معلومة

كيف يمكنني ملاءمة A595 لعيناتي غير المعروفة للبيانات؟

كيف يمكنني ملاءمة A595 لعيناتي غير المعروفة للبيانات؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

بينما كنت أجري تجربة Bradford Assay لتحديد تركيز المجهول لدي ، انتهى بي الأمر بالحصول على A595 لعيناتي غير المعروفة أعلى من A595 من المعايير. كيف يمكنني حل هذه المشكلة؟ رغبات ... مايكل.


يمكنك ، اعتمادًا على ما تفعله ، استقراء منحنىك القياسي ليشمل امتصاص عيناتك. ومع ذلك ، لا ينصح بهذا لأن الامتصاصية خطية فقط ضمن نطاق معين. من الأفضل تخفيف عيناتك بحيث تقع ضمن نطاق المنحنى القياسي مع التأكد أيضًا من أن منحنىك القياسي خطي في الواقع.


أشرطة الخطأ في علم الأحياء التجريبي

تظهر أشرطة الخطأ بشكل شائع في الأشكال في المنشورات ، لكن علماء الأحياء التجريبية غالبًا ما يكونون غير متأكدين من كيفية استخدامها وتفسيرها. نوضح في هذه المقالة بعض الميزات الأساسية لأشرطة الخطأ ونوضح كيف يمكنها المساعدة في توصيل البيانات والمساعدة في التفسير الصحيح. قد تظهر أشرطة الخطأ فترات ثقة أو أخطاء معيارية أو انحرافات معيارية أو كميات أخرى. تعطي الأنواع المختلفة من أشرطة الخطأ معلومات مختلفة تمامًا ، لذا يجب أن توضح وسائل إيضاح الأشكال ما تمثله أشرطة الخطأ. نقترح ثماني قواعد بسيطة للمساعدة في الاستخدام الفعال لأشرطة الخطأ وتفسيرها.

ما هي أشرطة الخطأ؟

المجلات التي تنشر العلم - المعرفة المكتسبة من خلال الملاحظة أو التجربة المتكررة - لا تقدم فقط استنتاجات جديدة ، بل تقدم أيضًا أدلة حتى يتمكن القراء من التحقق من صحة استدلال المؤلفين. يمكن للأرقام التي تحتوي على أشرطة خطأ ، إذا تم استخدامها بشكل صحيح (1-6) ، أن تعطي معلومات تصف البيانات (الإحصائيات الوصفية) ، أو معلومات حول الاستنتاجات ، أو الاستنتاجات ، المبررة (الإحصائيات الاستدلالية). يتم وصف هاتين الفئتين الأساسيتين من أشرطة الخطأ بالطريقة نفسها تمامًا ، لكنهما في الواقع مختلفان اختلافًا جوهريًا. هدفنا هو توضيح الخصائص الأساسية للأرقام باستخدام أي من أشرطة الخطأ الشائعة ، كما تم تلخيصها في الجدول الأول ، وشرح كيفية استخدامها.

ماذا تخبرك أشرطة الخطأ؟

أشرطة الخطأ الوصفية.

يتم استخدام النطاق والانحراف المعياري (SD) لأشرطة الخطأ الوصفية لأنها توضح كيفية انتشار البيانات (الشكل 1). تشمل أشرطة خطأ النطاق القيم الأدنى والأعلى. يتم حساب SD بواسطة الصيغة

أين X يشير إلى نقاط البيانات الفردية ، م هو المتوسط ​​، و Σ (سيغما) تعني إضافة لإيجاد المجموع ، لجميع ن نقاط البيانات. SD هو ، تقريبًا ، المتوسط ​​أو الفرق النموذجي بين نقاط البيانات ومتوسطها ، م. سيقع حوالي ثلثي نقاط البيانات داخل منطقة متوسط ​​± 1 SD ، وستكون ∼95 ٪ من نقاط البيانات ضمن 2 SD من المتوسط.

من المستحسن للغاية استخدام أكبر ن، لتحقيق أشرطة خطأ استنتاجية أضيق وتقديرات أكثر دقة لقيم السكان الحقيقية.

