst، 2002 Schwarz-Linek وآخرون. ، 2016) الفضاء السيتوبلازمي ومكوناته (Zimmerman & # 38 Trach ، 1991 Tweeddale وآخرون. ، 1998 Prasad Maharjan & # 38 Ferenci، 2003 Bennett وآخرون. ، 2009 قوه وآخرون. ، 2012 ليبيديف وآخرون. ، 2015) البنية التحتية البكتيرية الدقيقة (Hobot وآخرون. ، 1984 Beveridge، 1999 Matias وآخرون. ، 2003) تكوين وهيكل الغشاء الدهني (De Siervo، 1969 Oursel وآخرون. ، 2007 لونر وآخرون. ، 2008 Pandit & # 38 Klauda ، 2012 Ku & # 269erka وآخرون. ، 2012 ، 2015 ليبر وآخرون. ، 2018) تفاصيل LPS (Heinrichs وآخرون. ، 1998 M & # 252ller-Loennies وآخرون. ، 2003 كو و # 269erka وآخرون. ، 2008 كيم وآخرون. ، 2016 Rodriguez-Loureiro وآخرون. ، 2018 ميكسيولا وآخرون. ، 2019) الفضاء المحيطي (Burge وآخرون. ، 1977 لابيشينسكي وآخرون. ، 1991 وردي وآخرون. ، 2000 قان وآخرون. ، 2008) والمكونات البكتيرية الخارجية (Yamashita وآخرون. ، 1998 ويتفيلد & # 38 روبرتس ، 1999 ستوكالوف وآخرون. ، 2008 تيرنر وآخرون. ، 2012). تم تكثيف كل هذه المعلومات في SLDs & # 961 ، والتي تم تلخيصها في الشكل 1. للحصول على وصف تفصيلي ، راجع المعلومات الداعمة (SI).


شكل 1
تخطيطي لـ بكتريا قولونية التركيب والتكوين ، بما في ذلك الأحجام النموذجية ، وكذلك الأشعة السينية و SLDs للنيوترونات للمكونات الأكثر صلة. تم تصميم الشكل البكتيري بشكل ملائم بواسطة شكل إهليلجي ، كما هو مفصل بواسطة Semeraro وآخرون. (2017 ).

تصبح فائدة هذا الوصف التفصيلي واضحة عند النظر في قدرة SANS على إبطال أو تعزيز التباين لكيان جزيئي معين ، اعتمادًا على H المطبق 2 يا / د 2 نسبة يا. من أجل المشتتات المتجانسة في نظام مخفف ، بمعنى آخر. عندما يكون حجمها ، شدة التشتت الأمامي ، أنا (0) ، مرتبط بثبات التشتت ، س ، كما

أين الخامس هو حجم المشتت و & # 9001 & # 916 & # 961 2 & # 9002 هو متوسط ​​تباين التشتت التربيعي (بورود ، 1982). بالنسبة للأنظمة غير المتجانسة ، مثل الخلايا الحية المعقدة ، يمكن حساب متوسط ​​التباين كمتوسط ​​مرجح لحجم الكسر لتباين كل مقصورة خلية / نوع ، حيث & # 981 أنا هو حجم الكسر من أنا المكون ال. ومن ثم ، فإن التقديرات & # 981 أنا و & # 916 & # 961 أنا تمكننا من التقريب س لجميع المكونات البكتيرية [الشكل. 2 انظر أيضا النيكل وآخرون. (2017)]. يؤدي هذا التقريب إلى نقطة "مطابقة" للخلية بأكملها عند حوالي 40 & # 8197wt٪ D 2 O. في أعلى D 2 محتوى O ، تهيمن سلاسل الأسيل لشحوم الغشاء على كثافة الانتثار الكلية بشكل متزايد ، لأنها خالية من الماء. نحو الأسفل D 2 محتويات O ، والمكونات السيتوبلازمية ، مثل الريبوسومات والبروتينات ، هي العوامل المساهمة في التشتت المسيطر بدورها.


الشكل 2
الجذر التربيعي لثوابت بورود المقدرة س كدالة لـ D. 2 O wt٪ ، محسوبة لكل مكون باستخدام المعادلة (1) ومضروبة في حجم الخلية. يوضح الشكل الداخلي الاختلافات بين مساهمة نوى قليل السكاريد LPS (أخضر صلب) والسوط (وردي متقطع).

3.1. نموذج نثر متعدد المقاييس

كما ورد سابقا (Semeraro وآخرون. ، 2017) ، الجزء الرئيسي من بكتريا قولونية يمكن وصفها من حيث سعة تشتت الشكل الإهليلجي ذي الأصداف المتعددة (متعدد النواة & # 8211 قذيفة):

أين & # 961 أنا هي SLDs التي قدمها التركيب بكتريا قولونية متوسطات كل قذيفة من العرض & # 916 أنا ( ρ م +1 هي SLD للمخزن المؤقت) & # 968 هي الزاوية المتعلقة بكل اتجاه محتمل لكثرة في التعليق ص 1 هو نصف القطر الصغير للنواة السيتوبلازمية (CP) و & # 603> 1 هي النسبة بين الرئيسي ، & # 603 ص 1 ، ونصف القطر الصغير للقطع الناقص. بالإضافة إلى،

هو ناتج الحجم وسعة الانتثار المعيارية للقطع الناقص (Pedersen ، 1997) ، حيث

على الرغم من حقيقة أن الأسطوانات ستكون نماذج أكثر واقعية للشكل البكتيري ، فإن البروليتات لا تتسبب في عدم الاستقرار أثناء التركيب ، كما أن الاختلافات بين الأشكال الهندسية المتدرجة أو الأسطوانية لا تكاد تذكر في الفضاء المتبادل (Semeraro وآخرون. ، 2017). اختلاف كبير عن النموذج السابق (Semeraro وآخرون. ، 2017) بـ & # 961 أنا القيم المستخدمة كقيود مناسبة. هنا ، نظرنا ، بالنظر إلى المتاح ف النطاق ، وتشتت المساهمات من كل الأنواع الجزيئية (البروتينات ، الريبوسومات ، الحمض النووي إلخ .) بشكل فردي لحساب متوسط ​​SLDs. يؤثر هذا ، مقارنةً بالقيم المستخدمة سابقًا ، في جوهر & # 961 أنا تستند تقديرات السيتوبلازم & # 8211 الآن على التحليل الأيضي & # 8211 والأغشية الفسفورية (الشكل 1). على عكس تجارب التشتت المرن على تقليد الدهون فقط ، لا يمكن حل المعلمات الهيكلية لكل طبقة ثنائية مفردة في سياق تحليل الخلية الكاملة (Semeraro وآخرون. ، 2020). ومن ثم ، فإن & # 916 أنا و & # 961 أنا تم اعتبار قيم كلا الغشاءين معلمات ثابتة (انظر الشكل رقم 1601 مزيد من التفاصيل حول & # 916 أنا و & # 961 أنا ترد في SI).

كان الجزء الحجمي للمعلقات البكتيرية & # 88040.007 ومن ثم فإن وجود عامل بنية بين الخلايا للتفاعلات أمر غير محتمل.

يمكن القول إن الاختلافات الأكثر وضوحًا مقارنة بالنموذج السابق ناتجة عن الأسواط ، التي تمت إضافة نثرها سابقًا من حيث عامل البنية الشبيه بالبوليمر مما أسفر عن مساهمات كبيرة في أنا ( ف ) ل ف > 0.06 & # 8197nm & # 87221 (سيمرارو وآخرون. ، 2017). ومع ذلك ، من المدهش أن مقارنة بيانات SAXS الخاصة بـ ATCC 25922 الأصلي ، ATCC مع سوط قصير مكسور جسديًا (Turner وآخرون. ، 2012) وخالية من الجلد & # 916 fliC أظهر متحولة ATCC شدة تشتت لا يمكن تمييزها في ف النطاق الذي كان يعتقد سابقًا أنه يهيمن عليه السوط (الشكل S1). وبالتالي ، لا تساهم الأسواط بشكل كبير في بكتريا قولونية نثر إشارة. لاحظ أن سلامة الخيوط السوطية في الثقافات البكتيرية الشائعة غير مضمونة ، لأن الطرد المركزي المفرط أو خطوات التلاعب بالعينة غير المبالية تؤدي بسهولة إلى تفتيتها (Schwarz-Linek وآخرون. ، 2016). حتى لو لم نتمكن من ضمان أن عينة ATCC المرجعية تمتلك سوطًا سليمًا تمامًا ، فقد تم تحضير المعلقات البكتيرية المستخدمة في هذا العمل بعناية فائقة. سمح لنا بروتوكول تحضير العينة نفسه بالحصول على بكتيريا متحركة (Semeraro وآخرون. ، 2018) ، مما يشير إلى أنه تم الحفاظ على سلامة السوط إلى حد ما على الأقل.

أدت محاولة تصحيح شدة التشتت المفقودة في نموذجنا متعدد المقاييس إلى النظر في المساهمات الناشئة عن النوى الداخلية والخارجية قليلة السكاريد (OS). في البداية ، تم تعديل الوظيفة بواسطة غلاف جديد يصف نوى نظام التشغيل ، مما أدى إلى نتائج غير مادية (الشكل S2). على وجه الخصوص ، & # 961 الأشعة السينية اقترح & # 8771 15 & # 8197 & # 215 & # 819710 & # 87224 & # 8197nm & # 87222 لطبقة نظام التشغيل أن يتم طرد الماء ، وهو ما يتعارض مع تجارب قياس الانعكاس النيوتروني على طبقات LPS المدعومة والتي توضح أن ترطيب النوى الداخلية والخارجية يتراوح من 40 إلى 80 & # 8197vol٪ (Clifton وآخرون. ، 2013 رودريغيز - لوريرو وآخرون. ، 2018 ميكسيولا وآخرون. ، 2019). لذلك قررنا تصميم نوى نظام التشغيل من حيث الكتل المطعمة على سطح الخلية الخارجي. تم تقريب كل نواة بواسطة بوليمر سلسلة Gaussian ، مما يستلزم تطبيق الشكلية الغروانية المطعمة بالبوليمر (Pedersen & # 38 Gerstenberg ، 1996). تم إعطاء عامل شكل التشتت لمثل هذا النظام بواسطة (Pedersen ، 2000)

أين ن نظام التشغيل هو عدد نوى نظام التشغيل و & # 946 نظام التشغيل = الخامس نظام التشغيل ( ρ نظام التشغيل − ρ فرنك بلجيكي ) هو نتاج كل حجم وتباين SLD مع المخزن المؤقت ،

هو عامل الهيكل لسلسلة غاوسية ، و

اتساع نثرها. x = ( qR ز ) 2 أين ص ز هو نصف قطر دوران نواة نظام التشغيل. المصطلح & # 934 ( ف ، & # 8197 & # 968) في المعادلة (5) يتعلق "بالمصطلح المتقاطع" الناتج عن التوزيع المنتظم لنوى نظام التشغيل على طول السطح الإهليلجي لبكتيريا واحدة (Pedersen ، 2000) ويُعطى بواسطة

حيث ، وفقًا لـ (4) ، +. هنا، ص خارجي = ص 1 + Δ خارجي هو نصف القطر الذي يصف السطح الخارجي للخلية.

شدة التشتت الكلية لتعليق الحياة بكتريا قولونية خلايا كثافة العدد ن ثم يقرأ كـ

أين هو المتوسط ​​التوجيهي ويصف التشتت المتعدد لسمك الفضاء المحيطي. على وجه التحديد ، قمنا بتطبيق دالة التوزيع اللوغاريتمي العادي إل ( ص ). يأخذ الثابت في المعادلة (9) في الحسبان الخلفية المتناثرة عند الارتفاع ف الناشئة من مساهمات غير محددة. التوزيع اللوغاريتمي الطبيعي للسمك المحيطي يعتني بالقطع الأدنى في تقلبات المسافة بين الغشاء ، والتي تُعطى بالحجم المحدود لبنية جدار الخلية. لاحظ أن الاختلافات في حجم الخلية لم تؤخذ في الاعتبار بسبب المعالجة الزائدة في الواقع ، أدى التشتت المتعدد على نصف قطر الخلية إلى تغييرات طفيفة في الوسط إلى العالي ف نطاق، بمعنى آخر. ف & # 8805 0.05 & # 8197nm & # 87221.

4. النظر في عصارة خلوية منظمة بشكل غير متجانس

من المشروع التساؤل عما إذا كان يمكن حل البنية الخلوية الداخلية على الأقل جزئيًا بواسطة SAXS / SANS. من أجل معالجة هذه المشكلة ، استنتجنا وظيفة تشتت تحليلي أكثر تعقيدًا يمكن اختبارها مقابل البيانات التجريبية.

لنبدأ بالنظر في الحالة العامة للكرة (نصف القطر: ص 0 SLD: & # 961 0 ) معلق في وسيط & # 961 م ، تحتوي ن حبات كروية متطابقة أصغر ( ص 1 , ρ 1 ) ، حيث المسافة النسبية بين خرزتين ص أنا < ص 0ص 1 . سعة الانتثار لهذا النظام هي

أين & # 946 0 = ( ρ 0 − ρ م ) الخامس 0 و & # 946 1 = ( ρ 1 − ρ 0 ) الخامس 1 ، و الخامس 0 , الخامس 1 , أ 0 و أ 1 هي ، على التوالي ، أحجام الكرة وخرزة واحدة ، وسعات الانتثار الطبيعية للكرة والخرزة. المتجه ص م يحدد جميع المسافات النسبية بين الخرزات الداخلية. عامل الشكل الإجمالي [ ص ( ف ) = | أ ( ف ) | 2] ثم يقرأ ك

حيث يكون المصطلح الأول هو عامل الشكل للكرة ، فإن المصطلح الثاني هو إجمالي كثافة التشتت للكرة ن الخرز الداخلي والثالث يصف الحد المتقاطع بين الكرة والخرز. تم الإبلاغ عن نهج مشابه لنمذجة الهيكل الداخلي لنظام البوليمر المشترك "ثنائي الطور" (Keerl وآخرون. ، 2009). هنا ، بافتراض ص1 & lt & lt ص0 و ن & # 8594 & # 8734 ، يمكن للمرء أن يصف تقريبًا الجزء الداخلي من هذا المجال على أنه نظام أساسي مجهري. يتيح ذلك تطبيق متوسط ​​المجموعة الكنسي على مجموع المعادلة (11) (Klein & # 38 D'Aguanno ، 1996) ، مما يؤدي إلى

أين س ss ( ف ) مع عامل البنية للتفاعلات بين الخرزات. يحدد التجميع داخل التكامل الكثافة المجهرية لـ ن خرز. يتوافق متوسط ​​مجموعتها مع كثافة الجسيم المفرد ، والتي ، بسبب الثبات الانتقالي لنظام متجانس ، تساوي متوسط ​​كثافة الخرزة ن / الخامس 0 (Klein & # 38 D'Aguanno ، 1996). ومن ثم ، فإن التكامل كله يساوي ببساطة غير متوفر 0 ( ف ) ، مما يعطي الشكل النهائي لعامل شكل نظام الخرزة الكروية:

يتم تعديل المصطلح المتقاطع من خلال سعة الانتثار المقيسة للكرة ، أ 0 ( ف ) ، وهو ما يعادل الالتواء لتوزيع متجانس للخرز داخل حجم كرة نصف قطر ص 0 . الأهم من ذلك ، أن هذا الشكل النهائي للمصطلح المتقاطع لا يعتمد على الحجم الأصلي للكرة التي تستضيف المجالات الصغيرة. أي ، حتى لو كانت الحبيبات مقيدة داخل منطقة معينة من الكرة & # 8211 كما في حالة الريبوسومات ، والتي تنقسم بشكل أساسي إلى المنطقة غير النووية من السيتوبلازم & # 8211 تحجيم هذا المصطلح المتقاطع لا تغيير.

في الخطوة التالية ، نترجم نظام الخرزة الكروية إلى حالة عصارة خلوية بكتيرية غير متجانسة. هذا يتطلب بعض التقريبات. بادئ ذي بدء ، وبتشجيع من حقيقة أن شدة التشتت تتناسب مع مربع حجم الجسيم ، فإننا نركز على المساهمات الناشئة من الريبوسومات. وبشكل أكثر تحديدًا ، الريبوسومات ذات الحجم الخامس رب & # 8771 2800 & # 8197nm 3 ، العدد الإجمالي ن رب & # 8771 (1 & # 8722 6) & # 8197 & # 215 & # 819710 4 و ص ز = 8.77 & # 8197nm (Zimmerman & # 38 Trach، 1991 Lebedev وآخرون. ، 2015) هي المشتتات الخلوية المسيطرة في حالة الأشعة السينية أو النيوترونات في غياب الماء الثقيل (الشكل 2 و SI ، للتكوين السيتوبلازمي والكسور الحجمية). ثانيًا ، نقترب من تشتت الريبوسومات عند مستوى منخفض جدًا ف , بمعنى آخر. في نظام غينييه حتى الحد الأدنى الأول من عامل شكل التشتت ، من خلال تشتت مجال "فعال" من الخامس رب = 2800 & # 8197nm 3 مع ص رب = 11 & # 8197nm. ثالثًا ، نفترض أن التفاعلات المختلطة مع الجزيئات الكبيرة ذات الحجم والشكل والشحنة الصافية المختلفة (بروتينات العصارة الخلوية) تؤدي إلى فعالية عامة. س ss ( ف ) & # 8771 1. علاوة على ذلك ، نقوم بتبسيط التعديل عبر المدى بواسطة مجسم إهليلجي مضغوط ، مع إهمال ذلك الريبوسومات المحتجز إلى المنطقة غير النوكليوتيدية ، ولا نقوم بتضمين نوى نظام التشغيل المطعمة في المدى المتقاطع.

ثم يتم إعطاء الشكل النهائي للكثافة المتناثرة ، مع الأخذ في الاعتبار المساهمات من الريبوسومات

أين & # 946 رب = الخامس رب ( ρ رب − ρ سيتو ), أ رب هي سعة تشتت الريبوسومات المقيسة تقريبًا بواسطة كرة مكافئة و أ سيتو هو اتساع الانتثار الطبيعي للبروليت الذي يصف الفضاء السيتوبلازمي ( بمعنى آخر. فقط الجزء المركزي من النواة & # 8211 تحديد نظام قذيفة).

5. استراتيجية المعلمة والتحسين

جميع المعلمات اللازمة لوصف SAS المرنة من بكتريا قولونية ملخصة في الجدول 1. بشكل عام ، نفرق بين المعلمات التي تعتمد أو لا تعتمد على التجربة الفردية ( على سبيل المثال تركيز العينة ، تناثر التباين). يُطلق على المعلمات الخاصة بالتجربة اسم "محلي" ، بينما يُطلق على المعلمات الأخرى اسم معلمات "عالمية".

