معلومة

وظيفة خطوط خلايا الإنقاذ

وظيفة خطوط خلايا الإنقاذ



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أقرأ في ورقة بحث فيها المؤلفون ثلاثة خطوط خلوية لدراسة وظيفة الجين محل الاهتمام (Mbd3):

واحد ضُرب من أجل الجين المثير للاهتمام [Mbd3 - / -] ، الآخر مفلوكسي للأليل الواحد [Mbd3 fl / -] ، ويتم إنقاذ الخط الخلوي الثالث [Mbd3 - / - (تم الإنقاذ)] ، وهذا يعني أنه في خط الخلية للخلايا المنهارة قاموا بنقل بلازميد بشكل ثابت يعبر عن الجين المعني. أتساءل بعد ذلك ، لماذا يستخدمون خط خلية الإنقاذ هذا ، بدلاً من استخدام خلايا النوع البري مع أليلات النوع البري لـ MDB3?


تجارب الإنقاذ هي المعيار الذهبي لتأكيد أن التأثير يرجع إلى الجين المعني.

قد يكون لإزالة الجين تأثيرات غير مستهدفة ، ولكن إذا كان بإمكانك إعادة الوظيفة إلى الوضع "الطبيعي" عن طريق إضافة الجين مرة أخرى إلى خط الخلية / الحيوان ، فهذا دليل قوي على أن الجين ومنتجاته هما سبب التأثيرات التي يتم ملاحظتها في التجربة.

عادةً ما يتم تضمين الخلايا البرية لإظهار الاستجابة "الطبيعية".


تحديد وظيفة الجينات عن طريق الإنقاذ الدوري للتغليف من مكتبات (كدنا) الفيروسية

غالبًا ما يصعب تحديد الجينات التي تنظم الاستجابات في خلايا الثدييات من خلال استراتيجيات الاستنساخ الوظيفية التي تقتصر على جولة اختيار واحدة. نحن هنا نصف إستراتيجية ، إنقاذ التغليف الدوري (CPR) ، الذي يسمح بالاسترداد السريع وإعادة الإرسال لمكتبات (كدنا) الفيروسية. يمكن استخدام الإنعاش القلبي الرئوي ليس فقط مع خطوط الخلايا الخالدة مثل الخلايا الليفية وخلايا Jurkat T ، ولكن أيضًا مع الخلايا الليمفاوية B الأولية ، والتي لا يمكن الحفاظ عليها إلا في الثقافات قصيرة المدى. يسمح الإنعاش القلبي الرئوي بجولات متعددة من الاختيار والإثراء لتحديد cDNAs التي تنظم الاستجابات في خلايا الثدييات. باستخدام الإنعاش القلبي الرئوي ، تم استنساخ خمسة cDNAs وظيفيًا ، مما منح الحماية ضد موت الخلايا المبرمج الناتج عن عامل نخر الورم ألفا (TNFalpha) في الأرومات الليفية RelA (- / -). ثلاثة من الجينات ، RelA ، البروتين المثبط الشبيه بـ FLICE (c-FLIP) ، والطفرة السلبية المهيمنة لمستقبل TNF 1 الناشئة من خلال الإنعاش القلبي الرئوي ، وفرت حماية قوية ضد موت الخلايا المبرمج. تم تحديد اثنين من الجينات ، Dbs وبروتين مجال الموت المرتبط بفاس (FADD) ، الذي تم تحديده سابقًا على أنه جزيء proapoptotic ، يوفر حماية جزئية ضد موت الخلايا المبرمج الناجم عن TNFalpha. تشير هذه النتائج إلى أن الإنعاش القلبي الرئوي هو طريقة متعددة الاستخدامات تسمح بالتعرف الوظيفي لكل من المنتجات الجينية من النوع البري والسلبي المهيمن التي تنظم الاستجابات الخلوية.

الأرقام

التعافي السريع وإعادة الإرسال المتحكم فيه ...

الشفاء السريع والتحكم في إعادة الإرسال للفيروسات القهقرية من سلالات خلوية متعددة باستخدام ...

جولات متعددة من وظيفية ...

يمكن استخدام جولات متعددة من الفحص الوظيفي باستخدام الإنعاش القلبي الرئوي من أجل ...

الجينات المحددة وظيفيًا بواسطة الإنعاش القلبي الرئوي ...

تشمل الجينات التي تم تحديدها وظيفيًا بواسطة الإنعاش القلبي الرئوي الطفرات السلبية المهيمنة التي تم إنشاؤها أثناء عملية ...

الجينات المحددة وظيفيًا بواسطة الإنعاش القلبي الرئوي ...

تتضمن الجينات المحددة وظيفيًا بواسطة الإنعاش القلبي الرئوي المعدِّلات FADD و Dbs * التي ...


محتويات

هناك العديد من خطوط الخلايا الخالدة. بعضها عبارة عن خطوط خلوية طبيعية (على سبيل المثال مشتقة من الخلايا الجذعية). خطوط الخلايا الأخرى الخالدة هي في المختبر ما يعادل الخلايا السرطانية. يحدث السرطان عندما تتعرض الخلية الجسدية التي لا يمكن أن تنقسم عادة إلى طفرات تؤدي إلى إلغاء تنظيم عناصر التحكم في دورة الخلية الطبيعية مما يؤدي إلى انتشار غير متحكم فيه. خضعت سلالات الخلايا الخالدة لطفرات مماثلة مما سمح بنوع من الخلايا التي لا تكون عادة قادرة على الانقسام لكي تتكاثر في المختبر. أصول بعض سلالات الخلايا الخالدة ، على سبيل المثال الخلايا البشرية هيلا ، هي من السرطانات التي تحدث بشكل طبيعي. تم أخذ HeLa ، أول خط خلايا بشرية خالدة على الإطلاق ، من Henrietta Lacks (بدون موافقة مستنيرة [1]) في عام 1951 في مستشفى جونز هوبكنز في بالتيمور ، ميريلاند.

تُستخدم خطوط الخلايا الخالدة على نطاق واسع كنموذج بسيط للأنظمة البيولوجية الأكثر تعقيدًا ، على سبيل المثال لتحليل الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلية لخلايا الثدييات (بما في ذلك الإنسان). [2] الميزة الرئيسية لاستخدام خط خلوي خالد في البحث هي خلوده ، حيث يمكن أن تنمو الخلايا إلى أجل غير مسمى في المزرعة. هذا يبسط تحليل بيولوجيا الخلايا التي قد يكون لها عمر محدود بخلاف ذلك.

يمكن أيضًا استنساخ خطوط الخلايا الخالدة مما يؤدي إلى ظهور مجموعة نسيلية يمكن بدورها نشرها إلى أجل غير مسمى. يسمح ذلك بتكرار التحليل عدة مرات على خلايا متطابقة وراثيًا ، وهو أمر مرغوب فيه للتجارب العلمية القابلة للتكرار. البديل ، إجراء تحليل على الخلايا الأولية من متبرعين متعددين للأنسجة ، لا يتمتع بهذه الميزة.