يمكن أيضًا استخدام أشرطة الخطأ الوصفية لمعرفة ما إذا كانت نتيجة واحدة تتناسب مع النطاق الطبيعي. على سبيل المثال ، إذا كنت ترغب في معرفة ما إذا كان عدد خلايا الدم الحمراء طبيعيًا ، فيمكنك معرفة ما إذا كان ضمن 2 SD من متوسط ​​السكان ككل. أقل من 5٪ من إجمالي عدد خلايا الدم الحمراء أكثر من 2 SD من المتوسط ​​، لذلك إذا كان العدد المعني أكثر من 2 SD من المتوسط ​​، فقد تعتبره غير طبيعي.

كلما زادت حجم عينتك ، أو كررت التجربة مرات أكثر ، فإن متوسط ​​نتائجك (م) ستميل إلى الاقتراب أكثر فأكثر من المتوسط ​​الحقيقي ، أو المتوسط ​​لجميع السكان ، μ. يمكننا ان نستخدم م كأفضل تقدير لدينا للمجهول μ. وبالمثل ، كلما كررت تجربة أكثر فأكثر ، ستميل SD لنتائجك إلى تقريب الانحراف المعياري الحقيقي () الذي ستحصل عليه إذا تم إجراء التجربة عددًا لا نهائيًا من المرات ، أو على كل السكان. ومع ذلك ، فإن SD للنتائج التجريبية سوف تقترب من σ ، سواء ن كبير أو صغير. يحب م، SD لا يتغير بشكل منهجي كما ن يتغير ، ويمكننا استخدام SD كأفضل تقدير لدينا للمجهول σ ، مهما كانت قيمة ن.

أشرطة الخطأ الاستنتاجي.

في علم الأحياء التجريبي ، من الشائع أكثر أن تهتم بمقارنة عينات من مجموعتين ، لمعرفة ما إذا كانت مختلفة. على سبيل المثال ، قد تقارن الفئران من النوع البري مع الفئران الطافرة ، أو المخدرات مع الدواء الوهمي ، أو النتائج التجريبية مع الضوابط. يمكن استخدام نوع مختلف من شريط الخطأ لعمل استنتاجات من البيانات (على سبيل المثال ، لاتخاذ قرار بشأن ما إذا كانت المجموعات مختلفة بشكل كبير ، أو ما إذا كانت الاختلافات قد تكون بسبب التقلبات العشوائية أو الصدفة). هذه هي أشرطة الخطأ المعياري (SE) وفواصل الثقة (CIs). متوسط ​​البيانات ، م، مع أشرطة خطأ SE أو CI ، يعطي إشارة إلى المنطقة حيث يمكنك توقع متوسط ​​مجموعة النتائج المحتملة بأكملها ، أو المجموعة بأكملها ، μ ، (الشكل 2). يحدد الفاصل الزمني القيم الأكثر منطقية لـ μ.

نظرًا لأن أشرطة الخطأ يمكن أن تكون وصفية أو استنتاجية ، ويمكن أن تكون أيًا من الأشرطة المدرجة في الجدول الأول أو حتى أي شيء آخر ، فهي لا معنى لها أو مضللة ، إذا لم تذكر وسيلة إيضاح الأشكال نوعها. هذا يؤدي إلى القاعدة الأولى. قاعدة 1: عند إظهار أشرطة الخطأ ، قم دائمًا بوصف ما هي عليه في الشكل الإيضاحي.

اختبارات الدلالة الإحصائية وقيم P.