الجدول 1
نظرة عامة على معلمات النموذج متعدد المقاييس المنقح للعيش بكتريا قولونية تشتت ( راجع . المعادلتان 9 و 14)

تم إصلاح المعلمات التي تصف التفاصيل الهيكلية للغشاء السيتوبلازمي (CM) والغشاء الخارجي (OM) وفقًا للقيم المبلغ عنها من التجارب والمحاكاة على أنظمة محاكاة الغشاء لـ بكتريا قولونية أغشية الخلايا (De Siervo ، 1969 Oursel وآخرون. ، 2007 لونر وآخرون. ، 2008 Pandit & # 38 Klauda ، 2012 Ku & # 269erka وآخرون. ، 2012 ، 2015 ليبر وآخرون. ، 2018) ، على النحو المفصل في الجدول 2 (انظر أيضًا الشكل 1 و SI). يمكن تبرير هذا القرار من خلال عدم وجود ميزات تشتت مميزة لـ ف > 0.27 & # 8197nm & # 87221 ، المقابلة لمسافات & # 876420 & # 8197nm. وبالتالي ، فإن السمات الهيكلية & # 880420 & # 8197nm ، على الرغم من أنها تساهم في التشتت الكلي ، يصعب حلها بدقة مناسبة. لاحظ أن بروتينات الغشاء تعامل بشكل مشابه للبروتينات الموجودة في الأجزاء الأخرى حيث تضيف الأجسام بشكل فردي إلى الكثافة المتناثرة وبالتالي لا تساهم في متوسط ​​SLDs للأغشية الداخلية والخارجية. بالمقارنة مع الانتثار الكلي الناتج عن جسم الخلية ، يمكن أن تظهر مساهمتها الإجمالية على أنها ضئيلة. وبالمثل ، فإن عرض طبقة الببتيدوغليكان (PG) ، دبليو PG ، ونصف قطر دوران نواة نظام التشغيل ، ص ز ، نظام التشغيل ، تم تثبيتها على القيم الواردة في الجدول 2 بعد تحليل مساهماتها. دبليو PG تم الإبلاغ عن قيم & # 87646 نانومتر (Matias وآخرون. ، 2003) ، والمحاكاة في النطاق 2.5 & # 82117.5 & # 8197nm (Labischinski وآخرون. ، 1991) أدت إلى اختلافات طفيفة في & # 961 PG . علاوة على ذلك ، فإن تقديراتنا تظهر ذلك ص ز ، نظام التشغيل & # 60 1 & # 8197nm (انظر SI). ومع ذلك ، لا تؤدي الاختلافات في قيمتها ضمن هذا القيد إلى تغييرات كبيرة داخل نموذج التشتت لدينا ، لأن ص خارجيص ز ، نظام التشغيل .

الجدول 2
قائمة قيم المعلمات الثابتة

أخيرًا ، تم إصلاح النسبة بين نصف القطر الإهليلجي الرئيسي والصغير ، & # 603 ، لسلالات ATCC و K12. كان هذا الاختيار مدفوعًا بأقل الخيارات المتاحة ف النطاق الذي لا يصل إلى هضبة جينير للتشتت البكتيري وبالتالي لا يسمح بتحديد دقيق لطول الخلية. لذلك استخدمنا تشتت الضوء الديناميكي لتقدير متوسط ​​الطول أولاً ، إل ج ، من ، باستخدام ص ز  ≃  ص ح والقيم النموذجية المبلغ عنها ل ص خارجي في الأدب. أدى ذلك إلى & # 8197nm و & # 8197nm. الناتج & # 603 & # 160 = إل ج /(2 ص خارجي ) تم تنقيح القيم لاحقًا في بعض عمليات التشغيل الاختبارية لإجراء التحسين لبيانات USAXS / SAXS باستخدام ص خارجي كمعلمة قابلة للتعديل ثم ثابتة لتحليل USAXS / SAXS و VSANS / SANS المفصل ، مما ينتج عنه القيم المذكورة في الجدول 2.

نظرًا لتعقيد النظام والعدد الكبير من المعلمات ، تم إجراء تحسين المعلمات القابلة للتعديل باستخدام خوارزمية الاختيار الجيني مونت كارلو (Banzhaf وآخرون. ، 1998). باختصار ، يتم تخطيط الخوارزمية في سلسلة من الخطوات التي تتكرر في كل دورة ( توليد ). كخطوة صفرية ، تم إنشاء تسعة تسلسلات منخفضة التباين (أرقام شبه عشوائية) لكل معلمة ( الجين ) ضمن حدود محددة ، بناءً على التقديرات التركيبية (انظر SI). تسع مجموعات من المعلمات ( فرادى ) بعد ذلك كمدخلات لاختبار عدد متساوٍ من منحنيات كثافة التشتت الممكنة (الخطوة 1 ، تقييم ). تضمن ذلك حساب تسع قيم قياسية مرجحة لمربع كاي كـ

أين ن مجانا هو عدد المعلمات المجانية و & # 963 أنا هو الخطأ المرتبط بالقياس أنا البيانات، أنا في حد معين ف أنا . الأربعة فقط فرادى ذات أدنى قيم & # 967 2 تم تحديدها (الخطوة 2 ، اختيار ) لتوليد أول النسل تتكون من ثمانية جديدة فرادى التي تم إنشاؤها عن طريق خلط عشوائي في الجينات من بين الآباء الأربعة المختارين (الخطوة 3 ، إعادة التركيب ). التاسع الجديد فرد كانت نسخة من الأصل بأقل قيمة & # 967 2 (القاعدة 1: ميراث الأفضل ). بعد إعادة التركيب ، كل الجين لديه احتمال محدود للتغير (الخطوة 4 ، طفره ). بالإضافة إلى ذلك ، كان هناك احتمال محدود لاستبدال الكل فرد مع مجموعة جديدة تمامًا تم إنشاؤها عشوائيًا الجينات (القاعدة 2: الغريب ). هذا البناء الجديد النسل أنهى الدورة الأولى ، وكل منهما فرد تم تقييمه مرة أخرى على أساس قيم & # 967 2 (العودة إلى الخطوة 1). تكررت العملية حتى كانت التغييرات من الأدنى أقل من 0.5٪ لمدة 25 متتالية أجيال .

ال طفره تسمح الخطوة والقاعدة 2 للخوارزمية بتخطي الحدود الدنيا المحلية المحتملة في المشهد & # 967 2 ، بينما تتيح القاعدة 1 تقاربًا سريعًا للتركيب. لاحظ أنه ، باستثناء إنشاء المجموعة الأولية من فرادى ، تم استخدام الأرقام شبه العشوائية في الخوارزمية بأكملها لعمليات صنع القرار في إعادة التركيب و طفره الخطوات وللقاعدة 2. لاحظ أيضًا أن عدد السكان الأولي أكبر (> 9 فرادى ) لم ينتج عنه زيادة في الوقت الحسابي. كل جديد شبه عشوائي الجين كانت مقيدة دائمًا داخل الحدود الأولية ، من أجل ضمان الحفاظ على المعنى المادي للنتائج. في المجموع ، تم تركيب كل منحنى نثر 500 مرة ، واستخدمت فقط التركيبات المتقاربة (معيار التقارب) لاسترداد القيم المتوسطة والانحرافات المعيارية لكل معلمة.

في حالة SANS ، فإن ملف ف - تم أيضًا أخذ تلطيخ الأدوات المعتمد في الاعتبار. تم تحقيق ذلك من خلال الالتواء القياسي

أين جي (ف) هو ملف تعريف غاوسي طبيعي للعرض & # 916 ف ( ف ). & # 916 ف ( ف ) القيم كدالة لـ ف تم إصلاح المعلمات أثناء التركيب وتم توفيرها بواسطة معالجة البيانات الأولية D11. في المقابل ، كان تأثير التلطيخ الآلي ضئيلًا بالنسبة لبيانات SAXS.

6. النتائج والمناقشة

6.1 تحليل SAXS / SANS العالمي

تم اختبار النموذج متعدد المقاييس المنقح مقابل بيانات USAXS / SAXS و VSANS / SANS بكتريا قولونية إجهاد ATCC 25922. تم جمع عشر مجموعات بيانات SANS بظروف تباين مختلفة ، متفاوتة D. 2 O من 0 إلى 90 & # 8197wt٪ (زيادات 10 & # 8197wt٪). تم الإبلاغ عن نتائج تحليل بيانات SAXS / SANS المجمعة في الشكل 3 والجدولين 3 و S1. تين. 3 ( أ ) يسلط الضوء على المساهمات المختلفة من نموذج الصدفة متعدد النواة & # 8211 ، ونوى نظام التشغيل ومجموع المصطلحين المتقاطعين [انظر المعادلة (5)] في أنظمة USAXS و SAXS. مساهمة التشتت من الوظيفة الأساسية & # 8211 شل ، بمعنى آخر. يسيطر جسم الخلية بالإضافة إلى جدار الخلية على كثافة التشتت الناتجة عن نوى نظام التشغيل ، بسبب الاختلاف الهائل في الكتلة. ومع ذلك ، فإن المصطلح المتقاطع ، كونه دالة لسطح الخلية بالكامل ، مسؤول بشكل أساسي عن تعديل الشدات المتناثرة بين ف & # 8771 0.1 & # 8197nm & # 87221 و ف & # 8771 0.3 & # 8197nm & # 87221. هذا يؤدي إلى ميل متوسط ​​بين ف & # 87221.5 و ف & # 87222 في هذا النظام ، وهو توقيع نموذجي للأنظمة المطعمة ، ويسمى أيضًا "تشتت النقطة" (Pedersen ، 2000). في السابق ، كان يُنظر إلى هذا النظام على أنه يهيمن عليه السوط ، الموصوف بمصطلح بوليمر يتجنب نفسه ذاتي المشي (Semeraro وآخرون. ، 2017). ومع ذلك ، لا يصف هذا التغيير الظاهر في المنحدر عند ف & # 8771 0.04 نانومتر & # 87221 وميزة التشتت في ف & # 8771 0.1 & # 8197nm & # 87221 ، والذي يبدو أنه خاص بسلالة ATCC (انظر الشكل S3) ولكن ليس K12 (انظر أدناه). ومن ثم ، فإن مصطلح OS-core يتيح وصفًا كاملاً لـ ف تتراوح بين 0.03 و 0.2 & # 8197nm & # 87221.

الجدول 3
تناسب النتائج للمعلمات العالمية التي تصف USAXS / SAXS و VSANS / SANS من بكتريا قولونية سلالة ATCC 25922

تم حساب الأخطاء من الانحرافات المعيارية لمجموعة التركيبات المتقاربة. انظر الجدول S1 للحصول على نتائج حول المعلمات المحلية.


الشكل 3
( أ ) تحليل بيانات USAXS / SAXS لـ بكتريا قولونية ATCC 25922 باستخدام المعادلة (9) ، تسليط الضوء على المساهمات من مصطلحات مختلفة (لا يتم عرض القيم السلبية للمصطلح المتقاطع). ( ب ) تحليل بديل لنفس البيانات باستخدام المعادلة (14) ، والتي تبين مساهمات الريبوسومات. تظهر المقارنة مع التوافق باستخدام المعادلة (9) (الخط الأسود المتقطع) اختلافات طفيفة. ( ج ) بيانات VSANS / SANS من نفس السلالة في D المختار 2 تباين O (انظر الشكل S4 للحصول على بيانات نيوترونية إضافية). تم تحجيم منحنيات التشتت من أجل رؤية أفضل.

أظهرت محاولات ملاءمة البيانات نفسها مع نموذج المحاسبة الأكثر تعقيدًا للريبوسومات [المعادلة (14)] مساهمات تشتت ضئيلة من الجزيئات الكبيرة [الشكل. 3 ( ب )]. على وجه الخصوص ، كانت جودة الملاءمة والنتائج العامة القابلة للتعديل متطابقة في خطأ التحليل. وبالتالي ، فإن مصطلح الريبوسوم ، إلى جانب المصطلح المتقاطع المرتبط به ، لا يكاد يذكر مقارنة بمساهمة جدار الخلية. لاحظ أن بيانات SAXS أو SANS هي أقل وزن٪ من D 2 يا حساسة لاختبار هذه المساهمة. تهيمن مساهمة سلسلة الأسيل على بيانات بلا حدود بمحتوى أعلى من الماء الثقيل (الشكل 2). علاوة على ذلك ، تتكون الريبوسومات من أحماض أمينية و RNA ، والتي سوف تتطابق بشكل مختلف ، وبالتالي تتحدى التحليل. لاحظ أن ن رب كانت المعلمة الوحيدة القابلة للتعديل لهذا التحليل. الخامس رب و ص رب تم إصلاح القيم كما هو مفصل في القسم 4. ومن المثير للاهتمام أن نتيجة هذا الاختبار أدت إلى عدد أقل بكثير من الريبوسومات ( ن رب & # 8771 500) من تقديراتنا لـ ن رب & # 8771 10 4 بعد Zimmerman & # 38 Trach (1991) (انظر SI). من المحتمل أن يكون هذا مرتبطًا بالتباين المنخفض لهذه الجزيئات في البيئة السيتوبلازمية المحلية. حيث أن القياس يتناسب مع ن رب ( ρ رب − ρ CP ) 2 ، الاختلافات الصغيرة في التباين الفعال تحرف بسهولة تحديد عدد الجزيئات الكبيرة.

الأهم من ذلك ، يوضح هذا التحليل ليس فقط أن إشارة الانتثار الفعالة من الريبوسومات لا تكاد تذكر ، ولكن أيضًا يمكن تطبيق اعتبارات مماثلة على المكونات الخلوية الأخرى. ومع ذلك ، نظرًا لصغر حجمها (البروتينات) أو جزء الحجم الأصغر (الحمض النووي والحمض النووي الريبي) ، فإنها ستساهم بشكل أقل في الكثافة الكلية المتناثرة. ومن ثم ، فإن تقنيات التشتت المرن ليست مناسبة للتمييز بين الأجزاء المنظمة بشكل مختلف داخل العصارة الخلوية في الخلايا البكتيرية الحية. الأمر نفسه ينطبق على بروتينات الغشاء (انظر أعلاه) أو البروتينات الموجودة في الفضاء المحيط بالببتيدوجليكان وطبقة الببتيدوغليكان.

يعرض الشكل 3 تحليل بيانات مختارة من VSANS / SANS في تباينات مختارة ( ج ) (يتم عرض المجموعة الكاملة لبيانات تشتت النيوترونات ونوباتها في الشكل S4). من الواضح أن الملاءمة باستخدام المعادلة (9) تلتقط بدقة جميع التغييرات في شدة التشتت عند تغيير D 2 تركيزات O ، تقديم دعم قوي لنهجنا في النمذجة. تم تلخيص المعلمات الناتجة التي تشكل ملامح الأشعة السينية والنيوترونية SLD للمظروف البكتيري في الشكل 4 ، مرة أخرى عند تباينات النيوترونات المختارة (انظر الشكل S5 لجميع أشكال SLD النيوترونية). الاختلافات الصغيرة بين المسافات في صور الأشعة السينية وملامح النيوترون ، وكذلك المعلمات العالمية (الجدول 3) ، ترجع إلى التباين البيولوجي للعينات ، ولكنها ، باستثناء ن نظام التشغيل ، لا يزال ضمن نطاق ثقة النتائج. عند 10 & # 8197 بالوزن ٪ د 2 إن اختلافات التباين بين الألواح المختلفة قابلة للمقارنة مع تلك التي تم الحصول عليها من بيانات SAXS. كانت شدة التشتت في هذه الحالات قابلة للمقارنة أيضًا من حيث ميزات التشتت في ف & # 8771 0.1 و 0.3 & # 8197nm & # 87221 (الشكل 3). بدوره ، عند 40 د 2 O & # 8197wt٪ (وبالمثل حتى 90 & # 8197wt٪ D 2 O) ، على النقيض من الأجزاء الفرعية البكتيرية عالية الرطوبة (طبقة PG إلخ .) أقل بكثير من التباين الرئيسي للمناطق الكارهة للماء للغشاءين [الشكل. 4 ( ب )]. تؤدي هذه الخاصية إلى التحول في ميزة التشتت من ف & # 8771 0.27 & # 8197nm & # 87221 إلى ف & # 8771 0.2 & # 8197nm & # 87221 [الشكل. 3 ( ج )] ، والتي ترتبط بشكل أساسي بالمسافة بين الغشاء. هذا في اتفاق نوعي جيد مع التقدير الثابت (الشكل 2) ، مما يشير إلى أن كثافة التشتت تهيمن عليها المساهمة من منطقة سلسلة الأسيل لـ D 2 O & # 8805 40 & # 8197wt٪.


الشكل 4
( أ ) ملف تعريف الأشعة السينية SLD للبنية التحتية البكتيرية لسلالة ATCC 25922 ، المقابلة للملاءمة الموضحة في الشكل 3 ( أ ). تسلط اللوحة الضوء على متوسط ​​مواضع كل من الغشاء السيتوبلازمي والغشاء الخارجي ، وطبقة الببتيدوغليكان. يصف الإحداثي المسافة من مركز الخلية على طول نصف القطر الصغير ص . ( ب ) ملامح محددة من النيوترونات SLD لنفس السلالة [ راجع . تين. 3 ( ج )]. انظر أيضًا الجدول S1.

من أجل اختبار إستراتيجية النمذجة الخاصة بنا ، قمنا بالإبلاغ عن تباين SLDs المختلفة مع D 2 يا محتوى. نظرًا لأن المذيب يصل بحرية إلى المساحات السيتوبلازمية والحيوية ، يجب أن تعرض هذه المؤامرات تبعية خطية. في الواقع ، اتبعت الاتجاهات السلوك المتوقع ، مما مكننا أيضًا من حساب نقاط التطابق للمقصورات الفردية [الشكل. 5 ( أ )𔃃 ( ج )]. لاحظ أنه تم إصلاح قيم SLD لمجموعات رأس الفسفوليبيد المائية (الجدول 2). في حالة & # 946 نظام التشغيل ، يتم استبدال مساهمات التشتت بالإشارة الصادرة من المسافة بين الغشاء لـ D 2 O & # 60 60 & # 8197wt٪. الاتجاه الخطي لـ & # 946 نظام التشغيل لذلك تم تحديده في النطاق 0 & # 872250 & # 8197wt ٪ ، ثم استقراء إلى أعلى D 2 O تركيزات باستخدام حدود الثقة. تم استخدام نتائج هذا التحليل لاشتقاق الثابت الفعال المقاس كدالة لـ D 2 س بالوزن٪ [الشكل. 5 ( د )]. المقارنة مع المقدر س يُظهر تحولًا في الحد الأدنى من القيمة المقدرة 40 & # 8197wt٪ إلى المقاس 50 & # 8197wt٪ D 2 O ، ربما بسبب مساهمة أكبر من المكونات التي تهيمن في D. 2 O & # 8804 30 & # 8197wt٪ (الشكل 2). من ناحية أخرى ، هذه المكونات هي الجزيئات الكبيرة التي ثبت أن لها مساهمة تشتت ضئيلة.


الشكل 5
( أ ), ( ب ) قطع من السيتوبلازم (الدوائر الحمراء) ، و periplasm (المربعات الخضراء) و peptidoglycan (مثلثات برتقالية) SLDs ، جنبًا إلى جنب مع التركيبات الخطية ونقاط المطابقة. كانت SLDs لطبقات مجموعة الرأس الفسفورية معلمات ثابتة (مثلثات زرقاء). ( ج ) قطعة أرض & # 946 نظام التشغيل (الدوائر الأرجوانية) ، جنبًا إلى جنب مع النوبات الخطية ونقاط المطابقة. ( د ) مقارنة بين الاستطارة المقدرة الثابتة والانتثار الأمامي المستقراء.