تستخدم سلالات الخلايا الخالدة في التكنولوجيا الحيوية ، حيث تكون طريقة فعالة من حيث التكلفة لنمو خلايا مماثلة لتلك الموجودة في كائن متعدد الخلايا في المختبر. تُستخدم الخلايا لمجموعة متنوعة من الأغراض ، من اختبار سمية المركبات أو الأدوية إلى إنتاج البروتينات حقيقية النواة. [3]

تحرير القيود

تغييرات من أصول غير ميتة تحرير

بينما تنشأ خطوط الخلايا الخالدة غالبًا من نوع نسيج معروف جيدًا ، فقد خضعت لطفرات كبيرة لتصبح خالدة. هذا يمكن أن يغير بيولوجيا الخلية ويجب أن يؤخذ في الاعتبار في أي تحليل. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتغير خطوط الخلايا وراثيًا عبر مقاطع متعددة ، مما يؤدي إلى اختلافات في النمط الظاهري بين العزلات وربما نتائج تجريبية مختلفة اعتمادًا على متى وبأي سلالة يتم عزل التجربة. [4]

تحرير التلوث بالخلايا الأخرى

العديد من سلالات الخلايا المستخدمة على نطاق واسع في الأبحاث الطبية الحيوية قد تلوثت ونمت بواسطة خلايا أخرى أكثر عدوانية. على سبيل المثال ، خطوط الغدة الدرقية المفترضة هي في الواقع خلايا سرطان الجلد ، وأنسجة البروستاتا المفترضة كانت في الواقع سرطان المثانة ، ومن المفترض أن الثقافات الرحمية الطبيعية كانت في الواقع سرطان الثدي. [5]

هناك عدة طرق لتوليد خطوط خلوية خالدة: [6]

  1. العزلة من السرطان الطبيعي. هذه هي الطريقة الأصلية لتوليد خط خلوي خالد. تشمل الأمثلة الرئيسية خط هيلا البشري مستمدًا من خلايا سرطان عنق الرحم المأخوذة في 8 فبراير 1951 ، [2] من هنريتا لاكس ، وهي امرأة أمريكية من أصل أفريقي تبلغ من العمر 31 عامًا وأم لخمسة أطفال ، والتي توفيت بسبب السرطان في 4 أكتوبر 1951. [7]
  2. إدخال جين فيروسي يحرر دورة الخلية جزئيًا (على سبيل المثال ، تم استخدام جين الفيروس الغدي من النوع 5 E1 لتخليد خط الخلايا HEK 293 ، يمكن لفيروس Epstein-Barr تخليد الخلايا الليمفاوية B عن طريق العدوى [8]).
  3. التعبير الاصطناعي للبروتينات الرئيسية المطلوبة للخلود ، على سبيل المثال تيلوميراز الذي يمنع تحلل نهايات الكروموسوم أثناء تكرار الحمض النووي في حقيقيات النوى. [9] ، وهي تستخدم على وجه التحديد لتوليد خطوط الخلايا البائية الخالدة المنتجة للأجسام المضادة ، حيث يتم دمج الخلية البائية المنتجة للأجسام المضادة مع خلية المايلوما (سرطان الخلية البائية). [10]

أمثلة تحرير

هناك العديد من الأمثلة على خطوط الخلايا الخالدة ، ولكل منها خصائص مختلفة. يتم تصنيف معظم خطوط الخلايا الخالدة حسب نوع الخلية التي نشأت منها أو التي تشبه إلى حد كبير بيولوجيًا.


أدوات تجميع البيانات للإنقاذ

كان الولد يبلغ من العمر شهرًا واحدًا فقط ولكنه أصيب بقدر من المشاكل الصحية التي لا يعاني منها الآخرون في حياتهم. كان يعاني باستمرار من عدوى بكتيرية ، ويحارب التهابًا غير مبرر ، ولا يكتسب وزنًا ، و- الأكثر رعباً- يعاني من إسهال دموي ، وهو عرض محير جعل بعض الأطباء يعتقدون أنه مصاب بنسخة لدى الأطفال من مرض القولون العصبي.

رأى أرتيميو ميغيل جونغكو ، أخصائي الحساسية والمناعة الذي كان ينهي دراسته في كلية الطب ، الصبي في اليوم الأول من ممارسته التناوب الأولى في عام 2008. بدت الأعراض مألوفة بشكل غامض من قراءة كتابه المدرسي: اضطراب وراثي نادر يسمى مرض الورم الحبيبي المزمن ، أو CGD ، حيث لا يستطيع الجهاز المناعي محاربة العدوى بشكل صحيح. كانت هناك علاجات داعمة لـ CGD ، لكن العلاجات التي نجحت مع بعض المرضى لم تعمل بالضرورة مع الآخرين.

لماذا تضع الطبيعة الأم مثل هذا الجين المهم على كروموسوم X الذي لن نعرفه على الأرجح.

في حين أن معظم الاضطرابات الوراثية غير قابلة للشفاء ، فإن الأطباء يبذلون قصارى جهدهم لإدارتها. تساعد بعض الأدوية بينما يثبت البعض الآخر عدم جدواها - وهي ظاهرة تنبع من الاختلافات الجينية للمرضى وصعوبة التنبؤ بالجينات المعنية. إذا عرف الأطباء المزيد عن تفاعل الجينات ، فيمكنهم ابتكار علاجات مخصصة ، ومطابقتها مع التركيبات الجينية المحددة للمرضى.

حتى وقت قريب ، لم يكن لدى الأطباء أدوات جيدة للتحليل الجيني الشخصي. لكن هذا يتغير بفضل علم الأحياء الكمي. يدمج الانضباط بين الأساليب الرياضية والإحصائية والحسابية لدراسة الكائنات الحية ، كما يوضح جيسي جيليس ، عالم الأحياء الكمية في مختبر كولد سبرينغ هاربور ، الذي يتعاون الآن مع Jongco في أبحاث CGD. يطور علماء الأحياء الكمية خوارزميات تستهلك مجموعات كبيرة من البيانات وتحاول فهمها. في حالة الاضطرابات الوراثية النادرة ، يعني ذلك تحليل كميات كبيرة من البيانات من عدة مرضى لفهم كيفية عمل جيناتهم جنبًا إلى جنب مع بعضهم البعض. يأمل الباحثون مثل جيليس وفريقه في إعطاء الأطباء نظرة خاطفة على ما تفعله جينات مرضاهم ، مما يساعد على ابتكار علاجات مخصصة.

بالنسبة لـ Jongco ، الذي أصبح الآن متخصصًا في الحساسية والمناعة للأطفال في Northwell Health ، وهو نظام رعاية صحية في نيويورك ، يمثل CGD معضلة لدرجة أنه أصبح سعيه الشخصي لفهم جميع ركائزه للتشخيص والعلاج بطريقة شخصية. ربط العلماء بين CGD والعدلات المعطلة - نوع خلايا الدم البيضاء التي تلتف عادة حول مسببات الأمراض ، كما لو كانت تغلقها عن الجسم في سجن خلوي أو غرفة موت من نوع ما. ثم تقوم العدلات بما يسميه العلماء الانفجار التأكسدي - داخل حجرة الموت تلك ، تطلق جزيئات نشطة تسمى الجذور الحرة التي تدمر البق. في هذه العملية ، تموت العدلات أيضًا ، لكن الجسم ينتج المزيد.

عدم المساواة الاجتماعية تترك علامة وراثية

في البشر ، الاختلافات البيولوجية العميقة الموجودة بين الجنسين تعني أن الذكر الوحيد قادر جسديًا على إنجاب عدد أكبر بكثير من الأنثى غير المتزوجة. تحمل النساء الأطفال الذين لم يولدوا بعد لمدة تسعة أشهر وغالبا ما ترضعهم. اقرأ أكثر

في الأشخاص الذين يعانون من CGD ، لا تعمل العدلات بشكل صحيح. إما أنها لا تحجب الخلل بالكامل أو لا تصطدم بها بشكل صحيح ، لكن مسببات الأمراض تستمر بينما تتسبب الجذور الحرة في إتلاف أنسجة الجسم. يقول Jongco: "إنها مثل حزمة قائمة بذاتها صممتها الطبيعة الأم لتدمير مسببات الأمراض". "ولكن لأي سبب من الأسباب ، فإن هذه الحزمة القائمة بذاتها لا تعمل بشكل صحيح."