إذا أجريت اختبار دلالة إحصائية ، فستكون النتيجة قيمة P ، حيث P هي احتمال أنه إذا لم يكن هناك فرق بالفعل ، فستحصل ، بالصدفة ، على فرق كبير مثل الذي لاحظته ، أو حتى أكبر . تساوي الأشياء الأخرى (على سبيل المثال ، حجم العينة ، والتباين) ، فإن الاختلاف الأكبر في النتائج يعطي قيمة P أقل ، مما يجعلك تشك في وجود فرق حقيقي. وفقًا للاتفاقية ، إذا كنت تقول P & lt 0.05 ، فإن النتيجة ذات دلالة إحصائية ، وإذا كانت P & lt 0.01 ، فأنت تقول أن النتيجة مهمة للغاية ويمكنك أن تكون أكثر ثقة في أنك وجدت تأثيرًا حقيقيًا. كما هو الحال دائمًا مع الاستدلال الإحصائي ، قد تكون مخطئًا! ربما لا يوجد أي تأثير حقًا ، وقد كان حظك سيئًا للحصول على واحدة من 5٪ (إذا كان P & lt 0.05) أو 1٪ (إذا كان P & lt 0.01) من مجموعات النتائج التي تشير إلى اختلاف حيث لا يوجد فرق. بالطبع ، حتى لو كانت النتائج ذات دلالة إحصائية عالية ، فهذا لا يعني بالضرورة أنها مهمة من الناحية البيولوجية. من الضروري أيضًا ملاحظة أنه إذا كانت P & gt 0.05 ، وبالتالي لا يمكنك استنتاج وجود تأثير ذي دلالة إحصائية ، فقد لا تستنتج أن التأثير هو صفر. قد يكون هناك تأثير حقيقي ، لكنه صغير ، أو ربما لم تكرر تجربتك كثيرًا بما يكفي للكشف عنها. من الخطأ الشائع والخطير استنتاج "عدم وجود تأثير" لمجرد أن P أكبر من 0.05. إذا قمت بقياس ارتفاعات ثلاثة لاعبين من الذكور وثلاث إناث من لاعبي كرة السلة Biddelonian ، ولم تلاحظ فرقًا كبيرًا ، فلا يمكنك استنتاج أن الجنس لا علاقة له بالطول ، حيث أن حجم العينة الأكبر قد يكشف عن أحدهما. من المزايا الكبيرة لأشرطة الخطأ الاستنتاجي أن طولها يعطي إشارة بيانية لمقدار عدم اليقين الموجود في البيانات: يمكن أن تكون القيمة الحقيقية للمتوسط ​​μ الذي نقدره في أي مكان في 95٪ CI. تشير الأشرطة الاستدلالية العريضة إلى خطأ كبير في وجود أشرطة استنتاجية قصيرة تشير إلى دقة عالية.

النسخ المتماثلة أو العينات المستقلة - ما هو ن?

يتواءم العلم عادةً مع الاختلاف الواسع الذي يحدث في الطبيعة عن طريق قياس رقم (ن) من أفراد تم أخذ عينات منهم بشكل مستقل ، أو تجارب أجريت بشكل مستقل ، أو ملاحظات مستقلة.

القاعدة 2: قيمة ال ن (أي حجم العينة ، أو عدد التجارب التي تم إجراؤها بشكل مستقل) يجب ذكرها في وسيلة إيضاح الشكل.

فمن الضروري أن ن (عدد النتائج المستقلة) يتم تمييزه بعناية عن عدد التكرارات ، مما يشير إلى تكرار القياس على فرد واحد في حالة واحدة ، أو قياسات متعددة لنفس العينات أو متطابقة. ضع في اعتبارك محاولة تحديد ما إذا كان حذف الجين في الفئران يؤثر على طول الذيل. يمكننا اختيار فأر متحور ونوع بري واحد ، وإجراء 20 قياسًا مكررًا لكل من ذيولهما. يمكننا حساب الوسائل ، SDs ، و SEs للقياسات المكررة ، لكن هذه لن تسمح لنا بالإجابة على السؤال المركزي حول ما إذا كان حذف الجينات يؤثر على طول الذيل ، لأن ن سيساوي 1 لكل نمط وراثي ، بغض النظر عن عدد المرات التي تم فيها قياس كل ذيل. لمعالجة السؤال بنجاح ، يجب أن نميز التأثير المحتمل لحذف الجينات عن الاختلاف الطبيعي من حيوان إلى حيوان ، وللقيام بذلك نحتاج إلى قياس أطوال ذيل عدد من الفئران ، بما في ذلك العديد من المسوخات والعديد من الأنواع البرية ، مع ن & GT 1 لكل نوع.