يمكن العثور على إجابة هذه المفارقة في غياب تمييز الحجم الصافي بين الجزيئات الكبيرة التي تتشتت بشكل فردي ويتم تضمينها في متوسطات SLD. ترجمة توزيع الكتلة الجزيئية من الترشيح الهلامي لبروتينات العصارة الخلوية (Zimmerman & # 38 Trach ، 1991) إلى دالة توزيع احتمالية الحجم ينتج عنه قيمة قصوى عند أصغر حجم بروتين تم اكتشافه في تجاربنا (انظر SI). ومن ثم ، فمن المحتمل أن يتم تضمين جزء من أصغر البروتينات البكتيرية في المعلمة & # 961 CP . قيمنا المجهزة لـ & # 961 CP هي في الواقع أكبر من SLDs المقدرة للمستقلبات في حالة كل من تحليل SAXS و SANS (قارن الشكل 1 والجدول S1). على أي حال ، تم استخدام Invarant المقدر فقط كدليل قيم لنمذجة لدينا. من الواضح أن المعادلة (1) تفقد صحتها في حالة المعلقات الكثيفة والمزدحمة ، ويجب استخدام معادلة جديدة لحساب كل جزء من الحجم لتقديرات محسنة (Porod ، 1982).

6.2 مقارنة بين السلالات المرتبطة بـ ATCC و K12

بعد التحقق الناجح من نموذجنا متعدد المقاييس المنقح للعيش بكتريا قولونية ATCC ، اختبرنا ما إذا كان النموذج الجديد ينطبق أيضًا على الطرازات الأخرى بكتريا قولونية سلالات. يوضح الشكل 6 بيانات USAXS / SAXS لسلالات K12 5K و JW4283 و Nissle 1917 مقارنةً بـ ATCC. اللافت للنظر أن أنماط التشتت لـ K12 5K و JW4283 (وهي خالية من fimbria) و Nissle 1917 قابلة للتركيب من أجل ف > 0.06 & # 8197nm & # 87221 ، مما يشير إلى أن ميزات البنية التحتية الأساسية محفوظة في هذه السلالات ويؤكد أن وجود fimbriae لا يساهم في SAXS. لاحظ أيضًا أن طرازنا السابق يناسب تمامًا جميع سلالات K12. مواضع دنيا مختلفة من الشدة المتناثرة في الأسفل ف القيم بسبب الأحجام المختلفة للسلالات المختلفة ، بدلاً من ذلك.


الشكل 6
تحليل متعدد المقاييس لبيانات USAXS / SAXS لسلالات ATCC و K12 و K12 JW4283 الخالية من fimbria و Nissle 1917. يُظهر الشكل الداخلي مخططات ملف PDF ذو السجل العادي لـ & # 916 OM قيم سلالات ATCC (حمراء صلبة) و K12 (خضراء متقطعة). ملفات PDF لـ JW4283 و Nissle 1917 قابلة للمقارنة مع K12 وبالتالي لا تظهر.

الأهم من ذلك ، أن نموذجنا الجديد قادر على ملاءمة جميع السلالات ، كما يتضح من الاتفاق العام الممتاز مع البيانات التجريبية (الشكل 6). تم الإبلاغ عن المعلمات الهيكلية الناتجة عن هذا التحليل في الجدولين 4 و S2. معظم هذه المعلمات ذات حجم مماثل. اختلافات كبيرة تتعلق بحجم الخلية ( ص ، & # 603) & # 8211 كما لوحظ في المواضع المختلفة للحد الأدنى للتشتت (الشكل 6) ، عدد نوى نظام التشغيل ( ن نظام التشغيل ) والمسافة بين الغشاء (& # 916 OM , σ OM ). الأخير مرتبط بسمك الفراغ الفعلي المحيط بالسمك عبر & # 916 OM = (2 دبليو أنا + د سم + د OM ) / 2 (انظر الشكل S6 لمحات الأشعة السينية SLD). تكون كل من سماكة periplasmic وتقلبها أصغر بالنسبة للسلالات المرتبطة بـ K12 مقارنةً بـ ATCC. لاحظ أن & # 916 OM بالنسبة لـ K12 5K يتوافق مع القيمة التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا لسلالة مماثلة (Semeraro وآخرون. ، 2017). على الرغم من اختلاف & # 916 OM و & # 963 OM بالنسبة لسلالات ATCC و K12 ، فإن حجم التقلبات النسبية & # 963 OM / Δ OM تم حفظ & # 8771 (0.16 & # 8211 0.22) تقريبًا.

الجدول 4
نتائج ملائمة لمجموعة المعلمات المحلية المجانية لتحليل USAXS / SAXS لسلالات ATCC 25922 و K12 5K و JW4283 و Nissle 1917

بالنظر إلى الاختلافات في حجم الخلية ، نجد ، وفقًا لسطح الخلية ، أمرًا يتبع K12 5K (2.8 & # 8197 & # 215 & # 819710 6 & # 8197nm 2) & # 60 Nissle 1917 (3.3 & # 8197 & # 215 & # 819710 6 & # 8197nm 2) & # 8771 ATCC 25922 (3.4 & # 8197 & # 215 & # 819710 6 & # 8197nm 2) & # 60 JW4283 (4.5 & # 8197 & # 215 & # 819710 6 & # 8197nm 2). من المتوقع أن تقترن الاختلافات في حجم الخلية بعدد جزيئات LPS التي تهيمن على النشرة الخارجية للمغلف الخلوي. في الواقع، ن نظام التشغيل يتبع تقريبًا الترتيب الملاحظ للسطح الخارجي للبكتيريا (الجدول 4). التطبيع ن نظام التشغيل تؤدي قيم السطح الخارجي البكتيري إلى كثافة سطح LPS تبلغ 1.3 & # 82111.5 & # 8197nm & # 87222. ومع ذلك ، نظرًا لأن مساحة المقطع العرضي لكل LPS هي & # 87641.6 & # 8197nm 2 (Clifton وآخرون. ، 2013 Micciulla وآخرون. ، 2019 كيم وآخرون. ، 2016) ، كثافة السطح المتوقعة هي & # 87640.6 & # 8197nm & # 87222. التناقض بين التقديرين هو على الأرجح بسبب التقليل من السطح البكتيري من خلال النظر في التقريب الكبير ، أو عدم اليقين الذي قدمه & # 946 نظام التشغيل التي ، مثل ن نظام التشغيل ، تقيس مساهمات التشتت من السكريات قليلة الكثافة وشروطها المتقاطعة [المعادلة (5)]. يمكن أن يرتبط عامل إضافي بخشونة السطح البكتيري (Alves وآخرون. ، 2010) ، مما يؤدي إلى سطح فعال أكبر مما هو مذكور هنا في تقديرنا البسيط.

أخيرًا ، المسافة من المركز إلى المركز بين طبقة PG و OM & # 916 PG & # 8771 17 & # 8197nm ، مع SLD للأشعة السينية & # 961 PG & # 8771 10.2 & # 8197 & # 215 & # 819710 & # 87224 & # 8197nm & # 87221 لجميع المدروسين حاليًا بكتريا قولونية سلالات. في السابق ، أبلغنا عن & # 916 PG & # 8771 11 & # 8197nm (سيمرارو وآخرون. ، 2017) ، والذي يبدو أنه أكثر اتساقًا مع طول البروتينات الدهنية التي تربط خيوط الببتيدوغليكان بالغشاء الخارجي. قد يكون هذا الانحراف عن القيمة المتوقعة بسبب أوضاع التذبذب لـ & # 916 PG التي لا ترتبط ارتباطًا كاملاً بتلك الخاصة بـ & # 916 OM ، والتي تم نمذجتها هنا بواسطة دالة التوزيع اللوغاريتمي العادي. إنشاء دالة توزيع منفصلة / مقترنة جزئيًا لمتغيرات & # 916 PG ، هو أبعد من القرار التجريبي الحالي ، ومع ذلك. في المقابل ، تتوافق قيمتنا الجديدة لـ (وأيضًا لـ ATCC) مع قيم الترطيب المُبلغ عنها لطبقة الببتيدوغليكان ، بمعنى آخر. 80 & # 821190 & # 8197vol ٪ (لابيشينسكي وآخرون. ، 1991 وردي وآخرون. ، 2000). تضمنت القيمة المبلغ عنها سابقًا ، & # 876411.6 & # 8197 & # 215 & # 819710 & # 87224 & # 8197nm & # 87221 ، وجود الأنواع الجزيئية في متوسط ​​SLD.

7. الخاتمة

تشابه بيانات SAXS الأصلية وخالية من السوط / fimbria بكتريا قولونية دفعتنا السلالات إلى مراجعة نموذج عامل شكل التشتت الذي تم الإبلاغ عنه مسبقًا (Semeraro وآخرون. ، 2017) للبكتيريا سالبة الجرام بكتريا قولونية . تم استبدال المساهمة السوطية من خلال النظر في التشتت من النوى الداخلية والخارجية قليلة السكاريد للسكريات الدهنية ، من حيث نموذج البوليمر المطعمة. يعتمد النموذج المقدم هنا على تقديرات تركيبية وتركيبية مفصلة للأطوال المميزة والأحجام وكثافات أطوال الانتثار لكل مكون خلوي وبالتالي يوحد عقودًا من البحث حول بكتريا قولونية البنية التحتية والتركيب الجزيئي في وظيفة تشتت شاملة واحدة. تتيح قابلية تطبيق النموذج المشتق على تجارب نثر الأشعة السينية والنيوترونات استخدام التقنية القوية لتباين التباين من أجل إبراز أو إبطال المساهمات من حجرات بكتيرية محددة.

ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أن تجارب SANS المدمجة (U) SAXS / (V) ليست حساسة لعدم التجانس الهيكلي للسيتوبلازم حيث أن إشارة التشتت للجزيئات الكبيرة المكونة لها غارقة في المساهمة من غلاف الخلية. وبالمثل ، فإن التحليل المشترك غير قادر على الإبلاغ عن الاختلافات في نطاق النانومتر الفرعي ، لا سيما بالنسبة للأغشية السيتوبلازمية أو الخارجية ، مثل السماكة أو عدم التناسق التركيبي على سبيل المثال لا الحصر. لذلك تم إصلاح اختلافات SLD الأساسية لـ CM و OM عند القيم المفصلة في الجدول 2 ، جنبًا إلى جنب مع عرض طبقة الببتيدوغليكان والفاعلية. ص ز من كل نواة قليلة السكاريد. في المقابل ، فإن تقنيتنا حساسة للغاية للحجم الخلوي الكلي ، ومتوسط ​​التباين بين المساحة السيتوبلازمية والحيوية ، وهيكل الغلاف الخلوي. يتضمن الأخير المسافة بين الأغشية السيتوبلازمية والأغشية الخارجية ، بالإضافة إلى تقلباتها المتوسطة ، والمسافة بين طبقة الببتيدوغليكان والغشاء الخارجي. التحذير المحتمل لنموذجنا هو أن المعلمات & # 946 نظام التشغيل , ن نظام التشغيل و & # 916 PG لا يمكن تحديده إلا نوعيا.على وجه التحديد ، يتأثر العدد الإجمالي لجزيئات LPS (نوى oligosaccaride) بتقريب غلاف البكتيريا بسطح إهليلجي ، بينما يبدو أن المسافة بين طبقة الببتيدوغليكان والغشاء الخارجي تعتمد على وظيفة توزيع المسافة بين الغشاء المستخدمة. بشكل عام ، تظهر متانة نموذجنا من خلال اتفاق ممتاز للمعلمات المشتقة مع مجموعة كبيرة من الأدبيات بكتريا قولونية البنية التحتية.

في الختام ، تجارب التشتت المرن على الهواء مباشرة بكتريا قولونية توفر قيمًا متوسطة للمجموعة لخصائص بكتيرية خاصة بالبنية التحتية دون الحاجة إلى وضع العلامات الغازية ، وهي مكملة للفحص المجهري الإلكتروني أو الفحص المجهري البصري. هنا نبلغ عن الاختلافات بين خمسة ه & # 160 كولي سلالات ، والتي كانت بشكل رئيسي بسبب الحجم الكلي والمسافات بين الغشاء (الجدول 6). قد تستغل الأبحاث المستقبلية هذه المنصة لاكتشاف تأثيرات ظروف نمو العينة المختلفة أو تأثيرات المركبات المبيدة للجراثيم مثل المضادات الحيوية. على وجه الخصوص ، فإن الجمع بين تحليلنا مع (U) SAXS المليلي ثانية الذي تم حله بمرور الوقت يتيح الكشف الحركي لنشاطهم. يستكشف مختبرنا حاليًا مثل هذا النهج للببتيدات المضادة للميكروبات. نلاحظ أيضًا أن استنباط نماذج مماثلة لسلالات مختلفة (بما في ذلك البكتيريا موجبة الجرام والكائنات الحية والخلايا البسيطة الأخرى) يتطلب جودة مماثلة من المعلومات التكميلية لتعيين قيود مادية مناسبة للمعلمات القابلة للتعديل. ومع ذلك ، فإن النموذج المعروض هنا يوفر طرقًا وإرشادات حول كيفية التعامل مع مثل هذه المساعي.

دعم المعلومات

شكر وتقدير

ESRF & # 8211 تم الاعتراف بالسينكروترون الأوروبي ومعهد Laue & # 8211Langevin (ILL) لتوفيرهما ، على التوالي ، SAXS (مقترح LS-2869) و SANS (exp. 8-03-910). يشكر المؤلفون أيضًا الدعم المخبري للزوار في EMBL Grenoble لتوفير الوصول إلى المعدات المختبرية لإعداد العينات البكتيرية أثناء تجارب SAXS و SANS. المؤلفون ممتنون للدعم الذي قدمته T. Narayanan لقياسات USAXS / SAXS ، بالإضافة إلى المناقشات والمشورة المثمرة ، و N. Malanovic لمشاركتها خبرتها حول الثقافات البكتيرية. أخيرًا ، يشكر المؤلفون موظفي معهد Mol & # 173ecular Biosciences و beamline ID02 و D11 على الدعم والتوافر.

معلومات التمويل

تم إجراء هذا العمل في إطار مشروع صندوق العلوم النمساوي (FWF) رقم P30921 (الذي تم منحه لـ KL).

