معلومة

الخلايا الظهارية والفيروسات الأنفية

الخلايا الظهارية والفيروسات الأنفية



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

إذا قمت بحقن ورم بخلايا طلائية مصابة بالفيروس الأنفي ، فهل سيستمر هذا في إثارة استجابة مناعية كما هو الحال مع الجهاز التنفسي؟ ثانيًا ، ما هو السبب المحدد الذي يجعل الفيروس الأنفي لا ينجذب إلا إلى الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي. هل تعطي هذه الخلايا بصمة كيميائية محددة ينجذب إليها الفيروس؟


إصابة الخلايا السرطانية بالفيروسات لإثارة استجابة مناعية كان يطلق عليها (الورم / المناعي) "xenogenization". قد يندرج هذا النهج الآن تحت العناوين العامة لمناعة الورم ، ومعدلات المناعة أو لقاحات الورم. تم استكشاف Xenogenization لعقود (بنجاح معتدل فقط). تتضمن بعض الأساليب الحديثة إضافة جينات محفزة للمناعة إلى "الناقل" الفيروسي (مثل GM-CSF) لمحاولة تحسين الاستجابة المناعية. عادة ما يكون Xenogenization مخصصًا للاستخدام مع الخلايا السرطانية (الذاتية) للمرضى. تشمل الأساليب الأخرى التي تستخدم الفيروسات توصيل الجينات التي تعمل بشكل مفضل في الخلايا السرطانية أو "مستضدات الورم". ربما تم تصميم بعض هذه الفيروسات المعدلة لتكون ذات قدرة منخفضة أو معدومة على التكاثر في الجسم. لاحظ أن بعض الفيروسات ، مثل الأنفلونزا أو فيروسات الأنف ، ليست (بشكل عام) قادرة على الدوران في مجرى الدم (الفيروسية) لإصابة خلايا الورم البعيدة. بدلاً من ذلك ، فإن الهدف من استخدام مثل هذه الفيروسات هو إثارة استجابة مناعية ضد مستضدات الورم المعبر عنها في الخلايا "المصابة الأصلية" في موقع الحقن ، ونأمل أن يستمر الجهاز المناعي في مهاجمة الكتل البعيدة / النقائل.


يحتوي الفيروس على بعض الجزيئات على سطحه ، والتي تناسب المستقبلات الموجودة على سطح الخلايا المضيفة. في حالة فيروسات الأنف هناك ثلاثة مستقبلات ممكنة. ترسو فيروسات ما يسمى بالمجموعة الرئيسية (أو أنواع HRV-A) في ICAM1 ، والمجموعة الثانوية (أو أنواع HRV-B) إلى LDLR (مستقبلات الدهون منخفضة الكثافة) ، والمجموعة الحديثة نسبيًا من رصيف HRV-C إلى مستقبلات HRVC. انظر الصورة أدناه. إنه مأخوذ من هذه المقالة ("فيروسات الأنفلونزا البشرية") ، والتي تعطي نظرة عامة لطيفة على المجال.

فيما يتعلق بسؤال الحقن: سوف تثير ردود فعل مناعية ضد الخلايا الظهارية ، إذا كانت من شخص مختلف. إذا لم تكن كذلك ، فإن هذه الخلايا سوف تموت ببساطة ولن يحدث أي شيء آخر.


ترتبط عدوى فيروسات الأنف بنخر والتهاب الخلايا الظهارية في مجرى الهواء عبر إنترلوكين 1 عند الأطفال الصغار المصابين بالتليف الكيسي

مقدمة: من المرجح أن تساهم استجابات الخلايا الظهارية لمجرى الهواء (AEC) للتليف الكيسي (AEC) لعدوى فيروس الأنف (RV) في علم الأمراض المبكر لأمراض الرئة مع زيادة الالتهاب العدلات وانخفاض موت الخلايا المبرمج. نخر AEC الذي ينتج عنه التهاب مجرى الهواء الناتج عن إشارات IL-1 هو اكتشاف مميز في التليف الكيسي الذي يمكن اكتشافه في الشعب الهوائية للأطفال الصغار. نظرًا لكونه العدوى المبكرة الأكثر شيوعًا ، فإن النخر الظهاري الناجم عن RV قد يساهم في التهاب العدلات المبكر في التليف الكيسي عبر إشارات IL-1. بما أنه لا يُعرف سوى القليل عن IL-1 وبيولوجيا مرض الرئة التليف الكيسي ، قيمت هذه الدراسة الاستجابات الخلوية والمؤيدة للالتهابات لـ CF وغير CF AEC بعد عدوى RV ، مع فرضية أن عدوى RV تؤدي إلى نخر ظهاري والتهاب مدفوع IL-1 . أساليب:تم الحصول على AEC الأساسي من الأطفال الذين لديهم (ن = 6) وبدون CF (ن = 6) أصيبوا بـ RV (MOI 3) لمدة 24 ساعة وأحداث قابلة للحياة ، نخرية وموت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية بوابات من سبع خطوات (٪ إجمالي الأحداث). تم أيضًا قياس IL-1α و IL-1β و IL-1Ra و IL-8 و CXCL10 و CCL5 و IFN-β و IL-28A و IL-28B و IL-29 في طاف ثقافة الخلية (pg / mL). نتائج:خفضت عدوى RV الأحداث القابلة للحياة في غير CF AEC (ص & lt 0.05) ، زيادة الأحداث النخرية في non-CF و CF AEC (ص & lt 0.05) وزيادة أحداث موت الخلايا المبرمج في غير CF AEC (ص & lt 0.05). تسبب العدوى في إنتاج IL-1α و IL-1β في كلا الطرازين الظاهريين (ص & lt 0.05) ولكنها مرتبطة فقط بالنخر (IL-1α: ص = 0.80 IL-1β: ص = 0.77 ص & lt 0.0001) في CF AEC. زادت عدوى RV أيضًا من IL-1Ra في non-CF و CF AEC (ص & lt 0.05) ، على الرغم من أنها أكثر بكثير في غير CF AEC (ص & lt 0.05). أخيرًا ، حفزت العدوى إنتاج IL-8 في non-CF و CF AEC (ص & lt 0.05) ومرتبط بـ IL-1α (ص = 0.63 أمبير ص = 0.74 على التوالي ص & lt 0.0001). الاستنتاجات:وجدت هذه الدراسة أن عدوى RV تؤدي إلى موت الخلايا النخرية في CF AEC. علاوة على ذلك ، ارتبط RV الناجم عن IL-1 ارتباطًا وثيقًا بموت الخلايا النخرية في هذه الخلايا. نظرًا لأن إشارات IL-1R تدفع العدلات في مجرى الهواء وإنتاج الميوسين ، فإن هذه الملاحظات تشير إلى أن الإصابة بالتهاب الكبد الفيروسي في وقت مبكر من الحياة قد تؤدي إلى تفاقم الالتهاب وتراكم الميوسين الذي يؤدي إلى مرض الرئة التليف الكيسي المبكر. نظرًا لأنه يمكن استهداف IL-1R علاجيًا باستخدام IL-1Ra ، فإن هذه البيانات تشير إلى نهج علاجي جديد مضاد للالتهابات يستهدف التأثيرات النهائية لإشارات IL-1R للتخفيف من مسببات الالتهاب المخاطي الناجم عن الفيروسات المسببة لأمراض الرئة المبكرة.