يمكن أن تكون أعراض CGD متناقضة تقريبًا. يعاني بعض المرضى من نقص المناعة بسبب ضعف الجهاز المناعي ، بينما في نفس الوقت يكافحون أمراض المناعة الذاتية ، حيث يهاجم الجهاز المناعي شديد الحماس جسمه. يحتاج الأول إلى دفعة ، بينما يحتاج الأخير إلى ترطيب. كيف يعالج الطبيب كليهما؟

عادة ، يضع الأطباء المرضى على الأدوية المضادة للبكتيريا والفطريات ، بالإضافة إلى دواء إنترفيرون جاما ، الذي يحفز على الانطلاق - ولكن فقط في المرضى الذين لديهم بعض القدرة على الانفجار التأكسدي (البعض ليس لديهم أي منها). الأدوية المضادة للالتهابات. بالنسبة للآخرين ، قد يكون زرع الخلايا الجذعية المحفوف بالمخاطر هو الملاذ الأخير. إن معرفة خيارات العلاج ومجموعات الأدوية التي تعمل بشكل أفضل يكمن في مكان ما في التفاعل المعقد لجينات المرضى.

تعد دراسة الاضطرابات مثل CGD أمرًا صعبًا لأنها نادرة ولا يوجد الكثير من المرضى. تستغرق دراستها على الفئران - في المختبرات الرطبة ، كما يسميها العلماء - وقتًا طويلاً. أيضًا ، ما ينجح في الفئران لا ينجح دائمًا مع البشر.

كان هناك فهم متزايد بأن وظيفة الجينات غالبًا ما تعتمد على السياق ، مع توفير جزء كبير من هذا السياق من خلال أنشطة الجينات الأخرى.

في السنوات الأخيرة ، نضجت تقنيات تسلسل الحمض النووي لدرجة أن الخوارزمية الذكية يمكن أن تحلل البيانات الجينية من عدة مرضى وعائلاتهم - وتجد اتجاهات تروي الحكايات أسرع بكثير من التجارب على القوارض. يقول Jongco: "أدركت أنه لا يمكننا القيام بالكثير إلا في منضدة المختبر ، فلا يمكننا أن نكون أسيادًا لكل شيء". "لا أستمتع بكتابة الكود ، لذلك كنت بحاجة إلى شريك في عالم البيانات الحاسوبية لتحليل البيانات الضخمة ، شخص حبه هو الجانب الحسابي ولكنه على استعداد لمعرفة المزيد عن علم الأحياء الأساسي."

في عام 2017 ، تواصل Jongco مع Gillis ، الذي كان مكانه هو بالضبط ما كانت تبحث عنه Jongco - طريقة لتحليل البيانات الجينية من مختلف المرضى والعثور على الأنماط والاتجاهات الشائعة. كان مسعى CGD منسجمًا مع مشاريع جيليس في علم الأحياء الكمية الأخرى. كانت بعض خوارزمياته تدرس بيولوجيا النبات ، مع التركيز على الجينات التي يمكن أن تساعد النباتات على النمو بشكل أفضل أو تكون أكثر مرونة. لكن فكرة Jongco عن غربلة جينات المرضى على أمل العثور على بعض مفاتيح الرعاية الشخصية كانت مهمة ملهمة. يقول جيليس: "لقد أتاح فرصة حقيقية لمساعدة أناس حقيقيين".

تعاون جيليس وجونغكو معًا للبحث عن الجينات عبر الإنترنت. لقد عملوا على بروتوكول. بمجرد وصول مريض جديد مصاب بأعراض الورم الحبيبي إلى مكتب Jongco ، سيتم أخذ عينات دمه واستخراج الخلايا المناعية وإرسالها إلى CSHL. في بعض الأحيان ، يقوم Jongco بتسليمها يدويًا - يقع CSHL على بعد 15 دقيقة فقط ولا تعيش العدلات لفترة طويلة خارج الجسم ، لذلك كان التوقيت جوهريًا. سرعان ما انضمت مؤسسات أخرى إلى هذا الجهد ، بما في ذلك المعاهد الوطنية للصحة ، ومؤخراً ، جامعة بيتسبرغ. سيضع فريق جيليس الخلايا في جهاز التسلسل ويقارن البيانات ببيانات المرضى الذين تم تسلسلهم سابقًا ، في محاولة للعثور على بعض الأنماط الشائعة.

هناك بعض الحقائق الجينية حول المرض التي يعرفها العلماء بالفعل ، على سبيل المثال ، يأتي في نسختين مختلفتين. نسخة واحدة ناتجة عن طفرة في العديد من الجينات ذات الأسماء المشفرة CYBA ، NCF1 ، NCF2، و NCF4، ويسمى CGD. يتم تشغيل الآخر بواسطة جين له نفس الاسم المشفر CYBB، والذي يتواجد على الكروموسوم X ، ومن هنا جاء اسم XCGD. يؤثر هذا الإصدار في المقام الأول على الأولاد لأن لديهم كروموسوم X و Y ، في حين أن الفتيات لديهن اثنان Xs ولديهن فرص أقل للإصابة بالمرض. ومع ذلك ، يمكن للفتيات أن يحملن المرض ، وهن يعانين منه أيضًا ، ولكن بشكل أكثر اعتدالًا من الطفح الجلدي والالتهابات ، والتي غالبًا ما تزداد سوءًا مع تقدم العمر. يصاب الأولاد بـ XCGD الأكثر خطورة والذي قد يهدد حياتهم ، والذي يرثونه من أمهاتهم. يقول Jongco: "لماذا وضعت الطبيعة الأم مثل هذا الجين المهم على كروموسوم X الذي من المحتمل ألا نعرفه أبدًا".

أدى تقلب المرض العلماء إلى الاعتقاد أنه في حين أن CYBB قد يكون الجين هو الجاني الرئيسي لـ XCGD ، وله أيضًا شركاء - جينات أخرى تلعب دورًا. أدرك علماء الوراثة تدريجيًا أن الجينات غالبًا ما تعمل جنبًا إلى جنب مع بعضها البعض ، لذا فإن العثور على مثل هذه الترادفات يمكن أن يوفر رؤى قيمة. يقول جيليس: "على مدى السنوات القليلة الماضية ، كان هناك فهم متزايد بأن وظيفة الجينات غالبًا ما تعتمد على السياق ، مع توفير جزء كبير من هذا السياق من خلال أنشطة الجينات الأخرى". يركز مختبره على إيجاد هذه الأنماط المشتركة وتوضيح كيفية تغييرها لعمل الخلايا.

يمكن لخوارزميات جيليس تحليل جزيئات الحمض النووي الريبي في الخلية ، والتي تلعب دورًا أساسيًا في قراءة المعلومات من الجينات وتجميع البروتينات من هذه التعليمات في هذه الحالة ، وهي بروتينات حيوية لقتل الجراثيم للعدلات. يمكن أن تؤدي مواطن الخلل في عمل الرنا إلى تجميع البروتينات بشكل غير صحيح ، مما يؤثر على قدرة العدلات على اقتلاع الجراثيم من خلال انفجارها المؤكسد. في أي نقطة بالضبط في خط التجميع هذا تحدث مثل هذه الثغرات ، تحدث فرقًا أيضًا. إذا خرجت البروتينات شبه كاملة ، فقد تتمكن العدلات من أداء وظيفتها بشكل شبه لائق ، مما يؤدي إلى أعراض أكثر اعتدالًا. خلاف ذلك ، قد يظهر عليهم نقص شديد وسيكون المرض أكثر قسوة. حتى في الأماكن التي تقع فيها الطفرة الجينية مهمة. إذا وقعت طفرة في الجزء الأقل خطورة من الجين ، فسيكون المرض أقل حدة ، لذلك قد يحتاج هؤلاء المرضى إلى أدوية أقل أو جرعات أصغر.