مراجع

Alves، CS، Melo، MN، Franquelim، HG، Ferre، R.، Planas، M.، Feliu، L.، Bardaj & # 237، E.، Kowalczyk، W.، Andreu، D.، Santos، NC، Fernandes، MX & # 38 Castanho ، MARB (2010). J. بيول. تشيم. 285 ، 27536 & # 821127544. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
Baba، T.، Ara، T.، Hasegawa، M.، Takai، Y.، Okumura، Y.، Baba، M.، Datsenko، KA، Tomita، M.، Wanner، BL & # 38 Mori، H. ( 2006). مول. النظام. بيول. 2 ، 1 & # 821111. شبكة العلوم CrossRef Google & # 160Scholar
Banzhaf، W.، Nordin، P.، Keller، R.E & # 38 Francone، F. D. (1998). البرمجة الجينية مقدمة ، المجلد. 1. سان فرانسيسكو: إلسفير. جوجل & # 160Scholar
بينيت ، بي دي ، كيمبال ، إي إتش ، جاو ، إم ، أوسترهوت ، آر ، فان ديين ، إس جيه آند # 38 رابينوفيتز ، جي دي (2009). نات. تشيم. بيول. 5 ، 593 & # 8211599. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
بيفريدج ، تي جيه (1999). J. باكتيريول. 181 ، 4725 & # 82114733. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Breed ، R. S. & # 38 Dotterrer ، W. D. (1916). J. باكتيريول. 1 ، 321 & # 8211331. CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Burge ، R.E ، Fowler ، A.G & # 38 Reaveley ، D.A (1977). جيه مول. بيول. 117 ، 927 & # 8211953. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google & # 160Scholar
Clifton ، L.A ، Skoda ، M.W A. ، Daulton ، E.L ، Hughes ، A. ، Le Brun ، A.P ، Lakey ، J.H & # 38 Holt ، S.A (2013). J.R Soc. واجهه المستخدم. 10 ، 20130810. شبكة العلوم CrossRef PubMed Google & # 160Scholar
Cubitt ، R. ، Schweins ، R. & # 38 Lindner ، P. (2011). نوكل. الصك. طرق فيز. الدقة. أ , 665 ، 7 & # 821110. شبكة العلوم CrossRef Google & # 160Scholar
دي سيرفو ، أ.جيه (1969). J. باكتيريول. 100 ، 1342 & # 82111349. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google & # 160Scholar
Doi، M. & # 38 Edwards، S.F (1988). نظرية ديناميات البوليمر ، السلسلة الدولية للدراسات في الفيزياء ، المجلد. 73. مطبعة جامعة أكسفورد. جوجل & # 160Scholar
Gan ، L. ، Chen ، S. & # 38 Jensen ، G.J. (2008). بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية , 105 ، 18953 & # 821118957. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Gundlach ، A.R von ، Garamus ، V.M ، Gorniak ، T. ، Davies ، H. A. ، Reischl ، M. ، Mikut ، R. ، Hilpert ، K. & # 38 Rosenhahn ، A. (2016). بيوكيم. بيوفيز. اكتا , 1858 ، 918 & # 8211925. Web of Science PubMed Google & # 160Scholar
Gundlach ، A.R von ، Garamus ، V.M ، Willey ، T.M ، Ilavsky ، J. ، Hilpert ، K. & # 38 Rosenhahn ، A. (2016). J. أبل. كريست. 49 ، 2210 & # 82112216. Web of Science CrossRef IUCr المجلات Google & # 160Scholar
Guo، AC، Jewison، T.، Wilson، M.، Liu، Y.، Knox، C.، Djoumbou، Y.، Lo، P.، Mandal، R.، Krishnamurthy، R. & # 38 Wishart، DS ( 2012). الدقة الأحماض النووية. 41 ، D625 & # 8211D630. شبكة العلوم CrossRef PubMed Google & # 160Scholar
Heinrichs، D.E، Yethon، J.A & # 38 Whitfield، C. (1998). مول. ميكروبيول. 30 ، 221 & # 8211232. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
هوبوت ، جي إيه ، كارليمالم ، إي ، فيليجر ، دبليو & # 38 كيلينبرغر ، إي (1984). J. باكتيريول. 160 ، 143 & # 8211152. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google & # 160Scholar
هكسلي ، هـ. ، فاروقي ، أ. ، بورداس ، ج. ، كوخ ، إم & # 38 ميلش ، ج. (1980). طبيعة سجية , 284 ، 140 & # 8211143. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google & # 160Scholar
Keerl، M.، Pedersen، J. S. & # 38 Richtering، W. (2009). جيه. تشيم. شركة 131 ، 3093 & # 82113097. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Kim، S.، Patel، D. S.، Park، S.، Slusky، J.، Klauda، J.B، Widmalm، G. & # 38 Im، W. (2016). بيوفيز. ج. 111 ، 1750 & # 82111760. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
كلاين ، ر. & # 38 داجوانو ، ب. (1996). تشتت الضوء: المبادئ والتنمية ، حرره W. Brown، ch. 2. أكسفورد: مطبعة كلارندون. جوجل & # 160Scholar
Komeda ، Y. ، Kutsukake ، K. & # 38 Iino ، T. (1980). علم الوراثة , 94 ، 277 & # 8211290. CAS PubMed Web of Science Google & # 160Scholar
Ku & # 269erka، N.، Holland، B.، Pan، J.، Heberle، F. A.، Gray، C.G، Tomberli، B. & # 38 Katsaras، J. (2012). بيوفيز. ج. 102 ، 504a & # 8211505a. جوجل & # 160Scholar
Ku & # 269erka، N.، van Oosten، B.، Pan، J.، Heberle، F.A، Harroun، T.A & # 38 Katsaras، J. (2015). J. فيز. تشيم. ب , 119 ، 1947 & # 82111956. Web of Science PubMed Google & # 160Scholar
Ku & # 269erka، N.، Papp-Szabo، E.، Nieh، M.-P.، Harroun، TA، Schooling، SR، Pencer، J.، Nicholson، EA، Beveridge، TJ & # 38 Katsaras، J. ( 2008). J. فيز. تشيم. ب , 112 ، 8057 & # 82118062. Web of Science PubMed Google & # 160Scholar
Labischinski ، H. ، Goodell ، E.W ، Goodell ، A. & # 38 Hochberg ، M. L. (1991). J. باكتيريول. 173 ، 751 & # 8211756. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google & # 160Scholar
ليبيديف ، د. ، باليسكافا ، أ ، شفيتكوف ، أ ، بولياكوفا ، إم ، إيزييف إيفانوف ، ف. & # 38 كونيفيجا ، إيه إل (2015). تقرير تجريبي LS 2406. ESRF & # 8211 السنكروترون الأوروبي ، غرونوبل ، فرنسا. جوجل & # 160Scholar
Leber ، R. ، Pachler ، M. ، Kabelka ، I. ، Svoboda ، I. ، Enkoller ، D. ، V & # 225cha ، R. ، Lohner ، K. & # 38 Pabst ، G. (2018). بيوفيز. ج. 114 ، 1945 & # 82111954. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
Liberton ، M. ، Page ، L.E ، O'Dell ، W.B ، O'Neill ، H. ، Mamontov ، E. ، Urban ، V. S. & # 38 Pakrasi، H.B (2013). J. بيول. تشيم. 288 ، 3632 & # 82113640. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
ليب ، إم ، ويجل ، ج. ج. & # 38 كلينبرغر ، إي (1955). J. باكتيريول. 69 ، 468 & # 8211471. CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Lohner ، K. ، Sevcsik ، E. & # 38 Pabst ، G. (2008). التطورات في مستو ليبيد بلييرز و ليبوسوميس ، المجلد. 6 ، ص 103 & # 8211137. أمستردام: إلسفير. جوجل & # 160Scholar
ماكلين ، إف آي & # 38 مونسون ، آر جيه (1961). J. الجنرال ميكروبيول. 25 ، 17 & # 821127. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google & # 160Scholar
ماتياس ، ف.ر.ف ، العمودي ، أ. ، دوبوشيت ، ج. J. باكتيريول. 185 ، 6112 & # 82116118. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Micciulla ، S. ، Gerelli ، Y. & # 38 Schneck ، E. (2019). بيوفيز. ج. 116 ، 1259 & # 82111269. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
Milne ، J.L.S & # 38 Subramaniam، S. (2009). نات. القس ميكروبيول. 7 ، 666 & # 8211675. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
M & # 252ller-Loennies ، S. ، Lindner ، B. & # 38 Brade ، H. (2003). J. بيول. تشيم. 278 ، 34090 & # 821134101. Web of Science PubMed Google & # 160Scholar
Nagy، G.، & # 220nnep، R.، Zsiros، O.، Tokutsu، R.، Takizawa، K.، Porcar، L.، Moyet، L.، Petroutsos، D.، Garab، G.، Finazzi، G . & # 38 Minagawa، J. (2014). بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية , 111 ، 5042 & # 82115047. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
Narayanan، T.، Sztucki، M.، Van Vaerenbergh، P.، L & # 233onardon، J.، Gorini، J.، Claustre، L.، Sever، F.، Morse، J. & # 38 Boesecke، P. ( 2018). J. أبل. كريست. 51 ، 1511 & # 82111524. Web of Science CrossRef CAS IUCr المجلات Google & # 160Scholar
Neidhardt ، F. C. ، Ingraham ، J.L & # 38 Schaechter ، M. (1990). فسيولوجيا الخلية البكتيرية: نهج جزيئي . سندرلاند: سينيور أسوشيتس. جوجل & # 160Scholar
Nickels، J.D، Chatterjee، S.، Stanley، C.B، Qian، S.، Cheng، X.، Myles، D.A A.، Standaert، R.F، Elkins، J.G & # 38 Katsaras، J. (2017). بلوس بيول. 15 ، e2002214. شبكة العلوم CrossRef PubMed Google & # 160Scholar
Oursel ، D. ، Loutelier-Bourhis ، C. ، Orange ، N. ، Chevalier ، S. ، Norris ، V. & # 38 Lange ، C.M (2007). التواصل السريع. كتلة الطيف. 21 ، 1721 & # 82111728. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Pandit ، K.R & # 38 Klauda ، J.B (2012). بيوكيم. بيوفيز. اكتا , 1818 ، 1205 & # 82111210. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
بيدرسن ، ج.س. (1997). حال. علوم واجهة الغروانية. 70 ، 171 & # 8211210. CrossRef CAS Web of Science Google & # 160Scholar
بيدرسن ، ج.س (2000). J. أبل. كريست. 33 ، 637 & # 8211640. Web of Science CrossRef CAS IUCr المجلات Google & # 160Scholar
Pedersen ، J. S. & # 38 Gerstenberg ، M.C (1996). الجزيئات الكبيرة , 29 ، 1363 & # 82111365. CrossRef CAS Web of Science Google & # 160Scholar
Pink ، D. ، Moeller ، J. ، Quinn ، B. ، Jericho ، M. & # 38 Beveridge ، T. (2000). J. باكتيريول. 182 ، 5925 & # 82115930. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
بورد ، ج. (1982). تشتت الأشعة السينية ذات الزاوية الصغيرة ، حرره O. Glatter & # 38 O. Kratky، ch. 2. لندن: مطبعة أكاديمية. جوجل & # 160Scholar
براساد ماهارجان ، R. & # 38 Ferenci ، T. (2003). شرجي. بيوتشيم. 313 ، 145 & # 8211154. CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Rodriguez-Loureiro، I.، Latza، V.M، Fragneto، G. & # 38 Schneck، E. (2018). بيوفيز. ج. 114 ، 1624 & # 82111635. Web of Science CAS PubMed Google & # 160Scholar
Schwarz-Linek، J.، Arlt، J.، Jepson، A.، Dawson، A.، Vissers، T.، Miroli، D.، Pilizota، T.، Martinez، V.A & # 38 Poon، W.C K. (2016). الأمواج الغروية. واجهات بيولوجية , 137 ، 2 & # 821116. Web of Science CAS PubMed Google & # 160Scholar
Seltmann ، G. & # 38 Holst ، O. (2002). جدار الخلية البكتيرية ، الطبعة الأولى. برلين ، هايدلبرغ: Springer-Verlag. جوجل & # 160Scholar
Semeraro، E.F، Devos، J.M & # 38 Narayanan، T. (2018). J. كيم. فيز. 148 ، 204905. شبكة العلوم CrossRef PubMed Google & # 160Scholar
Semeraro، E.F، Devos، J.M، Porcar، L.، Forsyth، V. T. & # 38 Narayanan، T. (2017). IUCrJ , 4 ، 751 & # 8211757. Web of Science CrossRef CAS PubMed IUCr المجلات Google & # 160Scholar
Semeraro ، E.F. ، Marx ، L. ، Frewein ، M.P.K & # 38 Pabst ، G. (2020). مادة ناعمة , 17 ، 222 & # 8211232. شبكة العلوم CrossRef Google & # 160Scholar
Silhavy ، T. J. ، Berman ، M.L & # 38 Enquist ، L.W (1984). تجارب الاندماج الجيني. مختبر كولد سبرينج هاربور. جوجل & # 160Scholar
Silhavy ، T. J. ، Kahne ، D. & # 38 Walker ، S. (2010). كولد سبرينج حرب. وجهة نظر. بيول. 2 ، a000414. شبكة العلوم CrossRef PubMed Google & # 160Scholar
سونينبورن ، يو. (2016). FEMS ميكروبيول. بادئة رسالة. 363 ، Fnw212. جوجل & # 160Scholar
Stukalov، O.، Korenevsky، A.، Beveridge، T.J & # 38 Dutcher، J.R (2008). تطبيق بيئة. ميكروبيول. 74 ، 5457 & # 82115465. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
تيرنر ، إل ، ستيرن ، إيه إس آند # 38 بيرج ، إتش سي (2012). J. باكتيريول. 194 ، 2437 & # 82112442. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
تويدديل ، إتش ، نوتلي ماكروب ، إل آند # 38 فيرينسي ، ت. (1998). J. باكتيريول. 180 ، 5109 & # 82115116. شبكة العلوم CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
ويتفيلد ، سي & # 38 روبرتس ، آي إس (1999). مول. ميكروبيول. 31 ، 1307 & # 82111319. شبكة العلوم CrossRef PubMed CAS Google & # 160Scholar
Yamashita ، I. ، Hasegawa ، K. ، Suzuki ، H. ، Vonderviszt ، F. ، Mimori-Kiyosue ، Y. & # 38 Namba ، K. (1998). نات. هيكل. بيول. 5 ، 125 & # 8211132. CrossRef CAS PubMed Google & # 160Scholar
Zemb، T. & # 38 Lindner، P. (2002). النيوترونات والأشعة السينية والضوء: طرق التشتت المطبقة على المادة اللينة المكثفة. سلسلة دلتا شمال هولندا. أمستردام: إلسفير. جوجل & # 160Scholar
Zimmerman، S.B & # 38 Trach، S. O. (1991). جيه مول. بيول. 222 ، 599 & # 8211620. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google & # 160Scholar

هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution (CC-BY) ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ بأي وسيلة ، بشرط ذكر المؤلفين الأصليين والمصدر.


مقدمة

تلعب فسفرة البروتين دورًا أساسيًا في أحداث إشارات الخلايا ، ويمكن أن يكون لخلل التنظيم عواقب مرضية. 1،2 تم تركيز الكثير من الجهود على التحليل العالمي لمواقع فسفرة البروتين وعلى الإنزيمات التي تتحكم في إشغال الفوسفوزيت. 3 في حين أن أكثر بقايا الأحماض الأمينية الفسفرة التي تمت دراستها جيدًا هي السيرين ، والثريونين ، والتيروزين ، فقد لوحظت فسفرة الأحماض الأمينية الأخرى ، وفي بعض الحالات كانت معروفة لعدة عقود. 4 & # x022126 على وجه الخصوص ، تم اكتشاف الفوسفوهستيدين (pHis) لأول مرة منذ أكثر من 50 عامًا في ميتوكوندريا الكبد البقري ، 7 ومنذ ذلك الحين تم اكتشافه في أنظمة حقيقية النواة وبدائية النواة. في بدائيات النوى ، تلعب الأس الهيدروجيني أدوارًا مهمة في أنظمة إشارات ثنائية / متعددة المكونات وفي تسهيل امتصاص السكر من خلال نظام فسفوينول بيروفات فسفوترافيس (PTS). 8،9 في حقيقيات النوى ، لوحظ أن الرقم الهيدروجيني هو تعديل تنظيمي ديناميكي أو مشارك إنزيمي مباشر في سياق الكروماتين ، واستقلاب الكربون المركزي ، ونشاط قناة الأيونات. 4 ومع ذلك ، على عكس الفوسفوسرين (pSer) ، و phosphothreonine (pThr) ، و phosphotyrosine (pTyr) ، لا يزال يُعرف القليل نسبيًا عن تعديل الرقم الهيدروجيني. تم إعاقة التقدم في دراسة الأس الهيدروجيني بشكل كبير بسبب الافتقار إلى أدوات البحث المتاحة 4 ويرجع ذلك في جزء كبير منه إلى الطبيعة القابلة للتغير لشق فوسفوراميديت الرقم الهيدروجيني. يطلق التحلل المائي للفوسفوراميدات في الأس الهيدروجيني ما يقرب من ضعف طاقة الفوسفويستر في pSer أو pThr أو pTyr (& # x00394جي& # x000b0 من التحلل المائي & # x0221212 إلى & # x0221213 kcal / mol مقابل & # x022126.5 to & # x022129.5 kcal / mol). وفقًا لذلك ، في ظل الظروف الحمضية ، يتحلل الرقم الهيدروجيني بسرعة إلى حمض الفوسفوريك والهيستيدين ، مع نصف عمر & # x0003c30 ثانية في 1 مولار حمض الهيدروكلوريك. وبالتالي ، فإن إزالة الفسفرة السهلة من الرقم الهيدروجيني جعلت دراسات بيولوجيا الرقم الهيدروجيني صعبة للغاية. 4

للتغلب على هذه القيود ، طور مختبرنا مؤخرًا أجسامًا مضادة يمكنها التعرف على الرقم الهيدروجيني. في البداية ، قمنا بتطوير جسم مضاد متعدد الأضلاع للأرنب خاص بالتسلسل إلى هيستون H4 الفسفوري ، باستخدام ببتيد H4 هيستون اصطناعي مع نظير ثابت ، فسفوريلتريازوليل ألانين (بتزا). 10 في الآونة الأخيرة ، قمنا بتوليد جسم مضاد pHis مستقل عن التسلسل باستخدام جزيء صغير ، phosphoryltriazolyl ethylamine (pTze) ، على النحو التالي. 11 باستخدام هذا الجسم المضاد لعموم الأس الهيدروجيني ، جنبًا إلى جنب مع تحليلات مقياس الطيف الكتلي (MS) ، قمنا بتمييز فسفرة الهيستيدين لـ الإشريكية القولونية سينسيز PEP (PpsA) والتغيرات في مستويات هذا التعديل كدالة لحالة الخلية. 11 خلال هذه الدراسة ، لاحظنا أن أيونات الببتيد pHis تعرض باستمرار مجموعة من الخسائر المحايدة المتميزة عند التجزئة عن طريق التفكك الناجم عن الاصطدام (CID).على وجه التحديد ، لاحظنا خسارة محايدة بارزة لـ 98 Da بواسطة CID ، بما يتوافق مع الملاحظات السابقة للآخرين ، 12 & # x0221215 مع خسائر إضافية قدرها 80 و 116 Da. في الواقع ، غالبًا ما سيطرت هذه الخسائر المحايدة على التيار الأيوني في أطياف MS / MS ، مما أدى إلى تقليل كفاءة تجزئة العمود الفقري الببتيد وتحديد المصب بواسطة محركات بحث قاعدة البيانات.

لطالما تم التعرف على الخسارة المحايدة لحمض الفوسفوريك (& # x0039498 Da) بواسطة CID كعلامة مميزة للببتيدات التي تحمل pSer و pThr. 16 يحدث فقدان حامض الفوسفوريك في موقع بقايا pSer أو pThr عن طريق & # x003b2- إزالة ، أو آلية توجيه الشحنة ، والتي تم استغلالها لتحديد موقع الفسفرة على الفوسفوببتيد. 17،18 بالنسبة لببتيدات الأس الهيدروجيني ، فإن الخسارة المحايدة التي يسببها CID لـ 80 Da ليست مفاجئة ، لأن هذا يشكل خسارة لـ HPO3 عند تجزئة السندات P & # x02013N الملصقة في بقايا الرقم الهيدروجيني. ومع ذلك ، فإن ملاحظة & # x0039498 Da كأبرز خسارة محايدة يسببها CID لببتيدات الأس الهيدروجيني أمر محير. يقترح أنه بالإضافة إلى فقدان HPO3 (& # x0039480 Da) عن طريق التجزئة عند السندات P & # x02013N ، يتم فقد جزء مائي إضافي (& # x0039418 Da) بشكل متزامن من الببتيد في مكان آخر غير بقايا الهيستدين.

لحل هذا اللغز ، اكتشفنا هنا آلية تفاعل الطور الغازي لببتيد pHis & # x0039498 Da خسارة محايدة ، باستخدام وضع العلامات النظيرية وتجزئة الببتيد في ظل ظروف CID. علاوة على ذلك ، لقد استغلنا نمط الخسائر المحايدة في الببتيد pHis الذي لاحظناه بواسطة CID (الخسارة السائدة لـ 98 Da والخسائر المصاحبة لـ 80 و 116 Da) لتعزيز قدرتنا على اكتشاف وتمييز ببتيدات الأس الهيدروجيني من العينات البروتينية. لهذا الغرض ، قمنا بتطوير أداة برمجية ، نسميها TRIPLET ، لتحديد أطياف MS / MS التي تعرض النمط الثلاثي الخسارة المحايدة CID (& # x0039498 ، & # x0039480 و & # x00394116 Da) من الببتيدات pHis. قمنا أيضًا بتصميم سير عمل قائم على MS يشتمل على أداة البرنامج هذه بطريقتين: (1) للمساعدة في تعيين البحث في قاعدة البيانات لأطياف CID MS / MS إلى الببتيدات الأس الهيدروجيني ، و (2) للإشارة إلى ببتيدات الأس الهيدروجيني المحتملة لتحليلها لاحقًا عن طريق LC & # x02013MS باستخدام تقنيات التجزئة البديلة. أخيرًا ، استخدمنا سير العمل هذا جنبًا إلى جنب مع أول إثراء على مستوى الببتيد تم الإبلاغ عنه من الأس الهيدروجيني عن طريق الترسيب المناعي باستخدام جسم مضاد لعموم الأس الهيدروجيني لتحقيق تحليل بروتيني عالمي قائم على MS. بكتريا قولونية الخلايا.


نتائج

نموذج البناء.

هنا نصف إعادة بناء الوصف الحسابي متعدد النطاقات لتلف ROS للبروتينات المعدنية. هنا ، يعني متعدد النطاقات أننا نمثل التفاعلات المشاركة في عمليات التعبير عن البروتين (البطيء) والتمثيل الغذائي (السريع) ، كما هو موضح سابقًا (9). يمكن أن تمتد هذه المعدلات إلى 15 مرتبة من حيث الحجم ، لذلك نستخدم مذيبات متخصصة (رباعية الدقة) لحساب حلول الحالة المستقرة (10). نبدأ بإعادة البناء المنشورة لـ بكتريا قولونيةالشبكات المتكاملة للتعبير الأيضي والجزيئي (ME) (11). يمثل نموذج ME هذا 1678 جينًا و 7031 مستقلبًا و 12655 تفاعلًا. يشتمل النموذج على إعادة بناء مفصلة للمسار للنسخ والترجمة والتشكيل المعقد وتطعيم المجموعة الاصطناعية (12 × 14). يرسم النموذج أيضًا خرائط لمركب البروتين - مقاييس العناصر الكيميائية المعدنية ، بما في ذلك 43 معقدًا تشتمل على مجموعات من الحديد أحادي النواة أو عناقيد الحديد والكبريت. نقوم بإعادة بناء عمليات الإصلاح الخلوي والتلف المستندة إلى ROS لهذه البروتينات المعدنية ، مما ينتج عنه نموذج OxidizeME (الشكل 1) كما هو موضح أدناه.