الكلمات الدالة: التليف الكيسي لظهارة مجرى الهواء interleukin-1 rhinoviruses rhinovirus.

حقوق النشر © 2020 Montgomery، Frey، Mall، Stick and Kicic.

الأرقام

عدوى فيروسات الأنف من غير التليف الكيسي و ...

عدوى فيروسات الأنف من non-CF و CF AEC تقلل من الأحداث القابلة للحياة ، وتزيد من الأحداث النخرية ، ...

يتم زيادة IL-1α و IL-1β ...

يتم زيادة IL-1α و IL-1β في طاف من non-CF و CF AEC التالية ...

IL-1α و IL-1β في طاف ...

يرتبط IL-1α و IL-1β في المادة الطافية بالأحداث النخرية في CF AEC ...

تزيد الإصابة بالفيروسات الأنفية من الإنترلوكين 1Ra و ...

تزيد عدوى فيروسات الأنف من إشارات IL-1Ra و IL-8 في المادة الطافية من non-CF و CF ...

دور عدوى فيروس الأنف ...

دور عدوى فيروس الأنف في الاستجابة الالتهابية IL-1 في التليف الكيسي ...


يتم إحداث مستقبلات شبيهة بالحصيلة 3 عن طريق النشاط المضاد للفيروسات وتوسيطه ضد عدوى الفيروس الأنفي للخلايا الظهارية في الشعب الهوائية البشرية

الفيروسات الأنفية (RV) هي السبب الرئيسي لنزلات البرد والتفاقم الحاد للربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن. المستقبلات الشبيهة بالرصد (TLRs) هي عائلة محفوظة من المستقبلات التي تتعرف على مجموعة متنوعة من الأنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة وتستجيب لها. يتعرف TLR3 على الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة ، وهو وسيط مهم للعديد من دورات الحياة الفيروسية (بما في ذلك RV). إن أهمية TLR3 في استجابات المضيف لعدوى الفيروس غير معروفة. باستخدام BEAS-2B (خط الخلايا الظهارية البشرية في الشعب الهوائية) ، أظهرنا أن تكرار RV زاد من التعبير عن بروتين TLR3 mRNA و TLR3 على سطح الخلية. لاحظنا أن حجب TLR3 أدى إلى انخفاض في إنترلوكين 6 و CXCL8 و CCL5 استجابةً لبولي (IC) ولكن زيادة بعد الإصابة بالـ RV. أخيرًا ، أظهرنا أن TLR3 توسط في الاستجابة المضادة للفيروسات. توضح هذه الدراسة متطلبًا وظيفيًا مهمًا لـ TLR3 في استجابة المضيف ضد عدوى الفيروس الحي وتشير إلى أن بولي (IC) ليس دائمًا نموذجًا جيدًا لدراسة بيولوجيا عدوى الفيروس الحي.

الأرقام

تؤدي عدوى RV إلى الوقت ...

تؤدي عدوى RV إلى زيادة تعتمد على الوقت في TLR3 mRNA وتعبير البروتين السطحي ...

تحريض بروتين سطح TLR3 ...

تحريض تعبير البروتين السطحي TLR3 هو استجابة للجرعة ومستقل عن النمط المصلي و ...

التأثير التحريضي للوظيفة ...

التأثير التحريضي للتثبيط الوظيفي للمستقبل TLR3 المعبر عن السطح استجابةً لبولي (IC) ...

تأثير التثبيط الوظيفي ...

تأثير التثبيط الوظيفي لـ TLR3 المعبر عنه السطح على تكرار RV. كانت الخلايا ...

مخطط للتفاضل ...