وبالمثل ، يمكن إجراء عدد من ثقافات الخلايا المكررة عن طريق pipetting نفس حجم الخلايا من نفس ثقافة الأوراق المالية في الآبار المجاورة للوحة زراعة الأنسجة ، ثم معالجتها بشكل متماثل فيما بعد. على الرغم من أنه سيكون من الممكن فحص اللوحة وتحديد الوسائل والأخطاء الخاصة بالآبار المكررة ، فإن الأخطاء ستعكس دقة الماصات ، وليس استنساخ الاختلافات بين الخلايا التجريبية وخلايا التحكم. للتكرارات ، ن = 1 ، ولذلك فمن غير المناسب إظهار أشرطة الخطأ أو الإحصائيات.

إذا تضمنت التجربة ثقافات ثلاثية ، وتكررت أربع مرات مستقلة ، إذن ن = 4 ، وليس 3 أو 12. يرتبط التباين داخل كل مجموعة من النسخ الثلاثية بالإخلاص الذي تم به إنشاء التكرارات ، ولا علاقة له بالفرضية التي يتم اختبارها.

لتحديد القيمة المناسبة ل ن، فكر في ما يتم أخذ عينات من السكان بالكامل ، أو ما ستكون عليه مجموعة التجارب بأكملها إذا تم إجراء جميع التجارب الممكنة من هذا النوع. يمكن استخلاص الاستنتاجات حول هؤلاء السكان فقط ، لذا تأكد من أنها مناسبة للسؤال الذي يهدف البحث إلى الإجابة عليه.

في مثال الثقافات المكررة من مخزون واحد من الخلايا ، فإن المجتمع الذي يتم أخذ عينات منه هو ثقافة خلية المخزون. ل ن لتكون أكبر من 1 ، يجب إجراء التجربة باستخدام ثقافات مخزون منفصلة ، أو نسخ خلية منفصلة من نفس النوع. مرة أخرى ، ضع في اعتبارك السكان الذين ترغب في عمل استنتاجات حولهم - فمن غير المرجح أن تكون مجرد ثقافة مخزون واحدة. عندما ترى رقمًا به أشرطة خطأ صغيرة جدًا (مثل الشكل 3) ، يجب أن تسأل نفسك ما إذا كان الاختلاف الصغير جدًا الذي تتضمنه أشرطة الخطأ يرجع إلى تحليل التكرارات بدلاً من العينات المستقلة. إذا كان الأمر كذلك ، فإن الأشرطة عديمة الفائدة لعمل الاستدلال الذي تفكر فيه.

في بعض الأحيان ، يظهر الشكل فقط البيانات الخاصة بتجربة تمثيلية ، مما يعني أنه تم إجراء العديد من التجارب المماثلة الأخرى أيضًا. إذا تم عرض تجربة تمثيلية ، إذن ن = 1 ، ويجب عدم عرض أشرطة خطأ أو قيم P. بدلاً من ذلك ، يجب إعطاء الوسائل والأخطاء لجميع التجارب المستقلة ، حيث ن هو عدد التجارب التي أجريت.

القاعدة 3: يجب عرض أشرطة الخطأ والإحصاءات فقط للتجارب المتكررة بشكل مستقل ، وليس للتكرارات مطلقًا. إذا تم عرض تجربة "تمثيلية" ، فلا ينبغي أن تحتوي على أشرطة خطأ أو قيم P ، لأنه في مثل هذه التجربة ، ن = 1 (الشكل 3 يوضح ما لا يجب فعله).

ما نوع شريط الخطأ الذي يجب استخدامه؟

القاعدة 4: نظرًا لأن علماء الأحياء التجريبية يحاولون عادةً مقارنة النتائج التجريبية مع عناصر التحكم ، فمن المناسب عادةً إظهار أشرطة الخطأ الاستنتاجي ، مثل SE أو CI ، بدلاً من SD. ومع ذلك، إذا ن صغير جدًا (على سبيل المثال ن = 3) ، بدلاً من إظهار أشرطة الخطأ والإحصاءات ، من الأفضل رسم نقاط البيانات الفردية ببساطة.