OxidizeME: وصف متعدد النطاقات لعملية التمثيل الغذائي والتعبير الجزيئي الذي يفسر الضرر الذي تسببه ROS للجزيئات الكبيرة. (أ) يتم إزالة المعادن من بروتينات الحديد أحادي النواة (II) بواسطة ROS ويتم فصلها عن طريق أيونات معدنية ثنائية التكافؤ بديلة. (ب) مجموعات الحديد والكبريت تتأكسد وترمم. (ج) يتفاعل Fe (II) غير المدمج تلقائيًا مع H.2O2 عبر كيمياء فينتون ، يولد جذور الهيدروكسيل التي تدمر الحمض النووي ، بينما يخزن بروتين Dps الحديد غير المدمج ويحمي الحمض النووي من التلف. (د) يتم حساب الخصائص الهيكلية للبروتين لتقدير احتمال تلف العامل المساعد المعدني بواسطة ROS (RSA: إمكانية الوصول إلى المذيبات النسبية). (ه) العمليات في ميلادي مدمجة في نموذج مؤكسد متعدد النطاقات يسمى OxidizeME. يستخدم OxidizeME لحساب نطاق الضرر الجزيئي والاستجابة الخلوية لتركيزات مختلفة داخل الخلايا لأكسيد الفائق ، وبيروكسيد الهيدروجين ، وأيونات المعادن ثنائية التكافؤ (Fe (II) ، Mn (II) ، Co (II) ، Zn (II)) انظر الملحق SI للتفاصيل.

أولاً ، نحدد التعبيرات الرياضية لوصف ضرر مجموعات الحديد والكبريت (Fe-S) بواسطة الأكسيد الفائق و H 2 O 2 كميًا. صافي ردود الفعل لضرر كتلة Fe – S هي (4) [4Fe - 4S] 2 + + O 2 ⋅ - + 2 H + → [3Fe - 4S] 1 + + Fe 2 + + H 2 O 2، [4Fe - 4S] 2 + + H 2 O 2 + 2 H + → [3Fe - 4S] 1 + + Fe 3 + + 2 H 2 O. بافتراض أن تركيز ROS [ROS] KM ، فإن معدل تلف مجموعة Fe – S v dmg يعتمد على [ROS] ، ومعدل ثابت k cat / KM dmg ، وتركيز بروتين Fe – S E ، v dmg = k cat KM dmg [ROS] ⋅ E = k cat KM dmg [ROS] ⋅ v dil / μ ، [1] حيث μ هو معدل النمو المحدد للخلية في h −1 و v dil هو معدل التخفيف للبروتين.

ثانيًا ، نصف إصلاح مجموعة Fe-S. نحن نفترض أن yggX (15) أو ytfE (16) إصلاح مجموعات Fe – S باستخدام NADH كمانح للإلكترون وتحديد تفاعل الإصلاح الصافي: [3Fe - 4S] 1 + + Fe 2 + + NADH → [4Fe - 4S] 2 + + NAD +. معدل الإصلاح v الإصلاح مقيد بتركيزات مجموعة بروتينات الإصلاح R = وثوابت معدل إصلاح مجموعة Fe S k: إصلاح v ≤ ∑ j ∈ R k إصلاح ، j ⋅ E j = ∑ j ∈ R k إصلاح ، j ⋅ vj dil / μ. [2] ثالثًا ، وصفنا إزالة المعادن وحيدة النواة من البروتينات المعدنية الحديدية. بافتراض [ROS] ≪ KM ، يتم تعريف معدل إزالة معدن البروتين j بواسطة ROS k ∈ O = على أنه vjk demet = kjk demet [ROS] vj dil / μ ، [3] حيث kjk demet هو ثابت معدل إزالة المعادن. بعد ذلك ، لوصف سوء الفلزات بواسطة المعادن المتنافسة ، نفترض أن عملية التعدين تحدث بسرعة وقريبة من التوازن (17). نستخدم ثابت ثبات المعدن والبروتين للمعدن i (β j i) بالنسبة إلى β j Fe ، جنبًا إلى جنب مع تركيزات المعادن النسبية ([Metal i] / [Fe (II)]). نحدد بعد ذلك المعدل الذي يمعدن فيه البروتين j بالمعدن i على شكل v j metal ، i = β j i [معدن i] β j Fe [Fe (II)] ∑ k ∈ O v j k demet + v j dil. [4] نعتبر مجموعة المعادن البديلة M = . قمنا بعد ذلك بتوسيع نطاق الكفاءة التحفيزية k eff للأنزيمات المعدنة بدلاً من ذلك بناءً على تقديرات من البيانات المنشورة (18 ، 19).

أخيرًا ، نقوم بصياغة مشكلة تحسين لحساب الحالة الأيضية والبروتينية لـ بكتريا قولونية تحت ضغط ROS. في نموذج ME الأصلي ، يتم حساب حالة التدفق (v) - لتفاعلات التعبير الأيضي والجزيئي - التي تزيد من معدل النمو عن طريق حل المشكلة (10 ، 11) max μ، v μ تخضع لـ S (μ) ⋅ v = 0 ، l ≤ v ≤ u ، [5] حيث S (μ) عبارة عن مصفوفة متكافئة تتضمن معاملات تعتمد على μ ، و l ، u هي حدود التدفق الأدنى والعليا. في OxidizeME ، المشكلة المقابلة هي التالية: max μ، v μ تخضع لـ S (μ) ⋅ v = 0، l ≤ v ≤ u، vj dmg - vj repair - vj dil = 0، ∀ j ∈ D، vj dmg = k cat KM j dmg [ROS] vj dil / μ ، ∀ j ∈ D ، vj dil ≥ ∑ i ∈ R μ k إصلاح ivij ، ∀ j ∈ D ، ∑ j ∈ D vij repair ≤ ∑ i ∈ R k إصلاح ، i ⋅ vi dil / μ، vjk demet = kjk demet [ROS] vj dil / μ، vj metal، i = β ji [Metal i] β j Fe [Fe (II)] ∑ k ∈ O vjk demet + vj dil ، ∀ ط ∈ م، ∀ ي ∈ د. [6] بمقارنة عمليات المحاكاة مع البروتينات المقاسة (20) ، وجدنا أن OxidizeME يحسب ما يصل إلى 85٪ من بكتريا قولونية البروتين بالكتلة (Dataset S1). يتوفر كود ووثائق OxidizeME على https://github.com/SBRG/oxidizeme.

مساعدة الأحماض الأمينية تحت الإجهاد التأكسدي.

استجابة مميزة لضرر ROS لـ بكتريا قولونية هو تعطيل مسارات التخليق الحيوي للأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة والعطرية ، والتي يتم تخفيفها عن طريق إضافة هذه الأحماض الأمينية (4). مقارنةً بتكميل جميع الأحماض الأمينية العشرين ، توقع OxidizeME بشكل صحيح أن استبعاد Ile و Val كان له تأثير أكبر على معدل النمو مقارنةً باستبعاد Phe و Trp و Tyr (الشكل 2).أ). السبب في أن بكتريا قولونية لا يمكن أن تنمو تحت إجهاد ROS بدون مكملات الأحماض الأمينية متفرعة السلسلة هو أن مجموعات الحديد والكبريت من ثنائي هيدروكسي حامض ديهيدراتاز وإيزوميراز الأيزوبروبيلمالت معطلة بواسطة ROS ، مما يضعف مسار الأحماض الأمينية المتفرعة السلسلة (21). يُعزى مساعد التغذية للأحماض الأمينية العطرية في الأصل إلى تعطيل تفاعل ترانسكيتولاز (22) ، ولكن تم تتبعه مؤخرًا إلى اختلال عامل الحديد أحادي النواة في سينسيز 3-deoxy-D-arabinheptulosonate 7-phosphate (DAHP) (19). تنبأ OxidizeME بشكل صحيح بهذه الآليات الجزيئية وعواقبها المظهرية (الشكل 2).

العواقب الجهازية لإجهاد ROS. (أ) توقع معدل النمو الأمثل في ظل تركيزات منخفضة وعالية من الأكسيد الفائق مع مكملات مختلفة من الأحماض الأمينية (AAs). تشير "جميع AAs" إلى جميع الأحماض الأمينية الشائعة العشرين ، وتعني "–Ile & amp Val" جميع الأحماض الأمينية باستثناء Ile و Val التي تمت إضافتها. (ب) توقع معدل النمو الأمثل مقابل تركيز الأكسيد الفائق في مختلف وسائط مكملات الأحماض الأمينية الكبريتية. (ج) مثل ب ولكن تمت محاكاته دون الإضرار بـ CysI بواسطة ROS. (د) تدفقات الضرر المحاكاة للنمو على جلايكولات مقابل د-جالاكتوز. AROL: شيكيمات كيناز الثاني. (ه) معدل نمو MG1655 على متوسط ​​الحد الأدنى من الجليكولات مع 0 إلى 0.6 ميكرومتر PQ ، مع وبدون مكملات شيكيمات 50 ميكرومتر. (F) مثل ه ولكن للنمو على D- الجالاكتوز المتوسط ​​الحد الأدنى. * تشير إلى أن معدل النمو يتغير بشكل كبير بين تركيزات PQ (2-tailed Welch’s ر اختبار ، P & lt 0.01).

وفي الوقت نفسه ، أساس ضمور الأحماض الأمينية الكبريتية في بكتريا قولونية لا تزال غير حاسمة على الرغم من التحقيقات المتعددة (23 ، 24). تنبأ OxidizeME بشكل صحيح بتضخم الأحماض الأمينية الكبريتية (السيستين والميثيونين) تحت إجهاد ROS (الشكل 2)أ). لقد تتبعنا آلية معقولة لتلف كتلة الحديد والكبريت في CysI ، والتي تحفز خطوة اختزال الكبريتيت في التخليق الحيوي Cys. يربط اختزال الكبريتيت بأربعة عوامل مساعدة: الحديد والكبريت و FAD و FMN و siroheme. تمشيا مع الدراسات السابقة (25) ، قدر نموذجنا الهيكلي أن مجموعة siroheme من اختزال الكبريتيت يصعب الوصول إليها بواسطة ROS ، ويرجع ذلك أساسًا إلى عمق بقايا ربط العامل المساعد (Dataset S2). أظهرت الدراسات السابقة أن كتلة الحديد والكبريت من المحتمل ألا تتأكسد تلقائيًا بالأكسجين الجزيئي لأنها لا تتعرض للمذيب (25). ومع ذلك ، توقع نموذجنا الهيكلي أن يتم الوصول إلى مجموعة الحديد والكبريت بواسطة ROS عند النظر في كل من التعرض للمذيبات وعمق بقايا ربط الكتلة من السطح الذي يمكن الوصول إليه بواسطة المذيب (Dataset S2). أكدت عمليات المحاكاة أن التخفيف من الأضرار التي لحقت باختزال الكبريتيت كان كافياً لعكس عيب معدل النمو الملحوظ وتمكين النمو بتركيزات ROS أعلى في غياب Cys و Met (الشكل 2). ب و ج). تتفق فرضيتنا القائلة بأن اختزال الكبريتيت الذي تم تعطيله بواسطة ROS مع الدراسات في السالمونيلا المعوية تبين أن نشاط هذا الإنزيم ينخفض ​​بالفعل بسبب ارتفاع الأكسيد الفائق (26). علاوة على ذلك ، فإن إلغاء تنشيط اختزال الكبريتيت يتوافق مع تراكم ركائزه ، الكبريتيت ، ويشرح تراكم الكبريتيت الذي لوحظ سابقًا (24). نلاحظ أن تعطيل CysI لا يستبعد احتمال أن يؤدي الأكسيد الفائق بالإضافة إلى ذلك إلى تلف غلاف الخلية ، مما يسهل تسرب الجزيئات الصغيرة (27). وبالتالي ، يمكن استخدام OxidizeME لفهم الأساس لتكوين الأحماض الأمينية والتنبؤ به كاستجابة منهجية لنقاط الضعف الجزيئية المحددة لـ ROS.

حساب وشرح التبعية البيئية لتسامح ROS.

لاستكشاف كيفية تأثير السياق البيئي على تحمل ROS ، قمنا بمحاكاة النمو تحت ضغط الأكسيد الفائق في 180 مصدرًا للكربون (الملحق SI، الشكل S2). ثم قمنا بمقارنة أزواج من مصادر الكربون من حيث المجمعات الأكثر تضررًا من ROS. على وجه الخصوص ، من عمليات المحاكاة ، توقعنا أن عنق الزجاجة الرئيسي للنمو على D-galactose تحت ضغط ROS هو تعطيل shikimate kinase II ، AroL (الشكل 2).د). في المقابل ، تم التنبؤ بأن AroL ليس عنق الزجاجة المباشر للنمو على الجليكولات (الشكل 2).د). للتحقق من صحة هذا التوقع ، قمنا بقياس نمو بكتريا قولونية MG1655 على هذين المصدرين من الكربون في 0 إلى 0.6 ميكرومتر من الباراكوات (PQ). PQ هو كاتيون ثنائي التكافؤ يتم تناوله بشكل انتهازي ، عادةً عن طريق ناقلات الغشاء متعدد الأمين ، ثم يخضع لدورات الاختزال والأكسدة التلقائية التي يتم تحفيزها بواسطة أي من ثلاث دورات بكتريا قولونية غشاء PQ لتوليد الأكسيد الفائق (28). لاختبار ما إذا كان AroL يمثل عنق الزجاجة بشكل مباشر ، قمنا أيضًا بتكميل الثقافات بـ 50 ميكرومتر شيكيمات. كما هو متوقع ، لم يخفف شيكيمات من عيوب النمو التي يسببها PQ أثناء النمو على الجليكولات (الشكل 2).ه). في هذه الأثناء ، يخفف shikimate عيوب النمو المخففة بواسطة PQ أثناء النمو على D-galactose (الشكل 2F). تؤكد هذه النتائج أن OxidizeME قادر على التنبؤ بدقة بتأثيرات الأحماض الأمينية التي يسببها ROS في سياقات بيئية مختلفة. هذه القدرة التنبؤية متجذرة في قدرتها على حساب الآليات الجزيئية والجزيئية.

استخدمنا بعد ذلك OxidizeME لشرح سبب إظهار النمو على الجلايكولات والجالاكتوز تفاوتات مختلفة من أنواع ROS. أولاً ، يزيد إجهاد ROS عالميًا من موازنة الأكسدة والاختزال ومتطلبات إنتاج الطاقة لمواجهة انخفاض كفاءة التمثيل الغذائي والبروتين الناتج عن تلف البروتين المعدني. وهكذا ، فإن الاختلاف في بكتريا قولونيةيمكن أن تفسر قدرة "الطاقة المتجددة" على تجديد هذه القدرات الأيضية في ظل مصادر الكربون المختلفة الاختلافات في حساسية أنواع الأكسجين التفاعلية.

أثناء النمو على D-galactose ، كان المصدر الأساسي لـ NADPH هو مسار فوسفات البنتوز المؤكسد (Gnd و Zwf) ، مع وبدون إجهاد ROS. تحت إجهاد ROS مع D-galactose كمصدر للكربون ، أشارت عمليات المحاكاة إلى زيادة نشاط نازعة هيدروجين الميثيلين تتراهيدروفولات (FolD) لتكملة إنتاج NADPH بواسطة PPP (مسار فوسفات البنتوز) ، على الرغم من أن PPP لا يزال المصدر الرئيسي لـ NADPH. وفي الوقت نفسه ، اعتمد إنتاج NADH بشكل كبير على نظام انقسام الجلايسين مع ROS ، في حين كان نازع هيدروجين الغليسيرالديهيد -3 فوسفات هو المصدر الأساسي لـ NADH بدون ROS. أدت الزيادة في FolD ونظام انقسام الجلايسين إلى تجديد NADPH و NADH إلى زيادة الحاجة إلى رباعي هيدروفولات ومشتقاته ، مما أدى إلى اختناق استقلابي جديد تحت إجهاد ROS. في المقابل ، مع الجليكولات كمصدر للكربون ، كان من المتوقع أن يتحول إنتاج NADPH الأمثل من دورة TCA (بدون ROS) إلى إنزيم ماليك (مع ROS). وبالتالي ، يمكن تفسير الفرق بين قدرات تحمل ROS للجالاكتوز والجليكولات كمصادر للكربون من خلال إنتاج NADPH المرن أثناء النمو على إنتاج الجليكولات مقابل إنتاج NADPH الصلب أثناء النمو على الجالاكتوز.

يحدد OxidizeME التعبير الجيني التفاضلي الخاص بالإجهاد من تغييرات التعبير العالمية.

بعد ذلك ، قمنا بتقييم الاستجابة النظامية لـ بكتريا قولونية للتأكيد على ROS. قمنا بقياس نسخة بكتريا قولونية تحت ضغط الأكسيد الفائق باستخدام علاج PQ وتحديد 914 جينًا معبرًا تفاضليًا (DEGs) ، تم حساب 501 منها في OxidizeME (الشكل 3 و الملحق SI، الشكل S3). على وجه الخصوص ، تم تنظيم 87 جينًا. باستخدام OxidizeME ، قررنا أن هذه الجينات الـ 87 تم تنشيطها على الأرجح بسبب التلف الخاص ببروتينات الحديد المعدنية أكثر من أي بروتين آخر (P & lt 0.001). علاوة على ذلك ، من DEGs التي تم التنبؤ بها بشكل صحيح ، تغير جزء كبير (84 ٪) من الجينات المكبوتة بسبب انخفاض معدل النمو من علاج PQ ، بينما كانت 95 ٪ من الجينات المنشطة استجابات محددة للإجهاد (الشكل 3). من المتوقع أن يستجيب التعبير الجيني لإجهاد أنواع الأكسجين التفاعلية بشكل مباشر - على سبيل المثال ، عن طريق زيادة تنظيم جينات إزالة السموم من أنواع الأكسجين التفاعلية - وبشكل غير مباشر - استجابةً لمعدلات التمثيل الغذائي المنخفضة الناتجة عن تلف أنواع الأكسجين التفاعلية. امتدت الاستجابات التي حددناها على أنها خاصة بـ ROS ، وليس معدل النمو ، إلى ثماني عمليات خلوية (الشكل 3): إزالة السموم من ROS ، والتمثيل الغذائي المركزي ، والتنفس اللاهوائي ، والتخليق الحيوي للأحماض الأمينية ، والتخليق والإصلاح ، والترجمة ، واستتباب الحديد ، والنسخ. التنظيم من قبل rpoS عامل سيجما.

التحقق من صحة العواقب والردود على إجهاد ROS. (أ و ب) DEGs (| سجل2(طي التغيير) | & gt 0.9 ، FDR [معدل الاكتشاف الخاطئ] & lt 0.01) التي تم تنشيطها (أ) ومقموع (ب). تتميز DEGs المتوقعة بشكل صحيح عن التنظيم العالمي المرتبط بالنمو باستخدام OxidizeME. (ج) العمليات الخلوية المتضمنة في استجابة جهازية لتلف الحديد المعدني بواسطة ROS.