مخطط للتأثيرات التفاضلية بوساطة تثبيط TLR3 السطحي. كبت…


تدعم الخلايا الظهارية التنفسية للفأر التكرار الفعال لفيروس الأنف البشري

تعد فيروسات الأنف البشرية (HRV) مسؤولة عن غالبية حالات العدوى الفيروسية في الجهاز التنفسي العلوي. علاوة على ذلك ، ترتبط عدوى HRV بالتفاقم الحاد للربو وأمراض الجهاز التنفسي المزمنة الأخرى في الجهاز التنفسي السفلي. مطلوب نموذج حيواني صغير للمرض الناجم عن HRV لتطوير علاجات جديدة. ومع ذلك ، يصعب العمل مع نماذج الفئران الحالية لعدوى HRV ، وحتى وقت قريب كان يُعتقد أن خطوط خلايا الماوس غير مسموح بها بشكل عام لتكرار HRV في المختبر. نوضح في هذا التقرير أن فيروس مجموعة المستقبلات الثانوية ، HRV1B ، يمكن أن يصيب ويتكاثر في خط الخلايا الظهارية التنفسية للفأر (LA-4) بشكل أكثر كفاءة من خط خلية الخلايا الليفية للفأر (L). يتطلب فيروس مجموعة المستقبلات الرئيسية HRV16 جزيء التصاق الإنسان بين الخلايا -1 (ICAM-1) لدخول الخلية وبالتالي لا يمكن أن يصيب خلايا LA-4. ومع ذلك ، أدى تعداء الحمض النووي الريبي HRV16 في المختبر إلى تكرار الحمض النووي الريبي الفيروسي وإنتاج الفيروس المعدي. أدى التعبير عن جزيء ICAM-1 الوهمي ، الذي يشتمل على الماوس ICAM-1 مع المجالات خارج الخلية 1 و 2 التي تم استبدالها بالمجالات البشرية المكافئة ، إلى جعل خط الخلايا الظهارية التنفسية الفأرية غير المسموح بها عرضة للدخول والتكرار الفعال لـ HRV. تشير هذه الملاحظات إلى أنه ينبغي متابعة تطوير نماذج الفأر لعدوى الجهاز التنفسي من قبل مجموعة HRV الرئيسية والثانوية.


التغيير الناجم عن العدوى بالفيروسات الأنفية في الوصلة الضيقة والالتصاق بمكونات الوصلة في الخلايا الظهارية للأنف البشرية

تشمل مظاهر عدوى فيروس الأنف (RV) إفراز المخاط وزيادة نفاذية الأوعية الدموية والعدوى البكتيرية الثانوية. قد تعكس هذه التأثيرات وظائف الحاجز الظهاري المعطلة ، والتي يتم تنظيمها بشكل أساسي من خلال التقاطعات بين الخلايا ، والتي يشار إليها باسم الوصلات الضيقة (TJs) والتقاطعات الملتصقة (AJs). كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقق من التغيرات في مكونات TJs (ZO-1 ، الإطباق ، و claudin-1) و AJs (E-cadherin) بعد الإصابة بالـ RV في الخلايا الظهارية للأنف المزروعة.

أساليب:

أصيبت الخلايا الظهارية للأنف البشرية الأولية التي نمت على واجهة بين الهواء والسائل بشكل ذريع بالـ RV. تم تحديد التغييرات التي يسببها RV في التعبير عن بروتينات TJ و AJ الظهارية باستخدام تفاعل سلسلة البوليميراز العكسي في الوقت الحقيقي ، والفحص المجهري متحد البؤر ، وتحليلات اللطخة الغربية. تم تقييم التغييرات الوظيفية في سلامة البروتينات الوصلية عن طريق قياس المقاومة بطريق الظهارة (TER) باستخدام الفولتميتر.

نتائج:

أدت عدوى RV إلى خفض مستويات الرنا المرسال من ZO-1 ، و occludin ، و claudin-1 ، و E-cadherin إلى 64.2٪ ، و 51.8٪ ، و 56.2٪ ، و 56.3٪ ، على التوالي ، من تلك الموجودة في الضوابط (ص & الملازم 05). كانت الانخفاضات في مستويات البروتين ZO-1 ، و occludin ، و claudin-1 ، و E-cadherin في الخلايا المصابة بالـ RV واضحة في الصور المجهرية متحد البؤر المناعي. كانت مستويات التعبير عن هذه البروتينات أيضًا أقل في المجموعة المصابة بالـ RV في تحليلات اللطخة الغربية. خفضت عدوى RV متوسط ​​TER من 143.1 Ω / cm 2 (الضوابط) إلى 122.6 Ω / cm 2.

الاستنتاجات:

خفضت عدوى RV من التعبير عن مكونات TJ و AJ وخفضت TER في الخلايا الظهارية للأنف البشرية المستزرعة الأولية ، مما يشير إلى أن عدوى RV قد يكون لها تأثير ضار على وظيفة الحاجز الظهاري للأنف. منظار الحنجرة ، 2010


الخصائص البيولوجية وانتشار فيروس الأنف البشري- C في الخلايا الظهارية للجيوب الأنفية المتباينة

لا توجد معلومات حول الخصائص البيولوجية الأساسية لفيروسات فيروس الأنفلونزا البشري (HRV-C) بسبب صعوبات استنبات هذه الفيروسات. كان هدفنا هو تطوير نظام زراعة الخلايا لتنمية HRV-C. تم تمييز الخلايا الظهارية من الجيوب البشرية (HSEC) في واجهة الهواء السائل (ALI). دعمت الثقافات المتمايزة نمو 1-2 سجلات لـ HRV-C15 كما تم الكشف عنها بواسطة RT-PCR الكمي. سمتان مميزتان لمركبات HRV هما قابلية الحمض والنمو الأمثل عند 33-34 درجة مئوية. استخدمنا هذا النظام لإظهار أن HRV-C15 يتم تحييده بواسطة درجة حموضة منخفضة (4.5). على عكس معظم أنواع HRV ، كان تكرار HRV-C15 و HRV-C41 متشابهًا عند 34 و 37 درجة مئوية. يوفر HSEC ALI أداة مفيدة للدراسات الكمية لتكرار HRV-C. قد تساهم قدرة HRV-C على النمو بشكل جيد على قدم المساواة عند 34 درجة مئوية و 37 درجة مئوية في ميل HRV-C للتسبب في أمراض مجرى الهواء المنخفضة عند الرضع والأطفال المصابين بالربو.