يقول جيليس إن فهم كيفية ظهور مثل هذه التفاصيل الدقيقة في تنوع المرض يمكن أن يستغرق سنوات من عمل علماء المختبرات الرطبة. سيتعين عليهم صنع الفئران بطفرات جينية مختلفة ومعرفة كيفية تأثيرها على شدة المرض والعلاجات التي يستجيبون لها. وإذا أرادوا معرفة الجينات "الترادفية" التي تساهم ، فسيتعين عليهم تجربة عدد لا يحصى من التوليفات بشكل أعمى. في عالم البيولوجيا الحسابية ، يمكن لخوارزمية تحليل تلك البيانات في أيام. يقول جيليس عن مختبره: "يجب أن نطرح يوميًا أسئلة نبني على بعضها البعض بالتتابع". "على عكس المختبر الرطب حيث يطرحون سؤالًا واحدًا كل ستة أشهر."

حتى الآن ، تمكن الباحثون عن الجينات عبر الإنترنت من تسلسل حوالي 10 مرضى فقط ، جنبًا إلى جنب مع أمهاتهم وأخواتهم - جزئيًا لأن المرض نادر وجزئيًا لأن الوباء أبطأ كل شيء. هذا ليس كافيا بعد لاستخلاص أي استنتاجات نهائية. ولكن مع وصول المزيد من المرضى ، ستنمو مجموعة البيانات وستكون الخوارزميات قادرة على استنباط بعض أنماط سرد الحكايات ، والتي ستسمح لـ Jongco بمعالجة مرضاه بدقة أفضل. يقول جونغكو: "إذا استطاع جيسي التوصل إلى ملف جيني للأشخاص الذين سيكونون أكثر عرضة للإصابة بالمناعة الذاتية ، فقد لا نحتاج إلى معالجتهم من أجل ذلك". يمكن أن تساعد البيولوجيا الكمية أيضًا Jongco في تصميم علاج من شأنه إحياء قدرات المرضى على إنزال الجراثيم. يقول جيليس: "نأمل أن يساعد نهجنا في تحديد مثل هذه السمات الجينية". "ويمكن أن يساعد ذلك حقًا في تحسين نوعية حياة المرضى."

ليلا نارجي صحفية مخضرمة تغطي مجالات العلوم والاستدامة وسياسة الغذاء والزراعة لمنافذ مثل The الجارديان ، واشنطن بوست ، هاكاي ، ذا كاونتر ، جستور ديلي ، و إنسيا. ابحث عنها في lelanargi.com.

الصورة الرئيسية: ymgerman / Shutterstock

تم نشر هذه المقالة في الأصل على قناة Biology + Beyond الخاصة بنا في يونيو 2021.


شارلوت أمير ولورا شايدل: ساهم هذان المؤلفان بالتساوي في هذا العمل.

الانتماءات

CytoMorpho Lab، Biosciences & amp Biotechnology Institute of Grenoble، UMR5168، CEA / INRA / CNRS / Université Grenoble-Alpes، 38054 Grenoble، France

شارلوت أمير ولورا شايدل وجيريمي جيلارد ولوران بلانشوين وأمبير مانويل تيري

Laboratoire Interdisciplinaire de Physique، CNRS / Université Grenoble-Alpes، 38402 Saint-Martin-d’Hères، France

CytoMorpho Lab، Hopital Saint Louis، Institut Universitaire d’Hematologie، UMRS1160، INSERM / Université Paris Diderot، 75010 Paris، France

لوران بلانشوين وأمبير مانويل تيري

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

أ. إجراء تجارب في الخلايا. إل. و ج. أجرى التجارب في المختبر. رطل. و م. يوجه العمل. CA ، L.S. ، K.J. ، L.B. و م. حلل البيانات. م. كتب الورقة.

المؤلفون المراسلون


المواد والأساليب

كانت المواد الكيميائية والكواشف من Fisher Scientific (Pittsburgh ، PA) و Sigma-Aldrich (سانت لويس ، MO) ، ما لم يُنص على خلاف ذلك.

تنقية توبولين

تمت تنقية Tubulin كما هو موصوف سابقًا (Waterman-Storer ، 1998). لفترة وجيزة ، تم عزل أنسجة دماغ الخنازير وتنظيفها وتجانسها باستخدام خلاط من الفولاذ المقاوم للصدأ. تم توضيح الملاط المتجانس بواسطة تنبيذ فائق عند 100000 × ز لمدة 1 ساعة. تمت تنقية heterodimers التيوبولين بواسطة الأنابيب الدقيقة لبروتوكول الدورة المزدوجة المتميز جيدًا وتم تجميعها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم تم جمع الحبيبات بعد الطرد المركزي. تمت إزالة بلمرة الحبيبات الدقيقة المجمعة على الجليد لمدة ساعة واحدة وبعد ذلك تم جمع المادة الطافية الموضحة بعد عملية طرد مركزي أخرى. تم تنفيذ هذه العملية مرتين. تمت تنقية البروتين مزدوج الدورة بشكل أكبر عن طريق كروماتوجرافيا سائلة باستخدام عمود تبادل الأنيون الفسفوسليلوز الذي تم تحضيره كما هو موصوف سابقًا (Waterman-Storer ، 1998). أكدنا نشاط البروتين المنقى لدينا من خلال شراء التوبولين المتاح تجاريًا (الهيكل الخلوي ، دنفر ، CO Cat: T238P) واختباره في نفس الظروف.

فحوصات ديناميات الأنابيب الدقيقة في المختبر

استندت فحوصات قياس ديناميكيات الأنابيب الدقيقة بواسطة الفحص المجهري TIRF إلى الطرق الموصوفة سابقًا (Gell وآخرون.، 2010 الرسوم ومور ، 2018). تم تجميع بذور الأنابيب الدقيقة مزدوجة الدورة عن طريق احتضان 20 ميكرومتر من الرودامين توبولين (الهيكل الخلوي ، دنفر ، أول أكسيد الكربون) في محلول BRB80 (80 ملي مولار من الأنابيب تصل إلى الرقم الهيدروجيني 6.9 مع KOH ، 1 ملي مولار إيثيلين جلايكول حمض رباعي الخليك [EGTA] ، 1 ملي مولار MgCl2 تم إجراء تعديلات طفيفة على الأس الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم) باستخدام 1 ملي مولار من GMPCPP عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تم بعد ذلك طرد العينة عند 100000 × ز لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية وتمت إزالة المادة الطافية. تم تعليق الحبيبات في 0.8 × حجم بدء من المخزن المؤقت BRB80 المثلج لإزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة. تمت إضافة 1 ملي GMPCPP إضافي وتم بلمرة الأنابيب الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم تكويرها مرة أخرى. تم تعليق الحبيبات في 0.8 × حجم البداية دافئ BRB80. تم بعد ذلك ماصة التفاعل بلطف 8-10 مرات لقص الأنابيب الدقيقة ، وتقسيمها إلى أحجام 1 ميكرولتر ، وإما استخدامها على الفور أو تجميدها المفاجئ وتخزينها عند -80 درجة مئوية.