تعمل الخلايا المطورة من نوع ROS على تحرير التخليق الحيوي لعنقود Fe-S.

بكتريا قولونية تمتلك نظامين بديلين لتجميع مجموعات Fe-S: ISC (مجموعة الحديد والكبريت) و SUF (استيعاب الكبريت). يمكن لكل نظام توليف عناقيد Fe-S في غياب الآخر (29). في حين أن ISC هي السائدة في ظل ظروف النمو العادية ، يتم تنشيط SUF ويمكن أن يصبح النظام الأساسي تحت ضغط الأكسدة أو الحد من الحديد (4 ، 30). أحد أسباب هذا التحول إلى SUF هو أن ROS يقلل من كفاءة تجميع Fe-S المعتمد على ISC عن طريق زيادة عدم توازن مجموعات الحديد والكبريت القابلة للتغير على بروتينات السقالة IscU و SufA (31). من حيث المبدأ ، فإن التحول من ISC إلى SUF ليس الآلية الوحيدة للحفاظ على تجميع Fe-S تحت ضغط ROS. على سبيل المثال، السل الفطري تمتلك فقط مشغل ISC ، ومع ذلك فإن هذا العامل الممرض قادر على النمو تحت الضغط التأكسدي بما في ذلك داخل الضامة ، على الأرجح عن طريق زيادة تنظيم مشغل ISC الخاص به (32). التفسير المحتمل هو ذلك مرض السلتعتبر بروتينات سقالة ISC الخاصة بـ ISC أقل حساسية لـ ROS من تلك الموجودة في بكتريا قولونية أو يتم إصلاحها. لكن، بكتريا قولونية يمتلك أيضًا العديد من جينات إصلاح مجموعة Fe-S المفترضة ، بما في ذلك ygfz (33), yggX (15) و ytfE (16). بشكل عام ، توجد فجوات في فهمنا لمقايضات التكلفة والعائد بين تكاليف الدعم غير المباشر و SUF تحت ضغط ROS. هنا ، نحقق في هذه المشكلة باستخدام OxidizeME والتحقق التجريبي.

أولاً ، اكتشفنا DEGs في النوع البري بكتريا قولونية MG1655 استجابة لـ 0.25 ملي PQ ، باستخدام RNA-Seq في متوسط ​​الجلوكوز الأدنى. اكتشفنا قمع iscRSUA (متوسط ​​l o g 2 (تغيير الطية) = - 1.53 ، معدل FDR المعدل P & lt 0.001). ثم كررنا هذه التجربة مع بكتريا قولونية سلالة (تسمى BOP1000) تطورت لتنمو بسرعة على الجلوكوز (34). كما هو الحال مع MG1655 ، تم كبت سلالة BOP1000 iscRSUA (متوسط ​​l o g 2 (تغيير الطي) = - 1.32 ، معدل P & lt 0.053 معدّل بواسطة FDR) (Dataset S3).

أخيرًا ، حصلنا على سلالة مطورة معمليًا من بكتريا قولونية (يسمى PQ3) ، والذي تم تطويره لينمو على 0.8 ملي مولار PQ (الملحق SI, مواد وطرق SI). سلالة البداية لـ PQ3 هي BOP1000 المتطور للجلوكوز. قمنا بتربية PQ3 في 0.2 و 0.6 ملي PQ وحددنا DEGs باستخدام RNA-Seq. تحت 0.6 ملي PQ ، إجهاد PQ3 ينظم أسفل sufABCDSE وحدة النسخ (متوسط ​​l o g 2 (تغيير الطي) = - 2.01 ، معدل FDR المعدل P & lt 0.034) (Dataset S3). علاوة على ذلك ، تحت 0.2 ملي مولار PQ ، حافظت السلالة PQ3 على تعبير أعلى عن ISC مقارنة بسلالة BOP1000 سابقة التطور. على وجه التحديد ، لاحظنا تعبيرًا أعلى لوحدات النسخ iscRSUA (متوسط ​​l o g 2 (تغيير الطي) = 3.47 ، معدل FDR المعدل P & lt 0.001) و hscBA-fdx-iscX (متوسط ​​l o g 2 (تغيير الطية) = 1.99 ، P & lt 0.001 المعدل بواسطة FDR) (Dataset S3).

دفعتنا الاستجابة النسخية المتناقضة لسلالة PQ المتطورة من تلك السلالات من النوع البري والمتطور للجلوكوز إلى التحقيق في الآليات الجينية وعلى مستوى الأنظمة لتكيف ROS.

آليات المستوى الجيني والأنظمة للتخليق الحيوي الأمثل للعنقود Fe-S.

كان الأساس الجيني لاستجابة تطور PQ لـ ISC و SUF طفرة في iscR. ينظم IscR نسخ كل من ISC و SUF بناءً على تنسيق 2Fe – 2S في مخلفات Cys92 و Cys98 و Cys104 (29 ، 35). السلالة المتطورة لديها طفرة C104S في iscR. قد تعيق هذه الطفرة قدرة IscR على دمج 2Fe – 2S وتنظيم التعبير عن أنظمة ISC و SUF تحت ضغط ROS (35).

قمنا بعد ذلك بالتحقيق في سبب تحسين ISC وقمع SUF للياقة تحت ضغط ROS المستمر. من الواضح أننا نتوقع مفاضلة بين معدل تعطيل Fe-S في IscU وميزة اللياقة لاستخدام SUF. في الواقع ، تُظهر عمليات المحاكاة أنه أقل من معدل عتبة تعطيل Fe-S في IscU (∼ 0.78 ثانية -1) ، يحدث نقل الكبريت أثناء تجميع Fe-S بشكل حصري تقريبًا بواسطة IscS بدلاً من SufSE (الملحق SI، الشكل S4). ومن المثير للاهتمام ، أنه من المتوقع أن يزيد تعبير IscU بشكل متناسب مع معدل تعطيل Fe-S حتى الحد الأدنى ، مما يشير إلى استجابة تعويضية أولية لكفاءة تجميع Fe-S المنخفضة في IscU. ومع ذلك ، فوق العتبة ، ينخفض ​​تعبير IscU و IscS بشكل حاد ، بينما يزداد تعبير SufSE و SufBCD. أحد أسباب ميزة اللياقة البدنية لـ ISC على SUF هو تكلفة تعبير البروتين لكل نظام. بالنظر فقط إلى مركبات نقل الكبريت والسقالات ، تتطلب IscS و IscU ترجمة 118 كيلو دالتون من البروتين ، بينما تتطلب SufSE و S u f B C 2 D 227 كيلو دالتون - 93٪ أكثر من ISC.

وبالتالي ، يشير تعبير ISC المتزايد إلى أن سلالة PQ3 قد تعاني من انخفاض تثبيط Fe-S في IscU. للتحقيق في هذا الاحتمال ، تذكر ذلك بكتريا قولونية تمتلك العديد من الجينات المرتبطة بإصلاح أو مقاومة الأكسدة لمجموعات Fe-S ، بما في ذلك ygfz (33), yggX (15) و ytfE (16). أظهر RNA-Seq (Dataset S3) أنه لم يتم التعبير عن أي من هذه الجينات بشكل تفاضلي بواسطة سلالة PQ3 استجابةً لـ PQ. لم يكن هناك فرق في مستوى التعبير مقارنة بالسلالة BOP1000 تحت علاج PQ. ومع ذلك ، كشف DNA-Seq عن طفرة (T108P) في ygfz، وهو جين يعتقد أنه يساهم في تخليق أو إصلاح مجموعة Fe-S (33). بدلا من ذلك، ygfz قد تتحلل بشكل مباشر من PQ ، حيث تبين أنها تتحلل من plumbagin ، وهو مركب آخر لدورة الأكسدة والاختزال (36). ستكون أي من الوظيفة التكيفية متسقة مع تقليل الضرر الذي لحق بمجموعات Fe-S بشكل عام ، ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما إذا كانت حماية مجموعات Fe-S في IscU كافية لإعادة إنتاج الزيادة الملحوظة في تعبير ISC (وقمع SUF).

لذلك أجرينا عمليات محاكاة حيث قمنا بتعيين معدل الضرر على مجموعات Fe-S في IscU إلى الصفر واحتفظنا بعمليات التلف لجميع المركبات الأخرى المحتوية على مجموعة الحديد و Fe-S. ثم قمنا بمحاكاة نمو بكتريا قولونية تحت القاعدية (0.2 نانومتر) وتركيزات عالية (2 نانومتر) داخل الخلايا من فوق أكسيد الفائق والمحددة في DEGs السيليكو. كانت DEGs المحاكاة متوافقة مع RNA-Seq لـ PQ3: hscBA-fdx-iscX و iscRSUA تم تنظيم الأوبرا ، و sufABCDSE تم قمعه (Dataset S4). تشير هذه النتيجة إلى أن حماية مجموعات Fe-S في IscU كافية لجعل ISC أكثر ملاءمة من SUF تحت ضغط ROS. من المحتمل أن تحقق سلالة PQ المتطورة هذه الحماية من خلال ygfz ويتحول بدوره إلى ISC الأكثر فائدة عن طريق طفرة iscR.


مطيافية رامان المجهري ، الفحص المجهري لتشتت رامان المعزز بالسطح ، وتنظير رامان المجهري للنظائر المستقرة لتوصيف الأغشية الحيوية

تمثل الأغشية الحيوية الشكل السائد للحياة الميكروبية على كوكبنا. قد تستعمر هذه التجمعات من الكائنات الحية الدقيقة ، المضمنة في مصفوفة مكونة من مواد بوليمرية خارج الخلية ، جميع الواجهات تقريبًا. تعتبر المعرفة التفصيلية للكائنات الدقيقة الموجودة في الأغشية الحيوية وكذلك التركيب الكيميائي والبنية ووظائف مصفوفة الأغشية الحيوية المعقدة وتغيراتها في مراحل مختلفة من تكوين الأغشية الحيوية وتحت ظروف فيزيائية وكيميائية مختلفة ذات صلة في مجالات مختلفة. تشمل موضوعات البحث المهمة تطوير وتحسين المضادات الحيوية والأجهزة الطبية وتحسين المبيدات الحيوية والاستراتيجيات المضادة للحشف ومعالجة مياه الصرف الصحي البيولوجية. يعتبر التحليل الطيفي الدقيق لرامان أداة قادرة وغير مدمرة يمكنها توفير معلومات كيميائية مفصلة ثنائية وثلاثية الأبعاد حول مكونات الأغشية الحيوية مع الدقة المكانية لمجهر ضوئي وبدون تدخل من الماء. ومع ذلك ، فإن حساسية مطيافية رامان المجهري محدودة نوعًا ما ، مما يعيق تطبيق مطيافية رامان المجهري خاصة عند تركيزات الكتلة الحيوية المنخفضة. لحسن الحظ ، يمكن أن يساعد تأثير الرنين رامان وكذلك تشتت رامان المعزز على السطح في التغلب على هذا العيب. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين مطياف رامان المجهري مع التقنيات المجهرية الأخرى ، وتقنيات قياس الطيف الكتلي ، أو بشكل خاص مع تقنيات النظائر المستقرة ، يمكن أن يوفر معلومات شاملة عن الأنواع الأحادية والأغشية الحيوية المتعددة الأنواع. هنا ، يتم تقديم نظرة عامة على تقنيات Raman المجهرية المختلفة ، بما في ذلك الرنين Raman المجهري والتحليل المجهري لتشتت Raman المعزز بالسطح ، للكشف في الموقع ، والتصور ، والتعرف ، والتوصيف الكيميائي للأغشية الحيوية ، والجدوى والقيود الرئيسية لهذه التقنيات في biofilm يتم تقديم البحث. تمت مناقشة الاحتمالات والتحديات المستقبلية لمطياف رامان المجهري وحده وبالاقتران مع التقنيات التحليلية الأخرى لتوصيف مصفوفات الأغشية الحيوية المعقدة في مراجعة نقدية.

قابلية تطبيق التحليل الطيفي لرامان لتحليل الأغشية الحيوية

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


تحسين نمو الإشريكية القولونية في D₂O (الماء الثقيل) - علم الأحياء

تصدير المقالات إلى Mendeley

احصل على توصيات المقالة من ACS بناءً على المراجع الموجودة في مكتبة Mendeley الخاصة بك.

تصدير المقالات إلى Mendeley

احصل على توصيات المقالة من ACS بناءً على المراجع الموجودة في مكتبة Mendeley الخاصة بك.

لقد شحنت عملية البحث الخاصة بك مع ACS و Mendeley!

الخطوة 1:
الخطوة 2:

يرجى ملاحظة ما يلي: إذا قمت بالتبديل إلى جهاز مختلف ، فقد يُطلب منك تسجيل الدخول مرة أخرى باستخدام معرف ACS الخاص بك فقط.

يرجى ملاحظة ما يلي: إذا قمت بالتبديل إلى جهاز مختلف ، فقد يُطلب منك تسجيل الدخول مرة أخرى باستخدام معرف ACS الخاص بك فقط.

يرجى ملاحظة ما يلي: إذا قمت بالتبديل إلى جهاز مختلف ، فقد يُطلب منك تسجيل الدخول مرة أخرى باستخدام معرف ACS الخاص بك فقط.

يرجى تسجيل الدخول باستخدام معرف ACS الخاص بك قبل الاتصال بحساب Mendeley الخاص بك.

لم تقم بزيارة أي مقالات حتى الآن ، يرجى زيارة بعض المقالات للاطلاع على المحتويات هنا.
أنواع المحتوى
المواضيع

حول الغلاف:

يصور الغلاف نهجًا جديدًا للتجميع السريع للمستشعرات الحيوية الكيميائية في الخميرة باستخدام مستقبلات G- البروتين المقترنة (GPCRs). يسمح إقران المشغلات الجاهزة (عوامل النسخ) والوحدات الحسية (GPCRs) بتجميع أجهزة الاستشعار الحيوية لمجموعة متنوعة من المواد الكيميائية. يمثل مستشعر حمض الديكانويك ، وهو طليعة الوقود الحيوي. عمل فني لخورخي لويس بيرالتا يحيى بناءً على DOI: 10.1021 / sb500365m.

في هذه القضية:
في هذه القضية
في هذه القضية
تقديم كتابنا
تقديم المؤلفين لدينا
حروف
المستشعرات الحيوية الكيميائية القائمة على GPCR للأحماض الدهنية متوسطة السلسلة
  • كونتال موخيرجي ،
  • Souryadeep Bhattacharyya ، و
  • باميلا بيرالتا يحيى*

يتمثل أحد القيود الرئيسية للميكروبات الهندسية للإنتاج الكيميائي في الاعتماد على الشاشات المستندة إلى اللوني منخفض الإنتاجية للكشف عن المواد الكيميائية. في حين أن المواد الكيميائية اللونية قابلة للشاشات عالية الإنتاجية ، فإن العديد من المواد الكيميائية ذات القيمة المضافة ليست قياسًا لونيًا وتتطلب أجهزة استشعار للفحص عالي الإنتاجية. هنا ، نستخدم مستقبلات G-protein المقترنة (GPCRs) المعروفة بربط الأحماض الدهنية متوسطة السلسلة في خلايا الثدييات لبناء مستشعرات كيميائية بسرعة في الخميرة. الأحماض الدهنية متوسطة السلسلة هي السلائف المباشرة لإسترات ميثيل الأحماض الدهنية المتقدمة للوقود الحيوي ، والتي يمكن أن تكون بمثابة بديل "إسقاط" للديزل D2. يكتشف أحد المستشعرات الأحماض الدهنية C8 – C12 ذات السلسلة الزوجية بزيادة 13 إلى 17 ضعفًا في الإشارة بعد التنشيط ، مع نطاقات خطية تصل إلى 250 ميكرومتر. يؤدي إدخال وحدة استجابة تركيبية إلى تغيير النطاق الديناميكي والخطي ، مما يحسن استجابة المستشعر لحمض الديكانويك إلى زيادة 30 ضعفًا في الإشارة بعد التنشيط ، مع نطاق خطي يصل إلى 500 ميكرومتر. على حد علمنا ، هذا هو التقرير الأول لمستشعر حيوي للأحماض الدهنية كاملة الخلية متوسطة السلسلة ، والذي نتصور أنه يمكن تطبيقه على الهندسة التطورية للميكروبات المنتجة للأحماض الدهنية. بالنظر إلى تقارب GPCRs لمجموعة واسعة من المواد الكيميائية ، ينبغي أن يكون من الممكن تجميع أجهزة الاستشعار الحيوية الجديدة بسرعة ببساطة عن طريق تبديل وحدة الاستشعار GPCR. يجب أن تكون هذه المستشعرات قابلة لمجموعة متنوعة من التطبيقات التي تتطلب نطاقات ديناميكية وخطية مختلفة ، من خلال إدخال وحدات استجابة مختلفة.

هندسة التمثيل الغذائي متزامن ص. PCC 6803 لإنتاج نبات Diterpenoid Manoyl Oxide
  • إلياس إنجلوند ،
  • جوهان أندرسن رانبرج ،
  • روي مياو
  • بيورن هامبرغر ، و
  • بيا ليندبرج*

فورسكولين هو ديتيربينويد عالي القيمة مع مجموعة واسعة من التطبيقات الصيدلانية ، يوجد بشكل طبيعي في لحاء جذر نبات كوليوس فورسكولي. بسبب التركيب الجزيئي المعقد ، فإن التركيب الكيميائي للفورسكولين ليس جذابًا تجاريًا. ومن ثم ، فإن الاستخراج المكثف للعمالة والموارد وتنقية نباتات C. forskohlii يظل المصدر الحالي للمركب. لقد صممنا البكتيريا الزرقاء أحادية الخلية Synechocystis sp. PCC 6803 لإنتاج سلف فورسكولين 13R-manoyl oxide (13R-MO) ، مما يمهد الطريق لإنتاج التكنولوجيا الحيوية المدفوعة بالضوء لهذا المركب عالي القيمة. في سياق هذا العمل ، تم تطوير سلسلة جديدة من النواقل التكاملية للاستخدام في Synechocystis واستخدامها لإنشاء خطوط مستقرة تعبر عن CfTPS2 و CfTPS3 المدمجين الكروموسومات ، وهما الإنزيمات المسؤولة عن تكوين 13R-MO في C. forskohlii. أنتجت السلالات المهندسة عيار إنتاج يصل إلى 0.24 مجم جم -1 DCW 13R-MO. لزيادة المحصول ، تمت هندسة السلالات المنتجة لـ 13R-MO عن طريق إدخال إنزيمات مختارة من C. forskohlii ، وتحسين العيار إلى 0.45 مجم جم -1 DCW. يشكل هذا العمل أساسًا لمزيد من التطوير لإنتاج diterpenoids النباتية المعقدة في البكتيريا الزرقاء.