حقوق النشر © 2012 Elsevier Inc. جميع الحقوق محفوظة.

الأرقام

صورة مجهرية لظهارة الجيوب الأنفية البشرية ...

صورة مجهرية لظهارة الجيوب البشرية بعد التمايز في ALI (Haemotoxylin & amp Eosin ، 600 × ...

انتشار HRV-C15 في ...

انتشار HRV-C15 في أشكال مختلفة من ظهارة الجيوب الأنفية البشرية. (أ) قطع من ...

عدوى HRV لثقافات ALI ...

عدوى HRV لمزارع ALI. ثقافات HSEC ALI ( ن = 6) عند 21 ...

منحنى الاستجابة للجرعة من HRV ...

منحنى استجابة جرعة HRV في HSEC متمايز. ثقافات HSEC متباينة ( ن…

تأثير عمر الثقافة على تكرار HRV-C15. ثقافات HSEC ( ن =3)…

حساسية HRV-C15 منخفضة ...

حساسية HRV-C15 لانخفاض درجة الحموضة. تم تخفيف HRV-C15 بنسبة 1:10 في فوسفات السترات ...

تأثير درجة الحرارة على HRV-C ...

تأثير درجة الحرارة على تكرار HRV-C. (أ) الثقافات المتمايزة من HSEC ( ن…


العدوى الفيروسية التنفسية شائعة ويمكن أن تكون مدمرة للمرضى الذين يعانون من أمراض الرئة الكامنة. غالبًا ما يتطلب تشخيص العدوى الفيروسية أخذ عينات غازية ، وغالبًا ما يتطلب التفسير معدات معملية متخصصة. هنا ، نختبر الفرضية القائلة بأن اختبار التنفس يمكن أن يشخص الإنفلونزا وعدوى فيروسات الأنف باستخدام نموذج في المختبر لمجرى الهواء البشري.

أصيبت الخلايا الظهارية للقصبة الهوائية البشرية الأولية المزروعة إما بالأنفلونزا A H1N1 أو الفيروس الأنفي 1B ومقارنتها بخلايا التحكم السليمة. تم إجراء قياسات المستقلب المتطاير في مساحة الرأس لمزارع الخلايا في نقاط زمنية مدتها 12 ساعة بعد الإصابة باستخدام طريقة قياس الطيف الكتلي للغاز والامتصاص الحراري.

استنادًا إلى 54 مركبًا ، ميزت النماذج الإحصائية ملامح المركبات العضوية المتطايرة للخلايا المصابة بالأنفلونزا وفيروسات الأنف من نظرائها الأصحاء. كانت المنطقة الواقعة تحت قيم المنحنى 0.94 للأنفلونزا و 0.90 لفيروس الأنف و 0.75 للضوابط. تنبأ تحليل الانحدار بعدد الساعات التي أصيبت قبل الخلايا بخطأ جذر مربع متوسط ​​يبلغ 6.35 ساعة للأنفلونزا و 3.32 ساعة للخلايا المصابة بالفيروس الأنفي.

لا يمكن استخدام المؤشرات الحيوية المتطايرة الصادرة عن الخلايا الظهارية القصبية فقط لتشخيص ما إذا كانت الخلايا مصابة ، ولكن أيضًا لتحديد توقيت العدوى. يدعم نموذجنا الفرضية القائلة بأن اختبار التنفس يمكن أن يساعد في تشخيص الالتهابات الفيروسية.


عدوى فيروسية

علم الأوبئة وانتقالها

عربات سكن متنقلة في جميع أنحاء العالم في التوزيع. في الولايات المتحدة ، لوحظ أن التهاب الكبد الوبائي يسبب 0.74 إلى 0.77 إصابة لكل شخص سنويًا عند البالغين. يُعتقد أن RV ينتج معدلات إصابة أعلى عند الأطفال ، مما يؤدي إلى اكتساب الأجسام المضادة لأنواع RV المختلفة خلال الطفولة والمراهقة ، مع انتشار الأجسام المضادة الذروة عند الشباب. إن المناعة ضد الفيروس الطاعيني هي نوع خاص وتوفر حماية طويلة الأمد بعد الإصابة ، على الرغم من أنه قد تكون هناك عدوى ثانية من نفس نوع الفيروس. تنتشر الأنماط المناعية المختلفة في مجتمع معين بطريقة عشوائية على ما يبدو. في الولايات المتحدة ، تنتشر عدوى RV في أوائل الخريف وأواخر الربيع.

الخزان الرئيسي لل RV هو أطفال المدارس ، الذين ينقلون عدوى RV بين أقرانهم في الفصل وإدخالها في منازلهم ، مما يؤدي إلى إصابة أفراد الأسرة الآخرين. أظهرت الدراسات التي أجريت على نزلات البرد التجريبية لدى المتطوعين أن الفيروس ينتشر بشكل أكثر فاعلية عن طريق الأصابع الملوثة التي تودع الفيروس عن طريق الخطأ في الأنف أو العين. تم تحقيق انتقال RV التجريبي أيضًا عن طريق الطريق المحمول جواً ، ويفترض أن يكون عن طريق الهباء الجوي للجسيمات الكبيرة. لم يتم تحديد الأهمية النسبية لهذين المسارين لنقل RV في ظل الظروف الطبيعية.