تم تجميع غرف التصوير باستخدام أغطية 22 × 22 مم و 18 × 18 مم. تم تنظيف الأغطية وصقلها كما هو موضح سابقًا (Gell وآخرون.، 2010 الرسوم ومور ، 2018). تم تخزين الأغطية الزجاجية المحضرة في مجففات في درجة حرارة الغرفة حتى استخدامها. تم تركيب الأغطية في إدراج مرحلة ملفقة ومختومة بشرائط ذائبة من parafilm. تم لصق بذور الأنابيب الدقيقة المستقرة GMPCPP على ساترة باستخدام الأجسام المضادة المضادة للرودامين (Fisher Scientific Cat # A-6397 المخفف 1:50 في BRB80). تم شطف الغرف باستخدام 1 ٪ pluronic-F127 في BRB80 لمنع البروتينات الأخرى من الالتصاق بالزجاج ومعايرتها باستخدام محلول كاسح الأكسجين (40 ملي مولار من الجلوكوز ، 1 ملي ترولوكس ، 64 نانومتر كاتلاز ، 250 نانومتر أوكسيديز الجلوكوز ، 10 مجم / مل من الكازين ) قبل إضافة توبولين الحرة. يتكون المخزن المؤقت للتصوير من توبولين غير مبلمر (15-20٪ HiLyte 488 - توبولين [الهيكل الخلوي] و 80-85٪ توبولين دماغ الخنازير غير المسمى) ، 5 ملي مولار MgCl2، 1 ملي مولار GTP ، المخزن المؤقت لكسح الأكسجين ، وحجم BRB80-50 ميكرولتر تم بعد ذلك تدفقها إلى غرف التصوير. تم إغلاق الغرفة باستخدام VALAP (فازلين 1: 1: 1 ، لانولين ، شمع البارافين) وتم تسخينها إلى 37 درجة مئوية باستخدام حاضنة مرحلة تدفق الهواء ASI400 (نيفتيك ، ويليامزفيل ، فيرجينيا) لمدة 5 دقائق قبل التصوير. تم التحقق من درجة الحرارة باستخدام مقياس حرارة الأشعة تحت الحمراء.

لتجارب اختبار تأثير الكالسيوم على نشاط الإنقاذ ، 10 ميكرومتر من CaCl2 تمت إضافته إلى المخزن المؤقت للتصوير قبل تجميع الغرفة. استخدمنا MaxChelator (maxchelator.stanford.edu) لتقدير تركيز الكالسيوم الحر في هذه التفاعلات باستخدام القيم النظرية للتركيزات الأيونية والمخلب ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة. في الظروف القياسية بالإضافة إلى الكالسيوم (5 ملي MgCl2، 10 ميكرومتر CaCl2، 1 ملي مولار EGTA ، و 1 ملي مولار GTP عند الأس الهيدروجيني 6.9 و 37 درجة مئوية) يقدر أن أكثر من 99.9 ٪ من الكالسيوم 2+ مرتبط بـ EGTA.

تم جمع الصور على مجهر نيكون Ti-E المجهز بهدف 1.49 NA 100 × CFI160 Apochromat ، وإضاءة TIRF ، و OBIS 488-nm والياقوت 561 نانومتر ليزر (Coherent ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا) ، و ORCA-Flash 4.0 LT كاميرا sCMOS (Hamamatsu Photonics ، اليابان) ، باستخدام برنامج NIS Elements (نيكون ، ميناتو ، طوكيو ، اليابان). تم الحصول على الصور باستخدام TIRF ثنائي القناة ، أحادي المستوى ، بفواصل زمنية واحدة.

تحليل الصور

تم تحليل الصور باستخدام برنامج MATLAB حسب الطلب كما هو موضح سابقًا (Fees and Moore ، 2018). باختصار ، تم التعرف على البذور من خلال كثافة صورة العتبة واستخدامها لتقسيم الصور على طول محور الأنبوب الدقيق. تم بعد ذلك اقتصاص الصور تلقائيًا إلى 4 بكسل أعلى وأسفل محور الأنبوب الدقيق ، ثم تم تكديس الحد الأقصى لإسقاط الشدة لكل نقطة زمنية لإنشاء مخططات kymograph للتحليل.

تم حساب معدلات البلمرة وإزالة البلمرة عن طريق قياس التغيرات في طول الأنابيب الدقيقة والوقت من النقطتين الأولى والأخيرة لأحداث البلمرة الفردية وإزالة البلمرة من أجهزة التصوير. قدرت ثوابت معدل البلمرة على أنها انحدار النموذج الخطي لمعدل البلمرة. تم تحديد ثوابت معدل إزالة البلمرة بشكل مشابه ولكن باستخدام متوسط ​​معدل إزالة البلمرة (m * min −1) من جميع تراكيز التوبولين المجمعة.

تم حساب ترددات الإنقاذ والكوارث على أنها حاصل قسمة عدد التحولات ومدة إزالة البلمرة أو البلمرة ، على التوالي. تم تحديد وفرة الإنقاذ بقسمة عدد أحداث الإنقاذ الفريدة على الطول الإجمالي المفقود أثناء إزالة البلمرة. تم تعريف أحداث الإنقاذ الفريدة على أنها مواقع إنقاذ مفصولة بما لا يقل عن 200 نانومتر عن مواقع الإنقاذ السابقة على شبكة الأنابيب الدقيقة. تم حساب موضع الإنقاذ بالنسبة للطرف الموجب على أنه الفرق بين طول الأنابيب الدقيقة عند وقوع الكارثة والطول عند الإنقاذ.

تجارب غسيل Tubulin

بالنسبة لتجارب الغسل ، تم تجميع غرف التصوير ذات البذور GMPCPP بالمثل ، ولكن لم يتم إغلاقها باستخدام VALAP. تم تسخين غرف التصوير على المسرح لمدة 3-5 دقائق ، مما سمح لدرجة الحرارة بالتوازن إلى 37 درجة مئوية ، ثم تم تصوير الأنابيب الدقيقة الديناميكية لمدة 10 دقائق قبل مسح غرفة التصوير بـ 4-5 × أحجام حجرة من محلول التفاعل الدافئ. تم إيقاف الحصول على الصور مؤقتًا أثناء تدفق الغرفة واستؤنف على الفور بعد ذلك. كان متوسط ​​مدة الغسيل لجميع تجارب الغسل ∼60 ثانية من وقت التوقف المؤقت للاكتساب إلى الاستئناف.

تمت معالجة الصور كما هو موضح أعلاه ، مع إضافة تثبيت الصورة بعد الاستحواذ الذي تم استخدامه لتقليل الطفيفة س ص الانجراف أثناء الحصول على الصورة باستخدام المكون الإضافي لمثبت الصور لـ ImageJ (Li ، 2008).

تحديد تركيز التوبولين

لكل تجربة ، تم تحديد تركيز التوبولين عن طريق تشغيل عينة من المخزن المؤقت للتصوير المحتوي على توبولين غير مبلمر على هلام 10٪ bis-Tris SDS-PAGE ، متبوعًا بالتلوين باستخدام Coomassie blue. تم تحديد التركيز عن طريق قياس الكثافة ، مقارنة مباشرة بالمنحنى القياسي المصنوع من معايير الألبومين في مصل الأبقار التي تعمل على نفس الهلام.

محاكاة مونت كارلو

تمت محاكاة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة باستخدام برنامج MATLAB حسب الطلب. تم تصميم الأنابيب الدقيقة على شكل خيوط خطية فردية مُنواة من "بذرة" واحدة تنمو وتتقلص وفقًا للملاحظات التجريبية. ناتج محاكاة نماذج التغييرات في طول الأنابيب الدقيقة بمرور الوقت. تمت معايرة الوقت إلى 1 ثانية لهذه المحاكاة. تم تحديد تغييرات الطول المحاكاة بأخذ عينات عشوائية محصورة لمعدلات البلمرة وإزالة البلمرة عند الترددات الملاحظة تجريبياً. تم تعريف الحدين العلوي والسفلي لهذه المعدلات على أنهما الحد الأقصى والدنيا للمعدلات الملاحظة تجريبياً ، على التوالي. تم تطبيق ترددات انتقال الأنابيب الدقيقة بشكل مشابه. أخذت عينات المحاكاة مجموعة من تركيزات توبولين (5-8 ميكرومتر) لتكون متوافقة مع البيانات التجريبية.