Auxotrophs الاصطناعية مع الجينات الأساسية المعتمدة على Ligand لسلالة السلامة الحيوية BL21 (DE3)

الكائنات المساعدة الاصطناعية هي كائنات حية مصممة لتتطلب وجود جزيء معين من أجل البقاء. لديهم تطبيقات محتملة في هندسة الاحتواء الحيوي والإنزيمات. نظهر أن هذه الكائنات يمكن أن تتولد عن طريق هندسة الاعتماد على الترابط في الجينات الأساسية. نوضح طريقة لتوليد auxotroph اصطناعي استنادًا إلى جين أساسي يعتمد على Ligand (SLiDE) باستخدام 5 جينات أساسية كحالات اختبار: pheS و dnaN و tyrS و metG و adk. نظهر أن سلالة SLiDE واحدة يمكن أن يكون لها زيادة في قابليتها للبقاء بمقدار 1 × 108 ضعفًا عند استكمالها كيميائيًا مع ligand benzothiazole. يتطلب بروتوكول هندسة الإجهاد SLiDE المحسن أقل من أسبوع واحد و 100 دولار أمريكي. لقد جمعنا العديد من أليلات سلالة SLiDE في سلالة Escherichia coli الصناعية BL21 (DE3) ، مما أسفر عن كائن يتجاوز معايير السلامة الحيوية مع تردد هروب أقل من حد الكشف 3 × 10-11.

مقالات
تخليقي هندسي رابطة الدول المستقلة- العناصر التنظيمية للتعرف المتزامن على ثلاثة عوامل نسخية في البكتيريا
  • خيراردو رويز أموريس ،
  • ماريا يوجينيا جوازاروني و
  • رافائيل سيلفا روشا*

يعد التعرف على العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة عن طريق عوامل النسخ (TF) عند المروجين المستهدفين أمرًا بالغ الأهمية لتنظيم الجينات في البكتيريا. في هذه العملية ، يعتمد ارتباط TFs بتسلسلها المماثل على مجموعة من التفاعلات الفيزيائية بين هذه البروتينات والنيوكليوتيدات المحددة في منطقة المشغل. في السابق ، أظهرنا أن خوارزميات التحسين في السيليكو قادرة على إنشاء تسلسلات قصيرة يتم التعرف عليها بواسطة اثنين من TFs مختلفة من Escherichia coli ، وهما CRP و IHF ، وبالتالي إنشاء بوابة منطقية AND. هنا ، قمنا بتوسيع هذا النهج من أجل هندسة تسلسلات الحمض النووي التي يمكن التعرف عليها في وقت واحد من خلال ثلاثة TFs غير مرتبطة (CRP و IHF و Fis). باستخدام تحسين silico واستراتيجيات التحقق التجريبية ، تمكنا من الحصول على مروج مرشح (Plac-CFI1) منظم بواسطة اثنين فقط من TFs مع منطق AND ، مما يدل على وجود قيود في التصميم. بعد ذلك ، قمنا بتعديل الخوارزمية للسماح بتحسين التسلسلات الممتدة ، وتمكنا من تصميم مروجين اصطناعيين (PCFI20-1 و PCFI22-5) يعملان في الجسم الحي. كشفت فحوصات التعبير في سلالات E. coli المتحولة لكل TF أنه بينما ينظم CRP بشكل إيجابي أنشطة المروج ، فإن IHF و Fis هما مثبطان قويان لكل من متغيرات المروج. مجتمعة ، تُظهر نتائجنا إمكانات استراتيجيات السيليكو في هندسة المروج التخليقي البكتيري. علاوة على ذلك ، تُظهر الدراسة أيضًا كيف يمكن أن تؤثر التعديلات الصغيرة في العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة بشكل كبير على المنطق النهائي للمروج الناتج.

أكسدة أحادية تعتمد على البتيرين للتخليق الميكروبي لمونوتربين إندول قلويد معدل

تحتوي قلويدات الإندول المونوتربين (MIAs) على قيمة علاجية مهمة ، بما في ذلك العوامل المضادة للسرطان والملاريا. نظرًا لتعقيدها الكيميائي ، غالبًا ما يتم عزل MIAs العلاجية ، أو الوسائط المتقدمة منها ، عن النباتات المحلية. سيسمح التوليف الميكروبي لـ MIAs بالإنتاج السريع والقابل للتطوير لـ MIAs المعقدة ونظائرها MIA للاستخدام العلاجي. هنا ، ننتج MIA hydroxystrictosidine المعدل من الجلوكوز و monoterpene secologanin عبر إستراتيجية الأكسدة الأحادية المعتمدة على البتيرين. على وجه التحديد ، قمنا بتصميم الخميرة Saccharomyces cerevisiae من أجل التوليف عالي المستوى من tetrahydrobiopterin لتأكسد أحادي التربتوفان إلى 5-hydroxytryptophan ، والذي ، بعد نزع الكربوكسيل إلى السيروتونين ، يقترن بتغذية سيكولوجانين خارجيًا لإنتاج 10-hydroxystrictosidine. . اخترنا hydroxystrictosidine كهدف اصطناعي لأن الهيدروكسيل في موضع 10 ′ من النواة القلوية Strictosidine يوفر مقبض كيميائي للتركيب الكيميائي المستقبلي للعلاجات. نعرض عمومية استراتيجية الأكسدة الأحادية المعتمدة على البتيرين للتخليق القلوي عن طريق هيدروكسيل التيروزين إلى L-DOPA - وسيط رئيسي في تخليق البنزيل إيزوكينولين قلويد (BIA) - وبعد ذلك ، تحويله إلى دوبامين. تقدم هذه النتائج معًا أول تخليق ميكروبي لقلويد معدل ، وأول إنتاج لرباعي هيدروبيوبترين في الخميرة ، والاستخدام الأول لاستراتيجية الأكسدة الأحادية المعتمدة على البتيرين لتخليق L-DOPA. يفتح هذا العمل الباب أمام الإنتاج القابل للتطوير من MIAs وكذلك إنتاج MIAs المعدلة لتكون بمثابة وسيط متأخر في التركيب شبه الكامل للعلاجات المعروفة والجديدة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام السلالات الميكروبية في هذا العمل كأدوات اكتشاف مسار النبات لتوضيح مسارات التخليق الحيوي المعروفة MIA أو لتحديد المسارات التي تؤدي إلى MIAs جديدة.

تطوير مستشعر Malonyl-CoA الاصطناعي في خميرة الخميرة لرصد الأيض داخل الخلايا والفحص الجيني

تتيح المستشعرات الجينية القادرة على تحويل مستويات المستقلب الرئيسية إلى إشارات مضان مراقبة تركيزات المركب داخل الخلايا في الخلايا الحية ، وتظهر كأداة فعالة في الفحص الجيني عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن تطور المستشعرات الجينية في الخمائر يتخلف كثيرًا عن تطورها في البكتيريا. نحن هنا نبلغ عن تصميم مستشعر malonyl-CoA في Saccharomyces cerevisiae باستخدام عامل النسخ البكتيري المعدل FapR والمشغل المقابل fapO لقياس مستويات malonyl-CoA داخل الخلايا. من خلال الجمع بين هذا المستشعر ومكتبة الإفراط في التعبير على مستوى الجينوم ، حددنا هدفين جديدين للجين يعملان على تحسين تركيز malonyl-CoA داخل الخلايا. استخدمنا أيضًا سلالة الخميرة المؤتلفة الناتجة لإنتاج مركب قيم ، حمض 3-هيدروكسي بروبيونيك ، من malonyl-CoA وعززنا عياره بنسبة 120٪. يوفر هذا المستشعر الجيني نهجًا قويًا للفحص على مستوى الجينوم ويمكنه زيادة تحسين تخليق مجموعة كبيرة من المواد الكيميائية المشتقة من malonyl-CoA في الخميرة.

تفاعل البلمرة المتسلسل على جسيم نانوي فيروسي
  • جيمس كار سميث ،
  • راؤول باتشيكو غوميز ،
  • هايدن أ.
  • ماثيو ر. هيكس ،
  • سانديب ساندو
  • ناديا ستينكي ،
  • ديفيد ج. سميث ،
  • أليسون رودجر
  • سارة أ. جودتشيلد ،
  • رومان أ. لوكاسزيوسكي ،
  • جوامع. إتش آر تاكر* ، و
  • تيموثي ر.دفورن*

يشمل مجال البيولوجيا التركيبية الدراسات التي تهدف إلى تطوير مواد وأجهزة جديدة من الجزيئات الحيوية. في السنوات الأخيرة ، تم تنفيذ الكثير من العمل باستخدام مجموعة من الهياكل الجزيئية الحيوية بما في ذلك الملفات الملفوفة α-helical ، الأميلويد الصفائح β وحتى الجزيئات الفيروسية. في هذا العمل ، نوضح كيف يمكن إنتاج الجسيمات الحيوية الهجينة من سقالة البكتيريا M13 الفيروسية من خلال الاقتران مع بادئات الحمض النووي التي يمكن أن تشكل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). تمت دراسة هذا المثال غير المسبوق من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على جسيم فيروسي عن طريق التحليل الطيفي ثنائي اللون الخطي المتوافق مع التدفق ، والذي يعطي معلومات عن بنية المنتج بالإضافة إلى منهجية نموذج أولي جديد لاكتشاف الحمض النووي.نقترح أن هذا العرض التوضيحي لـ PCR على سطح جسيم بيونانو هو إضافة مفيدة للطرق التي يمكن بها بناء التجمعات الهجينة باستخدام البيولوجيا التركيبية.

مفاتيح Riboregulator قابلة للضبط للتحكم بعد النسخ في التعبير الجيني
  • ملاثي كريشنامورثي ،
  • سكوت بي هينيلي ،
  • تاراكا ديل ،
  • شون ر. ستاركينبرج ،
  • ريكاردو مارتي - أربونا
  • ديفيد تي فوكس ،
  • سكوت ن.
  • كاريسا واي سانبونماتسو* ، و
  • كليفورد ج*

حتى وقت قريب ، كانت الاستراتيجيات الهندسية لتغيير التعبير الجيني تركز على التحكم في النسخ باستخدام محفزات قوية محفزة أو إحدى الطرق العديدة للقضاء على الجينات المهدرة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير منظمات الريبوريتور التركيبية للتنظيم الترجمي للتعبير الجيني. هنا ، قمنا بالإبلاغ عن فئة منظم ريبوريتور تركيبي معياري جديد لديه القدرة على ضبط تعبير البروتين بدقة والتحكم بشكل مستقل في تركيز كل إنزيم في مسار استقلابي هندسي. هذا التطور مهم لأن النهج الأكثر مباشرة لتغيير التدفق من خلال خطوة أيضية معينة هو زيادة أو تقليل تركيز الإنزيم. يشتمل تصميمنا على cis-repressor في نهاية 5 ′ من الرنا المرسال الذي يشكل حلزون حلقة جذعية ، يسد تسلسل الربط الريبوزومي ويمنع الترجمة. يحرر RNA التنشيط المعبر عنه تسلسل الربط الريبوزومي ، والذي يقوم بتشغيل الترجمة. تم تصميم الهيكل العام لمنظمي الريبوريغولاتور باستخدام استقرار اقتران قاعدة Watson – Crick. نحن نصف هنا مثبط رابطة الدول المستقلة يمكنه إيقاف ترجمة مراسلي مقاومة المضادات الحيوية تمامًا ومنشط عبر يعيد الترجمة. لقد أثبتنا أنه من الممكن استخدام منظمي الريبوريتور لتحقيق التحكم الترجمي للتعبير الجيني على نطاق ديناميكي واسع. لقد وجدنا أيضًا أنه يمكن تعديل تسلسل الاستهداف لتطوير منظمات الريبوريتور التي يمكنها ، من حيث المبدأ ، تنظيم ترجمة العديد من الجينات بشكل مستقل. في تجربة اختيار ، أوضحنا أنه من خلال التغيير الدقيق لتسلسل المنشط العابر ، من الممكن تغيير نسبة الحالات المكبوتة والمفعلة وتحقيق تحكم انتقالي وسيط.

هندسة Lysine-ON Riboswitch للتحكم الأيضي في إنتاج ليسين في الوتدية الجلوتاميك

Riboswitches هي عناصر RNA طبيعية تنظم التعبير الجيني عن طريق ربط ligand. هنا ، نوضح إمكانية تغيير lysine-OFF riboswitch الطبيعي من Eschericia coli (ECRS) إلى lysine-ON riboswitch الاصطناعي واستخدامه للتحكم الأيضي. تحقيقا لهذه الغاية ، تم إنشاء مكتبة lysine-ON riboswitch باستخدام الاختيار الجيني المزدوج القائم على tetA. بعد فحص المكتبة ، تم فحص وظيفة المحولات الريبية lysine-ON المحددة باستخدام جين التقرير ، lacZ. تم إدخال محولات ريبوزية مختارة ليسين-أون في جين lysE (ترميز بروتين نقل ليسين) من الوتدية الجلوتاميكوم واستخدمت لتحقيق تحكم ديناميكي في نقل اللايسين في سلالة منتجة لليسين ، C. lysine-OFF riboswitch للتحكم الديناميكي في إنزيم سينسيز سيترات. أظهرت نتائج التخمير الدفعي للسلالات أن سلالة C. glutamicum LPECRS مع محوّل ريبوس إضافي ليسين ON للتحكم في lysE حققت زيادة بنسبة 21٪ في محصول اللايسين مقارنةً بسلالة C. glutamicum LPECRS وحتى 89 ٪ زيادة في الغلة مقارنة بالسلالة مع الأسبارتوكيناز المحرر. يوفر هذا العمل نهجًا مفيدًا لتوليد محولات الريبوز ليسين- ON لهندسة استقلاب الغلوتاميك ، ويوضح لأول مرة تأثيرًا تآزريًا لمفاتيح الريبوسين ليسين أون و أوف إف لتحسين إنتاج اللايسين في هذا الكائن الدقيق المهم صناعيًا. يمكن استخدام هذا النهج للتحكم ديناميكيًا في الجينات الأخرى ويمكن تطبيقه على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

جهاز قائم على Tn7 للتعبير الجيني غير المتجانس المُعاير بتنسيق Pseudomonas putida
  • سيباستيان زوبيل
  • إيلاريا بينيديتي ،
  • لارا أيزنباخ ،
  • فيكتور دي لورنزو* ,
  • نيك ويركس و
  • لارس م

تجذب بكتيريا التربة Pseudomonas putida اهتمامًا كبيرًا بشكل متزايد كمنصة للهندسة الأيضية المتقدمة من خلال مناهج البيولوجيا التركيبية. ومع ذلك ، فإن السياق الجيني وعدد نسخ الجينات والتفاعل بين النسخ / الترجمة غالبًا ما يؤدي إلى عدم يقين كبير في تصميم التركيبات الجينية الموثوقة. في هذا العمل ، أنشأنا جهازًا معياريًا للتعبير غير المتغاير حيث تكون قوة المروج هي المتغير الوحيد ، بينما تحتوي المعلمات المتبقية للتدفق على قيم افتراضية ثابتة. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتصميم ناقل ترانسبوزون توصيل صغير لـ Tn7 الذي يدخل التركيبات في موضع جينومي واحد لكروموسوم P. ​​putida. تم دمج هذا بعد ذلك مع موقع إدخال محفز ، ومقرن انتقالي غير متغير ، وموقع لاحق لوضع الجين (الجينات) محل الاهتمام بموجب قواعد التجميع الثابتة. تم استغلال هذا الترتيب لقياس مجموعة من المروجين الاصطناعية مع ضوضاء نسخ منخفضة في هذا المضيف البكتيري. كشفت تجارب النمو وقياس التدفق الخلوي باستخدام تركيبات مروج وحيدة النسيلة- GFP عن سلوك تأسيسي قوي لهؤلاء المروجين ، الذين يمكن مقارنة نقاط قوتهم وخصائصهم بأمانة. يوسع جهاز التعبير المعياري هذا بشكل كبير مجموعة الأدوات المتاحة لهندسة التمثيل الغذائي الموثوقة والتعزيزات الجينية الأخرى لـ P. putida.

التصميم التطوري لأنظمة الحث المستندة إلى الكولين والقابلة للضغط
  • كوهي آيك ،
  • يوسوكي أراساوا
  • ساتوشي كويزومي
  • ساتوشي ميهشي ،
  • شيجيكو كاواي نوما ،
  • Kyoichi Saito و
  • دايسوكي أومينو*

من خلال التجميع والهندسة التطورية لمفاتيح النسخ المستندة إلى T7-phage المصنوعة من مكونات داخلية من أوبرون bet على كروموسوم Escherichia coli ، تم إنشاء المفاتيح الجينية التي يحفزها الكولين ، وهو مركب آمن وغير مكلف. تم الكشف عن اللدونة الوظيفية لمثبط BetI من خلال التحديد السريع والعالي التردد للمتغيرات الوظيفية ذات الخصائص المختلفة ، بما في ذلك تلك ذات الصرامة العالية ، ومستوى التعبير الأقصى الأقصى ، والأنماط الظاهرية المعكوسة ، من مجموعة من طفرات BetI. أدى التعبير البلازميد عن طفرات BetI إلى تحويل الجينات المحفزة بالكولين (Bet-ON) أو الكولين القابل للقمع (Bet-OFF) للجينات تحت تسلسل pT7 / betO بمستويات عالية غير مسبوقة ، مع الحفاظ على الحد الأدنى من التعبير المتسرب في الظروف غير المستحثة.

الذاكرة والمنطق الاندماجي القائم على انعكاسات الحمض النووي: الديناميكيات والاستقرار التطوري
  • خيسوس فرنانديز رودريغيز ،
  • لي يانغ ،
  • توماس إي جوروشوفسكي ،
  • بنجامين جوردون ، و
  • كريستوفر أ فويجت*

يمكن تنفيذ الذاكرة الجينية باستخدام الإنزيمات التي تحفز انقلاب الحمض النووي ، حيث يتوافق كل اتجاه مع "بت". هنا ، نستخدم اثنين من إنفرزات الحمض النووي (FimE و HbiF) التي تعيد توجيه الحمض النووي بشكل لا رجعة فيه بين حالتين مع اتجاه معاكس. أولاً ، نقوم ببناء الذاكرة التي تم تعيينها بواسطة FimE وإعادة تعيينها بواسطة HbiF. بعد ذلك ، نبني بوابة NOT حيث يقود مروج الإدخال FimE وفي حالة عدم وجود إشارة ، يتم الحفاظ على الحالة العكسية من خلال التعبير التأسيسي لـ HbiF. تتطلب البوابة ∼3 ساعات لتشغيلها وإيقافها. يتم قياس الثبات التطوري لهذه الدوائر عن طريق مرور الخلايا أثناء وظيفة التدوير. يكون مفتاح الذاكرة مستقرًا على مدار 400 ساعة (17 يومًا ، 14 يومًا من التغييرات في الحالة) ومع ذلك ، تنكسر البوابة بعد 54 ساعة (& GT2 أيام) بسبب التعبير المستمر للإنفرتيز. يكشف تسلسل الجينوم أن الدائرة لا تزال سليمة ، لكن سلالة المضيف تتطور لتقليل تعبير الانفرتيز. يسلط هذا العمل الضوء على الحاجة إلى تقييم المتانة التطورية وأنماط الفشل لتصميمات الدوائر ، خاصة مع تنفيذ دوائر متعددة أكثر تعقيدًا.