المواد والأساليب

مرضى

صحي (ن = 8) ، والربو (ن = 10) ، ومرض الانسداد الرئوي المزمن (ن = 9). كان مرضى السيطرة الأصحاء يخضعون لخزعة الشعب الهوائية التشخيصية لأسباب أخرى غير الربو أو مرض الانسداد الرئوي المزمن. تم تصنيف مرضى الربو على أنهم خفيفون - شديدون وفقًا لإرشادات GINA. تم تصنيف مرضى الانسداد الرئوي المزمن وفقًا لإرشادات GOLD (الجدول 1).

توجد الموافقة الأخلاقية للحصول على عينات الأنسجة المطلوبة كإذن عام لاستخدام مادة الخزعة غير اللازمة للدراسات العلمية بعد أن يعطي كل مريض موافقة خطية مستنيرة (EKBB 05/06).

تم تقديم حل قياسي لـ OM-85 بواسطة OM Pharma SA ، 1217 Meyrin 1 ، سويسرا

عزل الخلايا الظهارية القصبية (BEC) وتوصيفها

وقد تم نشر هذا في وقت سابق [32]. باختصار ، تم وضع قطع صغيرة (2 × 2 × 2 مم) من أنسجة الشعب الهوائية في أوعية زراعة الخلايا ، والتي تم ترطيبها مسبقًا باستخدام وسيط خاص بـ BEC Cnt-PR-A (CellnTech ، برن ، سويسرا). تم استبدال الوسيط كل يومين وتم تمرير BEC بواسطة علاج التربسين / EDTA (5 دقائق ، 37 درجة مئوية) ، قبل إعادة تعليقه في 3 مل من Cnt-PR-A يحتوي على 25 ٪ من مصل العجل الجنيني لتحسين الالتزام. تم استبدال وسيط الالتصاق بعد 18 ساعة بـ Cnt-PR-A. تميزت BEC بالتلوين الإيجابي لـ E-Cadherin (Abcam 15148 ، Abcam ، Cambridge ، UK) ، pan-cytokeratin (sc-8018 ، Santa Cruz Biotechnology ، Santa Cruz ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، cytokeratin-14 (Abcam 9220) والسلبية تلطيخ الفبرونيكتين (Abcam 23751) كما هو موضح في الشكل 1 أ.

(أ) توصيف BEC بواسطة تلطيخ IF لـ: E-cadherin و cytokeratin-14 و pan-cytokeratin وتلطيخ سلبي للفيبرونكتين. تم الحصول على الصور بواسطة مجهر EVOS (ThermoFisher Scientific ، سويسرا). (ب) مخطط العلاج لعلاج BEC مع عدوى OM-85 و RV.

عدوى الفيروسات الأنفية (RV) وتحديد معدل الإصابة

تم وصف سلالة RV المستخدمة في التجارب سابقًا [33] وتم تحديدها على أنها RV-16. للتجارب الموضحة أدناه ، استخدمنا نفس المخزون الموصوف سابقًا [33].

تم استخدام BEC في الممر 1 أو 2 وأصيبت بعدة مرات من العدوى (MOI) من RV لمدة تصل إلى 3 أيام. تم تحديد معدل الإصابة عن طريق تلطيخ التألق المناعي باستخدام جسم مضاد لـ RV16 (القط # 18758 ، QED-Bioscience Inc. سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم زرع الخلايا في شرائح غرف ذات 8 آبار (Thermofisher Scientific ، سويسرا) وتم معالجتها باستخدام RV ومركبات كيميائية أخرى أو OM-85 ، كما هو موضح في مخطط المعالجة الوارد في الشكل 1 ب.

بعد العلاج ، تم إصلاح الخلايا بعد غسلها ببرنامج تلفزيوني في فورمالين 4٪ (في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق. تم غسل الخلايا الثابتة مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني وتم تنفيسها لمدة 15 دقيقة مع 0.01٪ TWEEN-100 في PBS. تم حظر الارتباط غير المحدد في 2 ٪ من ألبومين مصل الأبقار (30 دقيقة في برنامج تلفزيوني) قبل الحضانة طوال الليل (4 درجات مئوية) مع الجسم المضاد لـ RV16 (تخفيف 1: 100). بعد غسل 3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم تحضين الخلايا بجسم مضاد مضاد للفأر FITC (Abcam ، سويسرا) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل 3 مرات باستخدام PBS ، تم حساب عدد الخلايا الموجبة لـ RV بواسطة الفحص المجهري المناعي (محطة التصوير الخلوي EVOS FLoid ، Thermofisher Scientific) وتم تلوين النوى لعد الخلايا باستخدام كاشف الخلية الحية للموزع (Thermofisher Scientific).

النشاف المناعي

تم وصف تحليل البروتين مسبقًا [33]. بعد فصل البروتين من خلال هلام بولي أكريلاميد متدرج (4-12٪) ونشاف كهربائي على غشاء PVDF ، تم تحديد البروتينات ومعدل تعبيرها بواسطة النشاف الغربي. تم الكشف عن البروتينات التالية: β-defensin و C1qR و ICAM1 و CREB و phos-CREB و Erk1 / 2 و phos-Erk1 / 2 و ICOS و ICOSL و JNK و phos-JNK و MHC2 و MYD88 و p38 و phos- ص 38. يتم توفير تفاصيل التخفيف والمنتجين في الجدول 2.