تمت محاكاة عمليات الإنقاذ عشوائياً واختلفت قليلاً بين النموذجين. بالنسبة للنموذج النهائي ، تم تقييد أحداث الإنقاذ بشكل عشوائي فقط أثناء إزالة البلمرة بتردد يتوافق مع تردد الإنقاذ المرصود تجريبياً. بالنسبة للنموذج المدفوع بالشبكة ، تمت محاكاة عمليات الإنقاذ كمواقع مدمجة في الأنابيب الدقيقة المتنامية بتردد مشتق تجريبيًا. بعد وقوع كارثة ، تم تشغيل حدث إنقاذ عندما اقتربت نهاية إزالة البلمرة من موقع التأسيس في غضون 100 نانومتر. من أجل التبسيط ، قمنا بتصميم مواقع الإنقاذ بحيث ينتج عنها حدث إنقاذ واحد فقط لكل موقع بمجرد دمجها في الشبكة. تم تحليل أطوال الأنابيب الدقيقة المحاكاة كبيانات تجريبية.


تم النشر بواسطة الجمعية الملكية بموجب شروط رخصة المشاع الإبداعي http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ، والتي تسمح بالاستخدام غير المقيد ، بشرط ذكر المؤلف الأصلي والمصدر.

مراجع

. 2016 تورط الكبد في اضطرابات التمثيل الغذائي وأمراض القلب والأوعية الدموية. BBA كلين. 5، 108-113. (دوى: 10.1016 / j.bbacli.2016.03.002) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2013 دور الكبد في التمثيل الغذائي. نات. القس Endocrinol. 9، 144-152. (دوى: 10.1038 / nrendo.2012.258) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2006 الخلايا الكبدية الفأرية الأولية لمقاربات بيولوجيا الأنظمة: موحدة في المختبر نظام لنمذجة مسارات تحويل الإشارة. النظام. بيول. (ستيفيناج) 153، 433-447. (دوى: 10.1049 / ip-syb: 20050067) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

. 2013 الثقافة طويلة الأمد والزراعة المشتركة للجرذان الأولية وخلايا الكبد البشرية. طرق مول. بيول. 945، 287-302. (دوى: 10.1007 / 978-1-62703-125-7_17) كروسريف ، PubMed ، الباحث العلمي من Google

كاستل جي في ، جوفر آر ، مارتينيز جيمينيز سي بي ، جوميز ليشون إم جي

. 2006 خطوط خلايا خلايا الكبد: استخدامها ونطاقها وقيودها في دراسات استقلاب الدواء. رأي الخبراء. ميتاب المخدرات. توكسيكول. 2، 183-212. (دوى: 10.1517 / 17425255.2.2.183) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 2016 MiR-1271 الذي يتم تنظيمه بواسطة بالميتات الأحماض الدهنية المشبعة يثير ضعف إشارات الأنسولين عن طريق قمع تعبير INSR و IRS-1 في خلايا HepG2. بيوتشيم. بيوفيز. الدقة. كومون. 478، 1786-1791. (دوى: 10.1016 / j.bbrc.2016.09.029) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

نولز بي بي ، هاو سي سي ، عدن دي بي

. 1980 تفرز خطوط خلايا سرطان الخلايا الكبدية البشرية بروتينات البلازما الرئيسية ومستضد سطح التهاب الكبد B. علم 209، 497-499. (دوى: 10.1126 / العلوم .6248960) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2013 تحليلات على مستوى البروتين لخلايا الكبد البشرية أثناء التمايز وعدم التمايز. أمراض الكبد 58، 799-809. (دوى: 10.1002 / hep.26414) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

جونيور ويسنيوسكي ، Vildhede A ، نورين A ، Artursson P

. 2016 التحليل الكمي المتعمق والمقارنة بين بروتينات HepG2 لخلايا الكبد البشرية وخط خلايا الورم الكبدي. J. البروتيوميات 136، 234-247. (دوى: 10.1016 / j.jprot.2016.01.016) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

. 1994 إنشاء وتوصيف خطوط الخلايا الكبدية المتمايزة وغير المحولة المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا لتحويل عامل النمو ألفا. بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 91، 674-678. (دوى: 10.1073 / pnas.91.2.674) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Hsiao PJ، Chiou HC، Jiang HJ، Lee MY، Hsieh TJ، Kuo KK

. 2017 بيوجليتازون يعزز تحلل الدهون الخلوي وأكسدة بيتا والالتهام الذاتي لتحسين التنكس الدهني الكبدي. علوم. اعادة عد. 7، 9030. (دوى: 10.1038 / s41598-017-09702-3) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Li J ، Liu G ، Zhang F ، Zhang Z ، Xu Y ، Li Q

. 2017 دور البروتين السكري 78 و cidec في التنكس الدهني الكبدي. مول. ميد. اعادة عد. 16، 1871-1877. (دوى: 10.3892 / mmr.2017.6834) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2016 أسيتيل وحدة ألفا البروتينية ثلاثية الوظائف للميتوكوندريا يعزز ثباتها لتعزيز أكسدة الأحماض الدهنية وينخفض ​​في مرض الكبد الدهني غير الكحولي. مول. زنزانة. بيول. 36، 2553-2567. (دوى: 10.1128 / MCB.00227-16) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Su SL ، Liu X ، Liu J ، Peng F ، Fang C ، Li B

. 2017 miR-494 ينظم مسار PI3 K / Akt من خلال استهداف PTEN ويخفف من إصابة نقص التروية الكبدي / إعادة التروية في نموذج الفئران. بيوسكي. اعادة عد. 37، BSR20170798. (دوى: 10.1042 / bsr20170798) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

ياو دبليو ، لي إتش ، هان إكس ، تشن سي ، زانغ واي ، تاي WL ، شيا زد ، هيي زد

. يقلل MG53 2017 المثبت بواسطة dysferlin إلى غشاء الخلية موت الخلايا المبرمج الذي يسببه نقص التروية / إصابة إعادة التروية في الجسم الحي و في المختبر . J. الخلية. مول. ميد. 21، 2503-2513. (دوى: 10.1111 / jcmm.13171) كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

Tao GZ، Lehwald N، Jang KY، Baek J، Xu B، Omary MB، Sylvester KG

. تحمي إشارات Wnt / beta-catenin 2013 كبد الفأر من موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإجهاد التأكسدي من خلال تثبيط عامل نسخ رأس الشوكة FoxO3. J. بيول. تشيم. 288، 17214-17 224. (دوى: 10.1074 / jbc.M112.445965) كروسريف ، آي إس آي ، الباحث العلمي من Google

1993 Simian virus 40 large tumor antigen-immortalized normal human liver epithelial cells express hepatocyte characteristics and metabolize chemical carcinogens . بروك. ناتل أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية 90, 5123-5127. (doi:10.1073/pnas.90.11.5123) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Huang BP, Lin CS, Wang CJ, Kao SH

. 2017 Upregulation of heat shock protein 70 and the differential protein expression induced by tumor necrosis factor-alpha enhances migration and inhibits apoptosis of hepatocellular carcinoma cell HepG2 . كثافة العمليات جيه ميد. علوم. 14, 284-293. (doi:10.7150/ijms.17861) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Ip BC, Hu KQ, Liu C, Smith DE, Obin MS, Ausman LM, Wang XD