ما هو الفرق بين أشرطة SE و CIs؟

الخطأ المعياري (SE).

لنفترض أن ثلاث تجارب أعطت قياسات 28.7 و 38.7 و 52.6 ، وهي نقاط البيانات في ن = 3 حالة على اليسار في الشكل 1. متوسط ​​البيانات هو م = 40.0 ، و SD = 12.0 ، وهو طول كل ذراع من قضبان SD. م (في هذه الحالة 40.0) هو أفضل تقدير للمتوسط ​​الحقيقي μ الذي نود معرفته. لكن ما مدى دقة التقدير؟ يمكن إظهار ذلك من خلال أشرطة الخطأ الاستدلالية مثل الخطأ القياسي (SE ، يشار إليه أحيانًا بالخطأ المعياري للمتوسط ​​، SEM) أو فاصل الثقة (CI). يتم تعريف SE على أنها SE = SD / √ن. في الشكل 4 ، تشير النقاط الكبيرة إلى متوسط ​​نفس العينات الثلاث كما في الشكل 1. بالنسبة إلى ن = 3 حالة ، SE = 12.0 / √3 = 6.93 ، وهذا هو طول كل ذراع من قضبان SE الموضحة.

يختلف SE عكسيًا مع الجذر التربيعي لـ نفكلما تكررت التجربة أكثر ، أو كلما تم قياس المزيد من العينات ، كلما أصبحت SE أصغر (الشكل 4). هذا يسمح بتقديرات أكثر وأكثر دقة للمتوسط ​​الحقيقي ، μ ، من خلال متوسط ​​النتائج التجريبية ، م.

نحن نوضح ونعطي قواعد ن = 3 ليس لأننا نوصي باستخدام مثل هذا الحجم الصغير ن، ولكن لأن الباحثين في كثير من الأحيان يستخدمون هذه الصغيرة في كثير من الأحيان ن القيم ومن الضروري أن تكون قادرًا على تفسير أوراقهم. من المستحسن للغاية استخدام أكبر ن، لتحقيق أشرطة خطأ استنتاجية أضيق وتقديرات أكثر دقة لقيم السكان الحقيقية.

فاصل الثقة (CI).

يوضح الشكل 2 ما يحدث إذا ، افتراضيًا ، أجرى 20 مختبرًا مختلفًا نفس التجارب ن = 10 في كل حالة. تكون أشرطة الخطأ 95٪ CI تقريبًا م ± 2xSE ، وهي تختلف في الموضع بسبب بالطبع م يختلف من معمل إلى آخر ، ويختلف أيضًا في العرض لأن SE يختلف. تلتقط أشرطة الخطأ هذه المتوسط ​​الحقيقي μ في -95٪ من المناسبات — في الشكل 2 ، النتائج من 18 من أصل 20 مختبرًا تتضمن μ. تكمن المشكلة في الحياة الواقعية في أننا لا نعرف μ ، ولا نعرف أبدًا ما إذا كان الفاصل الزمني لشريط الخطأ لدينا في الأغلبية 95٪ ويتضمن μ ، أم أن الحظ السيئ هو أحد 5٪ من الحالات التي فاتتها μ.

أشرطة الخطأ في الشكل 2 تقريبية فقط م ± 2xSE. إنها في الواقع 95٪ من مجالات الموثوقية ، والتي صممها الإحصائيون ، لذا فإن 95٪ بالضبط على المدى الطويل سوف تلتقط μ. لتحقيق ذلك ، يجب أن يكون الفاصل الزمني م ± ر(ن–1) × SE أين ر(ن–1) هي قيمة حرجة من جداول ر إحصائية. هذه القيمة الحرجة تختلف مع ن. ل ن = 10 أو أكثر تكون ∼2 ، لكنها صغيرة ن يزيد و ن = 3 يساوي ∼4. وبالتالي م تعد فترات ± 2xSE تقريبية جيدة جدًا لـ 95٪ CIs عندما ن هي 10 أو أكثر ، ولكن ليست صغيرة ن. يمكن اعتبار CI على أنها أشرطة SE تم تعديلها بواسطة عامل (ر) حتى يمكن تفسيرها بنفس الطريقة ، بغض النظر عن ن.