تم حظر الأغشية لمدة ساعة (درجة حرارة الغرفة) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01٪ توين -20 و 2٪ ألبومين مصل بقري. تمت إضافة الأجسام المضادة الأولية بتركيزات موضحة في الجدول 2 وحضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد 3 غسلات بمحلول مانع ، تم تحضين الأغشية بأجسام مضادة خاصة بأنواع ثانوية موصوفة ببيروكسيداز فجل الحصان لمدة ساعة واحدة. تم غسل الجسم المضاد غير المرتبط بـ 3 غسلات باستخدام محلول مانع للتسرب وتم تصور نطاقات البروتين بالتعرض لأفلام الأشعة السينية.

ELISAs الخاصة بسطح الخلية

استندت هذه التحليلات إلى أنظمة ELISA المطورة داخليًا لترسيب جزيئات المصفوفة خارج الخلية [34]. باختصار ، تم زرع BEC في صفيحة 96 بئر ونمت حتى تتكدس. كانت الخلايا مصابة إما بـ RV أو OM-85 أو مثبطات نقل الإشارة لـ Erk1 / 2 MAPK أو p38 MAPK أو cAMP ، بمفردها أو مجتمعة كما هو موضح سابقًا [34]. تم إصلاح BEC بعد فترات حضانة مختلفة مع 2٪ فورمالين في PBS (4 درجات مئوية ، 2 × 5 دقيقة). تم حظر الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة عن طريق حضانة 30 دقيقة للخلايا الثابتة في 2٪ ألبومين مصل بقري ، في PBS + 0.01٪ توين -20. تمت إضافة أول جسم مضاد خاص بأحد بروتينات غشاء الخلية (الجدول 2) إلى المخزن المؤقت للحظر واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تم غسل الجسم المضاد غير المرتبط 3 مرات باستخدام محلول مانع للتسرب قبل إضافة الجسم المضاد الثانوي واحتضانه لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة. تم تحديد كمية ارتباط الجسم المضاد بعد 3 غسلات باستخدام محلول مانع للتسرب بواسطة ركائز بيروكسيداز الفجل الحصان (TBM). تم تحديد الكثافة الضوئية بواسطة قارئ لوحة ELISA (Biorad) وتم حساب التغييرات في ارتباط الأجسام المضادة كنسبة مئوية من الخلايا غير المحفزة.

IFN-γ إليسا

تم الكشف عن IFN-المفرز بواسطة مجموعة ELISA التجارية المتاحة (R & ampD Systems ، المملكة المتحدة) في وسط زراعة الخلايا في BEC البشري الأساسي قبل وبعد الإصابة بـ RV في 24 و 48 و 72 ساعة. تم إجراء ELISA وفقًا لتعليمات المورد.

تم نشر عزل BEC وتوصيفها في وقت سابق [34]. تم وضع قطع صغيرة من أنسجة الشعب الهوائية في أوعية زراعة الخلايا ، والتي تم ترطيبها مسبقًا باستخدام وسيط BEC محدد Cnt-PR-A (CellnTech ، برن ، سويسرا). تم استبدال الوسيط كل يومين وتم تمرير الخلايا عن طريق الاهتزاز الميكانيكي للخلايا المنقسمة. تميزت الخلايا بالتلوين الإيجابي لـ E-Cadherin و Pan-Keratin ، والتلوين السلبي للفيبرونيكتين (الملحق الشكل 1 ب).

إحصائيات

كانت فرضية Null أن OM-85 لا يؤثر على عدوى RV ، أو بروتينات غشاء الخلية التعبير ، أو بروتينات التأشير داخل الخلايا. تم استخدام اختبار الطالب (ثنائي الجانب) واختبار ويلكوكسون للتحليل الإحصائي. اعتبرت قيم P & lt 0.05 معنوية.


مناقشة

يعد تدفق العدلات سمة معترف بها للعدوى الفيروسية التي تشمل الجهاز التنفسي ، وربما يكون تجنيد العدلات ناتجًا عن الكيماويات التي تطلقها الخلايا الظهارية. وبالتالي ، قد تلعب المواد الكيميائية مثل ENA-78 دورًا محوريًا في بدء الأحداث الالتهابية التي تتوسطها العدلات في النهاية. توضح الدراسة الحالية أن عدوى RV للظهارة تولد إطلاق بروتين ENA-78 بالإضافة إلى IL-8 ، RV تحفز إنتاج ENA-78 mRNA في الخلايا الظهارية ، تنشيط الجين ENA-78 ناتج عن عدوى RV ، و ENA-78 يزداد في الجسم الحي خلال عدوى RV. تشير ملاحظاتنا إلى أن إطلاق ENA-78 قد يمثل استجابة نسيجية بارزة لعدوى RV في الشعب الهوائية