الشكل 4

الشكل 4. تُظهر صور SIMS الإجمالية والمختارة توطين إشارة TET للفرد بكتريا قولونية. تمت زراعة البكتيريا على Si وعلاجها بـ 20 ميكروغرام / مل من TET. تُظهر الصور الأيونية الموجبة الإجمالية في (أ ، ب) الخطوط العريضة للبكتيريا التي تخضع لتآكل الحزمة من السطح العلوي إلى عمق 800 نانومتر. توزيع Si (تم تعيينه بواسطة م/ض 167.9) و TET (تعيينه عن طريق جمع الأيونات الجزيئية مع شظايا في م/ض 410.1 و 427.2 و 445.2) من أعلى إلى عمق 800 نانومتر موجودة في (ج) - (و). توضح صور تراكب الإشارة في (g) و (h) تكوّن تنسيق TET (أصفر) إلى بكتريا قولونية، ممثلة بالمناطق السوداء داخل خلفية Si (الزرقاء).

تأثير مضخة التدفق TetA على تراكم TET

إشارة المخدرات (م/ض 410 + 427 + 445) عد / بكسل ± STDEV الموزون
جرعة من TET (ميكروغرام / مل)العمق (نانومتر)تيتامكافحة ناقلات
00–4008.8 ± 2.38.1 ± 6.0
400–8007.0 ± 2.57.9 ± 5.1
200–4009.1 ± 6.815.2 ± 6.3
400–8006.2 ± 6.67.0 ± 4.8
1800–40020.1 ± 7.626.4 ± 12.2
400–80014.8 ± 10.223.5 ± 9.8

معلومات الكاتب

الانتماءات

قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية ، مركز هندسة الأغشية الحيوية ، ومعهد البيولوجيا الحرارية ، جامعة ولاية مونتانا ، بوزمان ، مونتانا ، الولايات المتحدة الأمريكية

رولاند هاتزينبيشلر وفيولا كروكنبرج وراشيل إل سبيتز وأمبير زاكاري جاي

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

قام R.H. بتصميم مفهوم هذه المراجعة. كتب جميع المؤلفين المخطوطة.

المؤلف المراسل


المشاريع الممولة

عنوان: دراسات حول النقل الجماعي للأكسجين بدون مقاومة الغازات السائلة كما هو مطبق في النظم الحيوية.

مبلغ المنحة: روبية. 3.79 كهس

الفترة والحالة: 1995-1997 ، اكتمل

الملخص:يعتبر النقل الجماعي للأكسجين من خلال نقل الكتلة الغازية السائلة عاملاً مقيدًا للتشغيل الأمثل للعديد من الأنظمة المهمة صناعيًا ، مثل المفاعلات الحيوية الهوائية. درس هذا المشروع النقل الجماعي للأكسجين من خلال منهجية لا تتضمن مقاومة الغاز والسائل. تضمنت المنهجية المرحلة السائلة فى الموقع تحلل بيروكسيد الهيدروجين إلى أكسجين وماء. هذه المنهجية الجديدة لنقل الأكسجين حسنت بشكل ملحوظ الإنتاجية المحددة للعمليات الحيوية.

الوكالة الراعية: مجلس البحث في العلوم النووية (BRNS)

عنوان: معالجة المياه العادمة من الأمونيا من محطات المياه الثقيلة.

مبلغ المنحة: روبية. 10.25 كهس

الفترة والحالة: 1997-1999 ، اكتمل

المحققون المساعدون: S.R. Asolekar ، K.V. Venkatesh (IIT) R.R.Sund (BARC)

الملخص:ينتج عن إنتاج الماء الثقيل بدرجة المفاعل كميات كبيرة من مياه الصرف السائلة التي تحتوي على مستويات غير مقبولة من الأمونيا. كانت العملية المستخدمة في محطات الماء الثقيل لتقليل مستويات الأمونيا في مياه الصرف الصحي كثيفة الاستخدام للطاقة ولم تعالج المشكلة تمامًا. لذلك ، فإن نظام معالجة النفايات السائلة الذي يستخدم التحويل الميكروبي للأمونيا ، والذي يتغلب على المشاكل التي تطرحها الطريقة المذكورة أعلاه ، كان مرغوبًا للغاية. تناول المشروع طريقة جرثومية لتحويل الأمونيا إلى نيتروجين ونترات غير ضارة. هذا ينطوي على استخدام أنواع مختلفة من بكتيريا نيتروسوموناس و نيتروباكتر تشكيلة. ميزة إضافية لهذه الطريقة هي أن النترات المنتجة يمكن استخدامها كسماد & # 8217 لنمو العشب والأشجار. كما تمت معالجة المستوى الأمثل من النترات الذي يمكن الحصول عليه من منشأة معالجة النفايات السائلة ، بناءً على الحاجة الفعلية "للأسمدة & # 8217". بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين العمليات البيولوجية المختلفة المشاركة في معالجة النفايات السائلة بناءً على حالة الطاقة (الأيضية) للثقافة.

الوكالة الراعية: مجلس عموم الهند للتعليم الفني (AICTE)

عنوان: تحسين غلات المفاعلات الحيوية باستخدام حالة الثقافة في التخمير اللزج.

مبلغ المنحة: روبية. 5 كهس

الفترة والحالة: 1997-2000 ، اكتمل

المحققون المشاركون: A. K. Suresh

الملخص:تم تحسين الطريقة المذكورة في مشروع DST أعلاه. لتحسين الطريقة ، احتجنا إلى معلومات عن حالة الخلايا في المزرعة ، والمصانع الفعلية التي تنتج المنتج. هذه المعلومات متاحة من خلال قياس حالة الثقافة. يتم قياس حالة الثقافة من خلال التألق الثقافي وهو مقياس غير جراحي لمستوى NADH في الثقافة.

الوكالة الراعية: قسم العلوم والتكنولوجيا (DST)

عنوان: تحسين إنتاجية الإنزيم من الأنظمة الهوائية الحساسة للقص

مبلغ المنحة: روبية. 10.75 كهس

الفترة والحالة: 2000-2003 ، اكتمل

المحققون المساعدون: A. K. Suresh

الملخص:تم تطوير مفاعل حيوي جديد لتدفق couette (CFB) يمكن من خلاله إجراء الزراعة بأكملها في ظل ظروف قص محددة. تم تحقيق إمداد الأكسجين ، وهو العامل المحدد الطبيعي للزراعة بأكملها في ظل ظروف قص محددة ، عن طريق تمرير الهواء عبر غشاء تفلون مثبت على الأسطوانة الداخلية لـ CFB. الأهم من ذلك ، أن تحليلات قدرات نقل الأكسجين وكذلك معدلات القص تظهر أنه في CFB هذا ، يمكن دراسة تأثيرات القص المحدد دون تدخل من تأثيرات إمداد الأكسجين. تم العثور على مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) ليكون الحد الأقصى في بداية المرحلة الثابتة عندما نمت في CFB ، ويشتبه في أن نمط موت الخلايا هو موت الخلايا المبرمج.

الوكالة الراعية: وزارة تنمية الموارد البشرية (MHRD)

عنوان: تحسين أداء المفاعلات الحيوية التي تستخدم الكائنات المؤتلفة باستخدام إستراتيجية المرحلة السائلة لإمداد الأكسجين (LPOS).

مبلغ المنحة: روبية. 12 كهس

الفترة والحالة: 2003-2006 ، اكتمل

المحققون المساعدون: S. B. Noronha ، A. K. Suresh

الملخص: استراتيجية إمداد الأكسجين بالطور السائل (LPOS) ، والتي تتميز بتطور الأكسجين في المرحلة السائلة من خلال التحلل الحفزي لبيروكسيد الهيدروجين (H2ا2) البقول ، لزراعة نظام مؤتلف - مؤتلف الإشريكية القولونية التي يمكن تحفيزها لإنتاج الستربتوكيناز عن طريق تغيير درجة الحرارة. أظهرت دراسات السمية أن H مبدئيًا2ا2كان تركيز 7.5 ملي مولار هو الأمثل. كان العائد النوعي للستربتوكيناز في الزراعة باستخدام LPOS ضعف القيمة التي تم الحصول عليها من الزراعة التقليدية القائمة على إمداد الأكسجين من خلال التهوية. ومن المثير للاهتمام ، أن فقد البلازميد كان أقل بنسبة 10-15٪ مع LPOS مقارنة بالزراعة التقليدية. للحصول على ملفات تعريف التغذية المثلى لـ H2ا2، تم تطوير نموذج العملية. تم تحسين النموذج باستخدام أداة قوية للتحسين العشوائي تعتمد على الخوارزمية الجينية للحصول على H الأمثل2ا2معدلات العلف. تم استخدام نهج متنبأ بالنموذج ، وكذلك تم التنبؤ بمعلمات النموذج غير المعروفة باستخدام الخوارزمية الجينية. الأمثل H2ا2أسفرت ملفات تعريف الإضافة ، التي تم التحقق منها تجريبيًا أيضًا ، عن إنتاجية نوعية أعلى بمقدار 4 أضعاف من الستربتوكيناز مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها من الزراعة مع التهوية ، وعائدات نوعية أعلى بمقدار ضعفين مقارنة بالزراعة دون تحسين.

الوكالة الراعية: قسم التكنولوجيا الحيوية (DBT)

عنوان: مناهج التكنولوجيا الحيوية لإنتاج وزراعة الباتشولي.

مبلغ المنحة: المجموع: روبية. 85.14 كهس (مشروع متعدد المؤسسات) IIT Bombay: Rs. 26.45 كهس

الفترة والحالة: 2003-2006 ، اكتمل

المحققون المساعدون: Kelkar Education Trust & # 8217s مركز البحث العلمي (مومباي ، ماهاراشترا) ، Keva Biotech. المحدودة (مومباي ، ماهاراشترا) ، المعهد المركزي لبحوث المحاصيل الزراعية (كاسارجود ، ولاية كيرالا) ، المركز القومي للبحوث للنباتات الطبية والعطرية (بوريافي ، غوجارات) ، جامعة العلوم الزراعية (دهارواد ، كارناتاكا) ، د. دابولي ، ماهاراشترا)

الملخص: ثم تم تحديد التكاثر النسيلي للنباتات عن طريق زراعة الأنسجة كأفضل طريقة للحصول على مادة الزراعة للنباتات التي يتم تكاثرها نباتيًا. مشكلة في نظام زراعة الأنسجة هي التكلفة العالية للنباتات بسبب المدخلات المتخصصة. يعتبر التكاثر الدقيق للنباتات عملية يدوية إلى حد كبير ، وهي مقيدة بالقيود المفروضة على سهولة التعامل مع المشغلين المهرة وظروف التعقيم الصارمة.

أنظمة المفاعلات الحيوية هي طريقة بديلة لزيادة حجم العمليات ومعدل إنتاج النباتات. بالنظر إلى زيادة كفاءة الإنتاج بتكاليف أقل ، إذا تم تغيير التكاثر الدقيق للنباتات على نطاق واسع إلى طريقة المفاعل الحيوي ، فإن صناعة البستنة ستدرك بشكل أفضل مزايا استخدام نباتات الأنسجة المزروعة للزراعة. على الرغم من أن المفاعلات الحيوية شائعة جدًا ، وتستخدم على نطاق واسع في الصناعة الحيوية ، إلا أن المفاعلات الحيوية لزراعة نباتات النبتة نادرة. تم تصميم وبناء وتشغيل مفاعل حيوي جديد ، قابل لإعادة الاستخدام ، لثقافة التصوير كجزء من هذا المشروع.

لم يتطلب المفاعل الحيوي المطوَّر لاستنبات الشتلات أن تنمو النبتات على سطح السائل. وبالتالي ، تم تجنب العيب الرئيسي لفرط الترطيب أو التزجيج تمامًا عند استخدام المفاعل الحيوي المطور. علاوة على ذلك ، كان المفاعل الحيوي المطور قابلاً لإعادة الاستخدام ، وسمح بمراقبة سهلة ومستمرة للعديد من متغيرات المفاعلات الحيوية المهمة مثل الأكسجين المذاب (DO) ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، وكتلة اللقطة ، وغيرها من العوامل الضرورية لتحسين العملية. أيضًا ، في المفاعل الحيوي المطور ، كان من الممكن معالجة الغلاف الجوي نحو النتائج المرغوبة مثل معدلات النمو المرتفعة ، والمحتويات المرغوبة لأجزاء النبات مثل الورقة ، وغيرها. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هناك العديد من الميزات في المفاعل الحيوي المطور حاليًا والتي كانت جذابة وقابلة للحماية ببراءة اختراع.

الوكالة الراعية: المنتدى الهندي الأمريكي

عنوان: جوانب أنواع الأكسجين التفاعلية في مياه الشرب

مبلغ المنحة: 30،000 دولار أمريكي

الفترة والحالة: 2008-2010 ، اكتمل

شريك: جين فان بريسين ، جامعة كارنيجي ميلون

الملخص:تعد معالجة مياه الشرب بالكلور طريقة أساسية للتطهير. ومع ذلك ، فإن العديد من الكائنات الحية ذات الأهمية تقاوم الكلورة (على سبيل المثال المتفطرة). آلية تثبيط الجراثيم بالكلور ليست مفهومة جيدًا ، وبالتالي ، فهم آليات مقاومة الكلور غير موجود أيضًا. افترضنا أن التثبيط الميكروبي القائم على الكلور يتم بوساطة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). قمنا بتقييم هذه الفرضية ، وأسفر العمل عن فهم أفضل لتأثير الكلور على المتفطرة ، وكذلك فهم أفضل لآلية تثبيط الميكروبات بالكلور.

الوكالة الراعية: قسم التكنولوجيا الحيوية (DBT)

عنوان: تطوير مفاعل حيوي ضوئي لوقود الطحالب الحيوي

مبلغ المنحة: روبية. 1.3 كرور

الفترة والحالة: 2009-2011 ، اكتمل

محقق مشارك: Shrikumar Suryanarayan

الملخص: كان نطاق هذا المشروع هو تطوير معلمة تصميم للتوسيع الفعال لمفاعل حيوي ضوئي لإنتاج الزيت (الدهون) من شلوريلا فولغاريس. شلوريلا فولغاريس تم اختياره كنظام طحالب نموذجي بسبب المعلومات الأساسية الهامة المتوفرة عليه ، مقارنة بأي طحالب أخرى لديها القدرة على الزراعة في ظل ظروف ملحية.كانت الظروف الملحية ذات أهمية قصوى ، حيث طلب منا التركيز على الجوانب البحرية بواسطة DBT. تم تصميم وتصنيع مفاعل حيوي ضوئي كبير الحجم بسعة 15 لترًا من أجل الدراسة. تأثيرات العوامل مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة والملوحة والضوء شلوريلا فولغاريستمت دراستها. أيضا ، بعض العمل على تأثير المعلمات على Dunaliella بارفا و Chaetoceros mullieri تم أيضا. ثم تمت معالجة جوانب توسيع نطاق المفاعلات الحيوية الضوئية بالتفصيل.

الوكالة الراعية: ديفاشري

عنوان: الوقود الحيوي الطحالب

مبلغ المنحة: روبية. 25 كهس +

الفترة والحالة: 2008-2013 ، اكتمل

الملخص: تناول هذا المشروع في البداية تطوير أنظمة الزراعة البديلة للطحالب الدقيقة ، ثم تناول بعض الدراسات حول تحسين العديد من جوانب زراعة الطحالب الدقيقة مثل التكتل الكهربائي.

الوكالة الراعية: قسم العلوم والتكنولوجيا (DST)

عنوان:الأنواع التفاعلية لتحسين إنتاجية الزيت الحيوي من الطحالب الدقيقة

مبلغ المنحة: روبية. 32.83 كهس

الفترة والحالة:6 فبراير 2013 - 5 فبراير 2016 ، اكتمل العمل

الملخص:يتمثل التحدي في إنتاج الزيت الحيوي القائم على الطحالب في تعزيز معدلات النمو المحددة ومحتوى الدهون المحدد في وقت واحد. أظهرنا زيادات متزامنة في كل من أعلاه في شلوريلا فولغاريس من خلال الأنواع التفاعلية المستحثة تحت المعالجات الضوئية UVA و UVB ، وحققت زيادة قدرها 8.8 أضعاف في إنتاجية الدهون الحجمية.

علاوة على ذلك ، أبلغنا لأول مرة أن المستويات الداخلية ، والحالة الزائفة المستقرة ، والمحددة داخل الخلايا لجذر الهيدروكسيل تتذبذب بطريقة فوقية (نظام نموذجي: الطحالب الدقيقة ، شلوريلا فولغاريس) ، وتميزت أيضًا بمعلمات الإيقاع المختلفة. نقوم بإعادة ضبط الإيقاع الداخلي من خلال إدخال أشعة UVA ، وتوليد إيقاعين فائقين جديدين. أدت إعادة الضبط إلى زيادة نافذة الحد الأقصى لتراكم الدهون من 6 ساعات إلى 12 ساعة بالتزامن مع بداية الإيقاعات فوق الراديوية.

بالإضافة إلى ذلك ، أبلغنا عن تطبيق جديد: تم استخدام تحويل الفوتون ، وهي عملية تحويل إشعاعات الطاقة المنخفضة إلى تلك التي تحتوي على طاقة أعلى من خلال استخدام أنظمة الفوسفور المناسبة ، كإستراتيجية أنوفيل لتحسين نمو الطحالب الدقيقة وإنتاجية الدهون.

الوكالة الراعية: قسم العلوم والتكنولوجيا (DST)

عنوان: تحفيز الإيقاعات لتحسين علاج السرطان

مبلغ المنحة: روبية. 38.3 كهس

الفترة والحالة:25 يناير 2017 - يناير 2020 ، مستمر


الملخص

يعتبر ترسيب البروتين في المذيبات العضوية استراتيجية فعالة لاستنفاد كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) قبل تحليل التصلب المتعدد. هنا نقوم بتقييم استعادة البروتينات الغشائية والذوبان في الماء من خلال الترسيب مع الكلوروفورم / الميثانول / الماء أو مع الأسيتون (80٪). مع كل نظام مذيب ، كانت استعادة البروتين الغشائي أكبر من 90٪ ، والتي كانت أعلى بشكل عام من بروتينات العصارة الخلوية. مع استثناءات قليلة ، تم أيضًا اكتشاف البروتينات الطافية المتبقية التي تم اكتشافها بواسطة MS في بيليه الترسيب ، مع وجود كثافة أعلى لإشارة MS في جزء الحبيبات. بعد هطول الأمطار ، نقدم استراتيجية جديدة للتحليل الكمي للبروتينات في نظام مذيب متوافق مع MS. يتم تحضين الحبيبات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في 80٪ حمض / ماء فورميك ثم يتم تخفيفها 10 أضعاف بالماء. يتطابق استرداد البروتين الغشائي مع صوتنة الحبيبات في 1٪ SDS. البروتينات التي تم حلها تكون مستقرة في درجة حرارة الغرفة ، مع عدم وجود صيغة ملحوظة كما هو الحال بالنسبة للبروتينات المعلقة في حمض الفورميك في درجة حرارة الغرفة. يتم تطبيق البروتوكول على تحديد الوزن الجزيئي لبروتينات الغشاء من عينة مجزأة من GELFrEE الإشريكية القولونية البروتينات.


شاهد الفيديو: شرح I خطوات طريقة فحص بكتيريا I Coliform and E. coli في الماء بطريقة الميديا الجاهزة (أغسطس 2022).