هذه العلاقة تعني أنه يمكنك بسهولة تبديل عقلك بين أشرطة SE و 95٪ CIs. إذا أظهر الشكل أشرطة SE ، فيمكنك مضاعفتها عقليًا ، للحصول على 95٪ من مجالات الموثوقية تقريبًا ، طالما ن 10 أو أكثر. ومع ذلك، إذا ن = 3 ، تحتاج إلى ضرب أشرطة SE في 4.

القاعدة 5: 95٪ من مجالات الموثوقية تلتقط μ في 95٪ من المناسبات ، لذلك يمكنك أن تكون واثقًا بنسبة 95٪ أن الفاصل الزمني الخاص بك يتضمن μ. يمكن مضاعفة عرض أشرطة SE للحصول على 95٪ CI تقريبًا ، المقدمة ن 10 أو أكثر. لو ن = 3 ، يجب ضرب أشرطة SE بـ 4 للحصول على 95٪ CI تقريبًا.

يتطلب تحديد CIs قدرًا أكبر من الحساب من قِبل مؤلفي الورقة البحثية ، ولكن بالنسبة للأشخاص الذين يقرؤونها ، تجعل CI الأمور أسهل في الفهم ، لأنها تعني نفس الشيء بغض النظر عن ن. لهذا السبب ، في الطب ، تمت التوصية باستخدام CI لأكثر من 20 عامًا ، وهي مطلوبة في العديد من المجلات (7).

يوضح الشكل 4 العلاقة بين SD و SE و 95٪ CI. يتم عرض نقاط البيانات كنقاط للتأكيد على القيم المختلفة لـ ن (من 3 إلى 30). تظهر أشرطة الخطأ الموجودة في أقصى اليسار SD ، وهو نفسه في كل حالة. تعرض أشرطة الخطأ الوسطى 95٪ CIs ، وتعرض الأشرطة الموجودة على اليمين أشرطة SE - يختلف كلا النوعين من الأشرطة اختلافًا كبيرًا مع ن، وتكون واسعة بشكل خاص بالنسبة للصغار ن. نسبة عرض شريط CI / SE هي ر(ن–1) تظهر القيم في الجزء السفلي من الشكل. لاحظ أيضًا أنه مهما كانت أشرطة الخطأ المعروضة ، فقد يكون من المفيد للقارئ إظهار نقاط البيانات الفردية ، خاصة بالنسبة للصغيرة ن، مثل Figs. 1 و 4 والقاعدة 4.

استخدام الفواصل الاستدلالية لمقارنة المجموعات

عند مقارنة مجموعتين من النتائج ، على سبيل المثال ، من ن بالضربة القاضية الفئران و ن الفئران البرية ، يمكنك مقارنة أشرطة SE أو 95٪ CIs على الوسيلتين (6). كلما كان التداخل بين القضبان أصغر ، أو زادت الفجوة بين القضبان ، كلما كانت قيمة P أصغر وكلما كان الدليل أقوى على الفرق الحقيقي. بالإضافة إلى ملاحظة ما إذا كان الشكل يظهر أشرطة SE أو 95٪ CIs ، فمن الأهمية بمكان ملاحظة ذلك ن، لأن القواعد التي تعطي قيمة P التقريبية تختلف عن ن = 3 وللحصول على ن ≥ 10.

يوضح الشكل 5 قواعد أشرطة SE. توضح اللوحات الموجودة على اليمين ما هو مطلوب ومتى ن ≥ 10: فجوة تساوي SE تشير إلى P 0.05 والفجوة 2SE تشير إلى P 0.01. لتقييم الفجوة ، استخدم متوسط ​​SE للمجموعتين ، مما يعني متوسط ​​ذراع واحد من أشرطة المجموعة C وذراع واحد من القضبان E. ومع ذلك، إذا ن = 3 (العدد المحبوب من رواة النكات ، صيادو Snark (8) ، وعلماء الأحياء التجريبيون) ، يجب تقدير قيمة P بشكل مختلف. في هذه الحالة ، P ≈ 0.05 إذا كان هناك ضعف في أشرطة SE المس فقط ، مما يعني فجوة 2 SE.