على الرغم من أن IL-8 يُنظر إليه حاليًا على أنه كيموكين CXC السائد في توظيف العدلات في مواقع الالتهاب في مجموعة متنوعة من الأمراض ، فمن المحتمل أيضًا أن تكون مساهمة أفراد الأسرة ذوي الصلة ذات أهمية. ENA-78 هو عضو متعدد الببتيد 78-aa من عائلة α-chemokine وهو متماثل مع IL-8 ، والذي يشترك معه في هوية تسلسلية بنسبة 22٪ [22]. على الرغم من أن دوره في حالات المرض البشري قد تم فحصه في الدم ، والأنسجة الجيبية ، ومتلقي الطعم الخيفي الكلوي ، والمرضى الذين يعانون من مرض التهاب الأمعاء والتليف الرئوي مجهول السبب [23-25] ، فقد تم فحص تعبير ENA-78 استجابةً لعدوى RV فقط في دراسة واحدة [26]. في الدراسة الأخيرة ، أنتجت خلايا BEAS-2B بعد الإصابة بـ RV39 ENA-78 ، وتم تقليل الإنتاج استجابة لمثبط p38 كيناز. فحصت دراساتنا الاستجابات للعدوى بنمط مصلي مختلف (RV16) في نفس خط الخلايا الظهارية (BEAS-2B) وفي الخلايا الظهارية الأولية المستزرعة ، وهو نوع الخلية التي يبدأ الفيروس فيها العدوى في الجسم الحي [27]. أصيبت خلايا BEAS-2B ، بناءً على دليل على كل من المعايرة و RT-PCR لـ RV RNA ، ويمكن إثبات العدوى بواسطة RT-PCR في الخلايا الظهارية الأولية. قد تكون التغييرات الصغيرة في معايرة الفيروس ناتجة عن انخفاض عدد الخلايا المصابة (& lt10٪ في دراسة حديثة [28]) علاوة على ذلك ، قد يكون من الممكن اكتشاف زيادة تكاثر الفيروس الذي تم قياسه بواسطة تقنيات المعايرة إذا تم استخدام وزارة الداخلية الأعلى لإصابة الخلايا [28] ]. نظرًا لأنه تم ملاحظة إنتاج كيموكين كبير أثناء التجارب التجريبية في وزارة الداخلية 1 ، لم يتم دراسة وزارة الداخلية الأعلى

تمت مقارنة إنتاج بروتين ENA-78 مع إنتاج IL-8 بسبب الأنشطة المعروفة لـ IL-8 بعد الإصابة بالتهاب الكبد RV [8 ، 9] ولأن ENA-78 قد يتبع مسارًا زمنيًا مختلفًا للإنتاج [29]. على سبيل المثال ، في البلاعم السنخية البشرية ، يبدو أن IL-8 بدلاً من ENA-78 هو الكيميائي السائد في المواد الطافية التي تم الحصول عليها بعد 24 ساعة من تحفيز عديدات السكاريد الدهنية [30]. توضح نتائجنا أن كميات كبيرة من ENA-78 يتم إنتاجها استجابةً لـ RV وأن بروتين ENA-78 و mRNA يبدو أنه يتم إنتاجهما في مرحلة متأخرة عن IL-8 في الخلايا الظهارية (انظر الأشكال 2-3 5). يوفر التنشيط المطول للجين ENA-78 بواسطة RV16 دليلًا إضافيًا على استجابة ENA-78 لـ RV التي تختلف عن استجابة IL-8. مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أنه بعد الإطلاق المبكر لـ IL-8 ، قد يزيد ENA-78 ويدعم حركة العدلات المستمرة من حجرة الأوعية الدموية إلى مساحات الأنسجة الخلالية. قد يؤدي تنشيط العدلات (التي تم تجنيدها في البداية بواسطة IL-8) وإطلاقها للوسطاء من خلال إجراءات ENA-78 ، الموجودة في الأنسجة في مرحلة لاحقة ، إلى تضخيم الشلال الالتهابي ، الذي يبلغ ذروته في إطلاق الكينين ، وزيادة نفاذية الأوعية الدموية ، و مزيد من تدفق الخلايا الالتهابية والبروتينات والوسطاء [5]. يجب أن ندرك أن كميات الكيموكين التي تم إطلاقها قد لا تعكس الأنشطة البيولوجية والكفاءة في جذب العدلات ، ولكن حتى الآن لم يتم الإبلاغ عن أي دراسات عن مقارنة وجهاً لوجه لقدرات التوضيع الكيميائي لـ IL-8 و ENA-78

لا يمكن تحديد سبب (أسباب) الاختلافات النسبية في إنتاج الكيميائيات في الخلايا الأولية وفي خط الخلية BEAS-2B من دراساتنا. كانت مستويات ENA-78 الصادرة عن خلايا BEAS-2B المصابة أعلى بشكل معتدل من تلك التي تم الإبلاغ عنها في الدراسة التي أجراها Griego et al. [26]. قد يكون هذا دالة لنمط مصلي RV مختلف (RV39 مقابل RV16) أو اختلافات في ظروف الثقافة أو الجرعات المعدية المستخدمة [28]. لم يتم الإبلاغ عن دراسات مقارنة لإنتاج ENA-78 بواسطة الخلايا الظهارية الأولية لمجرى الهواء. كانت قياسات IL-8 الصادرة عن خلايا BEAS-2B المصابة بالتهاب الكبد الفيروسي مماثلة للمستويات الموجودة في دراسات أخرى [8 ، 9 ، 26]. ومع ذلك ، اكتشفنا إطلاق IL-8 من الخلايا الظهارية الأولية للشعب الهوائية والذي كان أعلى بمقدار 2-4 أضعاف مما تم الإبلاغ عنه في دراسة حديثة [31]. ومن المثير للاهتمام ، أن مستويات IL-8 المماثلة لتلك الموجودة في دراستنا تم إنتاجها بواسطة خط خلية ظهاري آخر للمجرى الهوائي (خلايا A549) مصابًا بـ RV9 [32] ، مما يؤكد مرة أخرى على دور نوع الخلية والنمط المصلي الفيروسي (بالإضافة إلى وحدات وزارة الداخلية المختلفة) في استجابات كيموكين متغيرة. يبدو أن نسخ ENA-78 mRNA وإطلاق البروتين يصلان إلى الذروة عند 48 ساعة بالإضافة إلى ذلك ، كان هناك تحريض mRNA أكثر وضوحًا (8 أضعاف على الشكل 4A المصاب بالعدوى الوهمية) من إطلاق البروتين (2.5 ضعف على الشكل 3A المصاب بالعدوى الوهمية) . قد لا يكون كل ENA-78 الناتج مخصصًا للإفراز ، أو أنه يتم التعبير عن الأشكال الإسوية المختلفة لـ ENA-78 ويتم إفراز 1 فقط. في حالة IL-8 ، وجدنا أن mRNA بلغ ذروته في 24 ساعة بعد الإصابة بالـ RV للخلايا الظهارية الأولية (زيادة بمقدار 1.5 ضعف عن الشكل 4B المصاب بالعدوى الوهمية) ، على غرار المستويات المبلغ عنها في خلايا BEAS-2B [26]. بلغ إفراز بروتين IL-8 ذروته لاحقًا عند 48 ساعة ، كما هو متوقع إذا تم إطلاق البروتين المركب حديثًا (زيادة 4.3 أضعاف عن الشكل 3B المصاب بالعدوى الوهمية). ستوضح دراسات استقرار الرنا المرسال ووجود وسطاء مُشكلة مسبقًا وإطلاقها بعض التناقضات التي لوحظت في هذه الدراسات وغيرها.