. 2013 Lycopene metabolite, apo-10'-lycopenoic acid, inhibits diethylnitrosamine-initiated, high fat diet-promoted hepatic inflammation and tumorigenesis in mice . Cancer Prev. الدقة. (Phila ) 6, 1304-1316. (doi:10.1158/1940-6207.CAPR-13-0178) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Latorre P, Varona L, Burgos C, Carrodeguas JA, Lopez-Buesa P

. 2017 O-GlcNAcylation mediates the control of cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase activity via Pgc1alpha . بلوس واحد 12, e0179988. كروسريف ، PubMed ، ISI ، الباحث العلمي من Google

2013 MicroRNA 33 regulates glucose metabolism . مول. زنزانة. بيول. 33, 2891-2902. (doi:10.1128/MCB.00016-13) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2016 Heme-regulated eIF2alpha kinase modulates hepatic FGF21 and is activated by PPARbeta/delta deficiency . داء السكري 65, 3185-3199. (doi:10.2337/db16-0155) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Georgiadi A, Lichtenstein L, Degenhardt T, Boekschoten MV, van Bilsen M, Desvergne B, Muller M, Kersten S

. 2010 Induction of cardiac Angptl4 by dietary fatty acids is mediated by peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta and protects against fatty acid-induced oxidative stress . سيرك. الدقة. 106, 1712-1721. (doi:10.1161/CIRCRESAHA.110.217380) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2017 Angiopoietin-like protein 4 is an exercise-induced hepatokine in humans, regulated by glucagon and cAMP . مول. متعب. 6, 1286-1295. (doi:10.1016/j.molmet.2017.06.018) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Ramboer E, De Craene B, De Kock J, Vanhaecke T, Berx G, Rogiers V, Vinken M

. 2014 Strategies for immortalization of primary hepatocytes . J. هيباتول. 61, 925-943. (doi:10.1016/j.jhep.2014.05.046) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2008 Consequences of lipid droplet coat protein downregulation in liver cells . داء السكري 57, 2037-2045. (doi:10.2337/db07-1383) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 Insulin resistance induces posttranslational hepatic sortilin 1 degradation in mice . J. بيول. تشيم. 290, 11 526-11 536. (doi:10.1074/jbc.M115.641225) Crossref, ISI, Google Scholar

Chen W, Goff MR, Kuang H, Chen G

. 2015 Higher protein kinase C zeta in fatty rat liver and its effect on insulin actions in primary hepatocytes . بلوس واحد 10, e0121890. PubMed و ISI و Google Scholar

Magnusson I, Rothman DL, Katz LD, Shulman RG, Shulman GI

. 1992 Increased rate of gluconeogenesis in type II diabetes mellitus. A 13C nuclear magnetic resonance study . J. كلين. استثمار. 90, 1323-1327. (doi:10.1172/JCI115997) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

ter Horst KW, Gilijamse PW, Ackermans MT, Soeters MR, Nieuwdorp M, Romijn JA, Serlie MJ

. 2016 Impaired insulin action in the liver, but not in adipose tissue or muscle, is a distinct metabolic feature of impaired fasting glucose in obese humans . الأيض 65, 757-763. (doi:10.1016/j.metabol.2016.02.010) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chen CC, Lee TY, Kwok CF, Hsu YP, Shih KC, Lin YJ, Ho LT

. 2016 Cannabinoid receptor type 1 mediates high-fat diet-induced insulin resistance by increasing forkhead box O1 activity in a mouse model of obesity . كثافة العمليات جيه مول. ميد. 37, 743-754. (doi:10.3892/ijmm.2016.2475) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Rakhshandehroo M, Hooiveld G, Muller M, Kersten S

. 2009 Comparative analysis of gene regulation by the transcription factor PPARalpha between mouse and human . بلوس واحد 4, e6796. (doi:10.1371/journal.pone.0006796) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2004 The direct peroxisome proliferator-activated receptor target fasting-induced adipose factor (FIAF/PGAR/ANGPTL4) is present in blood plasma as a truncated protein that is increased by fenofibrate treatment . J. بيول. تشيم. 279, 34 411-34 420. (doi:10.1074/jbc.M403058200) Crossref, ISI, Google Scholar

Kersten S, Lichtenstein L, Steenbergen E, Mudde K, Hendriks HF, Hesselink MK, Schrauwen P, Muller M

. 2009 Caloric restriction and exercise increase plasma ANGPTL4 levels in humans via elevated free fatty acids . Arterioscler. Thromb. فاسك. بيول. 29, 969-974. (doi:10.1161/ATVBAHA.108.182147) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Vanden Heuvel JP, Kreder D, Belda B, Hannon DB, Nugent CA, Burns KA, Taylor MJ

. 2003 Comprehensive analysis of gene expression in rat and human hepatoma cells exposed to the peroxisome proliferator WY14,643 . توكسيكول. تطبيق فارماكول. 188, 185-198. (doi:10.1016/S0041-008X(03)00015-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2015 ANGPTL4 mediates shuttling of lipid fuel to brown adipose tissue during sustained cold exposure . إليفي 4, e08428. (doi:10.7554/elife.08428) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar


Box 2: Exploiting viruses in mouse genetics

The first transgenic mice were generated by infecting embryos with viruses [97], and today viral vectors remain an integral part of the mouse genetics toolkit. Lentiviruses integrate their genome into the host's DNA, making them an effective transgene delivery vector. The lentiviral genome, derived from immunodeficiency viruses, has been deconstructed and distributed across multiple plasmids to minimize the potential formation of replication-competent viruses [98]. A transgene of interest may be included in a plasmid containing a viral packaging signal. This is co-transfected into a cell line (typically human embryonic kidney HEK293T cells) with other plasmids expressing proteins required for viral production, such as envelope proteins. Viruses produced in this way can be introduced into oocytes for transgenesis (reviewed in [99]). In its simplest form, this method necessitates only a few weeks between target selection and phenotypic analysis, offering a distinct advantage over other approaches. To enable pooled loss-of-function screens to identify complex genetic interactions, lentiviral short hairpin RNA (shRNA) libraries targeting most mouse genes have been generated [27]. Some groups have recently used ultrasound-guided microinjections of lentiviruses to deliver genes to organs and tissues of early mammalian embryos في الرحم [100].

Slow transforming retroviruses have been widely used to generate mouse models of cancer [101]. They can re-infect the same cell, randomly inserting their genome into the host DNA multiple times, resulting in an accumulation of mutations. This process of progressive mutagenesis recapitulates the multi-step progression of human tumorigenesis (reviewed in [102]). The development of next-generation sequencing technologies has dramatically enhanced the process of identifying retroviral insertion sites, and databases, such as the Retroviral Tagged Cancer Gene Database, have been developed to map insertion sites to the reference genome [103].


A-T AND THE ATM GENE

A-T is a rare disease characterized by a loss of motor control (ataxia), dilated blood vessels in the eyes and facial area (telangiectasia), and an assortment of other problems, including immunodeficiency leading to recurrent pulmonary and sinus infections and a predisposition to cancer. A-T patients are not mentally impaired and can lead productive lives, although they often require assistance and usually become wheelchair bound at an early age. Although some have survived into their 40s and 50s, most A-T patients die at an earlier age from respiratory failure or cancer. In addition, heterozygous carriers of an A-T mutation (∼1% of the general population) are three to five times more susceptible to cancer than are noncarriers ( Swift et al., 1991).