القاعدة 6: متي ن = 3 ، ومضاعفة أشرطة SE لا تتداخل ، P & lt 0.05 ، وإذا لم تضاعف أشرطة SE فقط ، فإن P قريبة من 0.05 (الشكل 5 ، اللوحة الموجودة في أقصى اليسار). لو ن 10 أو أكثر ، فجوة SE تشير إلى P 0.05 والفجوة 2 SE تشير إلى P 0.01 (الشكل 5 ، اللوحات اليمنى).

تنص المادة 5 على كيفية ارتباط أشرطة SE بـ 95٪ CIs. إن الجمع بين هذه العلاقة والقاعدة 6 لأشرطة SE يعطي قواعد 95٪ CIs ، والتي تم توضيحها في الشكل 6. عندما ن ≥ 10 (الألواح اليمنى) ، تداخل نصف ذراع يشير إلى P 0.05 ، ويعني اللمس فقط P 0.01. لتقييم التداخل ، استخدم متوسط ​​ذراع واحد للفاصل الزمني للمجموعة C وذراعًا واحدًا للفاصل الزمني E. لو ن = 3 (اللوحات اليسرى) ، P 0.05 عندما يتداخل ذراعان تمامًا بحيث يكون كل متوسط ​​مصطفًا تقريبًا مع نهاية CI الآخر. إذا كان التداخل 0.5 ، P 0.01.

القاعدة 7: مع 95٪ CIs و ن = 3 ، يشير تداخل الذراع الكاملة إلى P 0.05 ، ويشير التداخل بنصف ذراع إلى P 0.01 (الشكل 6 ، اللوحات اليسرى).

القياسات المتكررة لنفس المجموعة

القواعد موضحة في التين. 5 و 6 تنطبق عندما تكون الوسيلة مستقلة. إذا تم ربط قياسين ، على سبيل المثال مع الاختبارات في أوقات مختلفة على نفس المجموعة من الحيوانات ، أو القياسات الحركية لنفس الثقافات أو التفاعلات ، فإن CIs (أو SEs) لا تقدم المعلومات اللازمة لتقييم أهمية الاختلافات بين وسائل نفس المجموعة في أوقات مختلفة لأنها ليست حساسة للارتباطات داخل المجموعة. ضع في اعتبارك المثال الوارد في الشكل 7 ، حيث يتم قياس كل مجموعة من مزارع الخلايا التجريبية والضابطة المستقلة بأربع مرات. لا يمكن استخدام أشرطة الخطأ إلا لمقارنة المجموعات التجريبية بالمجموعة الضابطة في أي نقطة زمنية واحدة. سواء كانت أشرطة الخطأ 95٪ CIs أو SE أشرطة ، يمكن استخدامها فقط لتقييم الفروق بين المجموعة (على سبيل المثال ، E1 مقابل C1 ، E3 مقابل C3) ، ولا يجوز استخدامها للتقييم ضمن اختلافات المجموعة ، مثل E1 مقابل E2.

يتطلب تقييم الفرق داخل المجموعة ، على سبيل المثال E1 مقابل E2 ، تحليلًا يأخذ في الاعتبار الارتباط داخل المجموعة ، على سبيل المثال تحليل Wilcoxon أو تحليل t الزوجي. قد يتطلب النهج الرسومي إيجاد الفرق E1 مقابل E2 لكل ثقافة (أو حيوان) في المجموعة ، ثم رسم المتوسط ​​الفردي لهذه الاختلافات ، مع أشرطة الخطأ التي تمثل SE أو 95٪ CI المحسوبة من تلك الاختلافات. إذا كان 95٪ CI لا يشتمل على 0 ، فهناك فرق ذو دلالة إحصائية (P & lt 0.05) بين E1 و E2.