تم تقييم خصوصية الاستجابات الخلوية عن طريق العدوى الوهمية والحضانة باستخدام RV المشع بالأشعة فوق البنفسجية. كانت النتائج من الضوابط المشعة بالأشعة فوق البنفسجية مماثلة لتلك الناتجة عن العدوى الوهمية ، على الرغم من أن بعض الباحثين الآخرين قد أبلغوا عن زيادات طفيفة فوق خط الأساس [26 ، 33]. قد يتعلق هذا ببروتوكولات الإشعاع فوق البنفسجي ووجود الفيروسات المعدية المتبقية في التجارب غير المفصلة هنا ، وقد وجدنا أن وقت تشعيع الأشعة فوق البنفسجية البالغ 30 دقيقة يمكن أن يترافق مع بعض RV القابلة للكشف عن طريق المعايرة. قد لا تكون الطرق الأخرى لتعطيل RV ، مثل التعرض لدرجة الحموضة المنخفضة ، فعالة بشكل كامل. ومع ذلك ، فمن المحتمل أن تفاعلات جزيء الالتصاق -1 بين الخلايا RV قد تحفز مسارات إشارات مستقلة عن تكاثر الفيروس ، وهذا يتطلب مزيدًا من التحقيق

لم يتم فحص العلاقة بين ENA-78 و RV في العدوى البشرية. قمنا بقياس ENA-78 في دراسة مقطعية للمرضى الذين يعانون من الربو الحاد وموضوعات تحكم صحية ووجدنا اختلافات في مستويات الأنف من ENA-78 التي تعتمد على وجود أو عدم وجود RV. في المصابين بالربو الحاد ، لوحظت اختلافات بين المرضى الذين يعانون من RV الأنفية أو بدونها ، وفي أولئك الذين يعانون من RV ، كانت مستويات ENA-78 في الأنف أعلى بكثير منها عند الشفاء بعد 56 يومًا. تشير ملاحظاتنا إلى أن RV يحفز إطلاق ENA-78 في الجسم الحي ويقدم دليلًا إضافيًا على دوره في العدوى البشرية. لم نختبر وجود فيروسات أخرى في المجموعة بدون RV ، وفي بعض منها ، قد تكون الفيروسات قد ساهمت في الارتفاعات المعتدلة في ENA-78 التي لوحظت في بعض الحالات. ومع ذلك ، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين الربو الحاد والشفاء في المجموعة دون RV. لم تتحقق الدراسات الحالية فيما إذا كانت الإصابة بالتهاب الكبد الوبائي تستحث أيضًا ENA-78 من الأشخاص غير المصابين بالربو المصابين بالتهاب الكبد الفيروسي. لم نتمكن من معالجة هذا السؤال لأن الدراسة الأصلية التي تم تكوين العينات منها لم تتضمن هذه المجموعة [18]. على عكس الدراسات المجتمعية للأطفال المصابين بالربو المصابين بعدوى RV [34] وأثناء الإصابة التجريبية RV16 [35] ، لم نتمكن من اكتشاف الاختلافات في IL-8 الأنفي أثناء الإصابة. قد يكون هذا مرتبطًا بالعمر (البالغين) وتوقيت جمع العينات (لاحقًا ، في المستشفى) في دراستنا

إن الدور المهم للعدوى الفيروسية التنفسية كسبب للمراضة المجتمعية والربو الحاد معترف به جيدًا حاليًا. قد تلعب الكيموكينات دورًا مركزيًا في بدء الاستجابات الالتهابية للعدوى الفيروسية ويمكن استهدافها في محاولات تقليل أو منع الأحداث الضارة اللاحقة ، خاصةً في مرضى الربو. تثبت دراساتنا وجود ارتباط بين قدرة فيروسات البرد الشائعة RV على إحداث إنتاج ENA-78 في المختبر وقدرتها المعروفة على التسبب في تفاقم الربو في الجسم الحي. تشير هذه الملاحظات إلى تورط ENA-78 في الالتهابات الفيروسية والحساسية من خلال آثاره المفترضة على العدلات وأيضًا من خلال الإجراءات الإضافية المحتملة على التعبير الجيني الالتهابي [36] وتكوين الأوعية [13] التي قد تؤدي إلى تفاقم التهاب مجرى الهواء. Characterization of ENA-78 regulation will provide insights into the complex biological responses that characterize RV infections and suggest strategies for their future therapeutic modulation


شاهد الفيديو: Профессия фармацевт. Заболевание ОРВИ. Риновирус (أغسطس 2022).