The gene responsible for A-T, called Ataxia Telangiectasia Mutated (ماكينة الصراف الآلي), encodes a large protein with a phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–like domain at the C terminus (reviewed by Rotman and Shiloh, 1998). PI3K-related proteins make up a large family of Ser-Thr protein kinases, numerous members of which are involved in the regulation of cell cycle progression, responses to DNA damage, and the maintenance of genomic stability ( Hoekstra, 1997). Mammalian ATM has been found to play critical roles in cellular responses to ionizing radiation (IR) and in normal cell cycle progression and meiosis ( Xu and Baltimore, 1996 Rotman and Shiloh, 1998). More specifically, it is believed to function in the response to DNA double-strand breaks that occur as a result of IR and also during normal cellular processes (reviewed by Rotman and Shiloh, 1998).

For example, immunodeficiency in A-T patients is believed to be related to an essential role of ATM in V(D)J recombination that is essential for normal lymphocyte development. (Genes that encode antigen receptor variable regions are not inherited intact but are assembled from different germline DNA segments via V(D)J recombination during the early stages of lymphocyte differentiation.) ATM deficiency in mammals also results in severe meiotic disruption and sterility ( Barlow et al., 1998) and is believed to be involved in the repair of DNA breaks that occur normally during meiotic recombination ( Rotman and Shiloh, 1998). ATM also is active in the response to DNA damage induced by IR. In mammalian cells, ATM-mediated responses to DNA damage induced by IR include the activation of cell cycle checkpoints, DNA repair, and apoptosis ( Rotman and Shiloh, 1998).

Garcia et al. (2000)identified a homolog of ماكينة الصراف الآلي in Arabidopsis, AtATM, which is present in a single copy on the short arm of chromosome 3. The gene contains 79 exons, which is the largest number of exons in the Arabidopsis genome. The AtATM protein has 3856 amino acid residues and is more similar to mammalian ATM than to various other PI3K-related proteins. في هذا العدد من The Plant Cell, Garcia et al. (pages 119–132) describe the isolation and characterization of two T-DNA insertion mutants of AtATM in Arabidopsis and show that AtATM plays an essential role in meiosis and in the somatic response to DNA damage in plants, similar to the function of ATM in mammals and other eukaryotes.

Garcia et al. (2003)analyzed two independent T-DNA insertion mutants of AtATM. ال atm-1 mutant, in the Wassilewskija background, contains a T-DNA insertion in exon 78. A second mutant, atm-2, was isolated in the Columbia background and contains a complex insertion in intron 64 that includes the insertion of filler DNA from other regions of the genome on both sides of the T-DNA and a truncated right border. Both mutants exhibit similar phenotypic characteristics that are consistent with a dual role for the ATM protein in the DNA damage response pathway and in the regulation of meiosis.


Cannabinoids and Their Receptors

Morag R. Hunter , . Michelle Glass , in Methods in Enzymology , 2017

3 Design and Validation of V8-CAMYEL

While CAMYEL ( Jiang et al., 2007 ) is excellent for use in large samples of easily transfectable cell lines , there are various experimental designs which would benefit from a biosensor with an increased bioluminescent output. Experiments on very small populations of cells, for example, are technically challenging because there can be too few photons released from the biosensor per well to be efficiently detected by standard plate readers. In order to increase the bioluminescent output and increase stability in mammalian cytoplasm, the luciferase in CAMYEL was changed to the mutant Rluc8 ( Loening, Fenn, Wu, & Gambhir, 2006 ) and the fluorescent acceptor was changed to Venus ( Nagai et al., 2002 ). This pairing was predicted to increase the quantum yield of the biosensor. The new biosensor was called “V8-CAMYEL” (pcDNA3L-His-V8-CAMYEL) and can be obtained from the corresponding author of this chapter. The modifications in V8-CAMYEL have allowed the measurement of biosensor activity from much smaller samples of cells in a conventional plate reader.

3.1 Validation of V8-CAMYEL

In order to validate V8-CAMYEL, it was tested alongside the original CAMYEL biosensor. These assays were designed to verify that modifications to the BRET pair did not alter the responsiveness of the biosensor to changes in cytoplasmic cAMP in mammalian cells. First, the biosensors were compared in their responsiveness to forskolin, an adenylate cyclase agonist, which directly modifies the production of cAMP. Then the biosensors were assayed for responsiveness to an endogenously expressed Gαs-coupled GPCR (PAC1, agonist: PACAP) and a stably transfected Gαi-coupled GPCR (CB1, agonist: CP55,940).

To determine that the V8-CAMYEL biosensor acted equivalently to the original CAMYEL construct, cAMP assays were performed using both biosensors. The HEK 3HA-hCB1 cell line was transiently transfected with either the CAMYEL or V8-CAMYEL construct and assayed as per the protocol for adherent cells described earlier.

The results of these assays are shown in Fig. 2 . As predicted, V8-CAMYEL had much higher light emissions in both the 460/25 nm and 535/25 nm channels, on average a 2.5-fold increase when transiently transfected ( Fig. 2 A). AUC measurements were taken across 20 min and used to generate concentration–response curves for forskolin and CP55,940. In the case of PACAP, data were collected 5 min after agonist addition for 15 min. V8-CAMYEL showed equivalent sensitivity to these agonist-induced cAMP changes compared to the original CAMYEL biosensor.

The overall range of inverse BRET ratios measured is reduced in V8-CAMYEL compared to the parental construct, as shown in Fig. 2 E and F. This indicates that, ratiometrically, Venus emissions in V8-CAMYEL are higher relative to luciferase than in the original construct, thus making the inverse BRET ratio lower. This is not entirely surprising, as the increased quantum yield of Rluc8 ( Loening et al., 2006 ) may increase the energy transfer to Venus. There is also likely to be a higher proportion of functional Venus fluorophore in V8-CAMYEL, as this acceptor protein matures faster than other YFP derivatives ( Nagai et al., 2002 ). However, when drug responses are normalized to an internal control (e.g., 5 μم forskolin), V8-CAMYEL shows an improved signal-to-noise ratio, approximately 1.78 ± 0.03-fold higher than the original CAMYEL biosensor across the dynamic range.

Overall, V8-CAMYEL was found to perform equivalently to the original CAMYEL biosensor, but with the considerable advantage of increased total luminescence. This allows us to obtain a useable biosensor signal from extremely small samples of cells, using a standard luminescence plate reader.

3.1.1 Stable Cell Lines

Stable cells lines expressing V8-CAMYEL can be used to streamline experimental workflow. In this example, HEK293 FlpIn cells (Invitrogen, CA, USA) were stably transfected with CAMYEL or V8-CAMYEL using the standard, random-integration transfection method, in order to allow the FlpIn site to be used for future transfection. After selection, both cell lines contained very similar levels of biosensor expression. Here, we show example data from these cell lines assayed in the suspension assay format described above, using 384-well microtiter plates.

Fig. 3 shows that a stable cell line expressing V8-CAMYEL maintains a useable window for measuring cAMP signaling, even when diluted to very low cell numbers. Furthermore, when AUC analysis is an acceptable measurement (thus averaging out some assay noise), HEK293 FlpIn V8-CAMYEL cells can be diluted much further we have found these cells can be diluted to 312 cells/well. This opens the possibility of using this biosensor with hard to transfect cells, or primary cells where cells are less abundant.

تين. 3 . HEK293 FlpIn cells were stably transfected with (A and C) CAMYEL or (B and D) V8-CAMYEL and treated with vehicle (أسود) and forskolin (رمادي). Cells were diluted to (A and B) 20,000 cells/well or (C and D) 1250 cells/well in a 384-well plate. Duplicate wells of cells treated at the same time are shown for each condition, plotted as nonnormalized inverse BRET ratios.