القاعدة 8: في حالة القياسات المتكررة على نفس المجموعة (على سبيل المثال ، للحيوانات أو الأفراد أو الثقافات أو التفاعلات) ، فإن أشرطة CI أو SE غير ذات صلة بالمقارنات داخل نفس المجموعة (الشكل 7).

استنتاج

يمكن أن تكون أشرطة الخطأ ذات قيمة لفهم النتائج في مقال صحفي وتقرير ما إذا كانت استنتاجات المؤلفين مبررة بالبيانات. ومع ذلك ، هناك مطبات. عند رؤية رقم به أشرطة خطأ لأول مرة ، اسأل نفسك ، "ما هو ن؟ هل هي تجارب مستقلة أم مجرد تكرار؟ " و "ما نوع أشرطة الخطأ هذه؟" إذا أعطتك وسيلة إيضاح الشكل إجابات مرضية على هذه الأسئلة ، فيمكنك تفسير البيانات ، ولكن تذكر أن أشرطة الخطأ والإحصاءات الأخرى يمكن أن تكون دليلًا فقط: تحتاج أيضًا إلى استخدام فهمك البيولوجي لتقدير معنى الأرقام الموضحة في أي الشكل.


مقدمة

حققت تقنيات التعلم العميق مؤخرًا نجاحات ملحوظة ، لا سيما في تطبيقات الرؤية واللغة [1 ، 2]. على وجه الخصوص ، يمكن لأحدث النماذج التوليدية العميقة أن تولد صورًا أو جمل واقعية من متغيرات كامنة منخفضة الأبعاد [3]. غالبًا ما يتعذر تمييز الصور والبيانات النصية التي تم إنشاؤها عن البيانات الحقيقية ، ويتحسن أداء توليد البيانات بسرعة [4 ، 5]. النوعان الأكثر انتشارًا من النماذج التوليدية العميقة هما أجهزة التشفير التلقائي المتغيرة (VAEs) وشبكات الخصومة التوليدية (GANs). تستخدم VAEs نهج Bayesian لتقدير التوزيع اللاحق لشبكة التشفير الاحتمالية ، بناءً على مزيج من خطأ إعادة البناء والاحتمال السابق للتوزيع المشفر [6]. في المقابل ، يتكون إطار عمل GAN من لعبة ثنائية اللاعبين بين شبكة مولد وشبكة تمييز [7]. تمتلك GANs و VAEs نقاط قوة وضعف تكميلية: تولد GANs عينات أفضل بكثير من VAEs [8] ، لكن تدريب VAE أكثر استقرارًا ويتعلم تمثيلات كامنة أكثر فائدة "غير متشابكة" [9]. تتفوق شبكات GAN في الأداء على VAEs في توليد عينات صور حادة [7] ، بينما تميل VAEs إلى إنشاء صور ضبابية [10]. يعد تدريب GAN بشكل عام أقل استقرارًا من تدريب VAE ، ولكن بعض الاشتقاقات الحديثة لـ GAN مثل Wasserstein GAN [11-13] تحسن بشكل كبير من استقرار تدريب GAN ، وهو مفيد بشكل خاص للبيانات غير المتعلقة بالصور.

إن تحقيق خاصية تسمى "فك التشابك" ، حيث يتحكم كل بُعد من أبعاد التمثيل الكامن في عامل تباين مميز لغويًا ، هو محور تركيز بحثي حديث حول النماذج التوليدية العميقة [14-20]. فك التشابك مهم للتحكم في توليد البيانات والتعميم على مجموعات المتغيرات الكامنة غير المرئية. على سبيل المثال ، تسمح التمثيلات غير المتشابكة لبيانات الصورة بالتنبؤ بالصور الوسيطة [21] وخلط أنماط الصور [22]. لأسباب غير مفهومة تمامًا ، يتعلم VAE بشكل عام تمثيلات أكثر تفككًا من الطرق الأخرى [23-28]. تستفيد الأساليب الحديثة لتعلم التمثيلات غير المتشابكة من هذه الميزة من خلال استخدام بنيات VAE المعدلة التي تعمل على تحسين فك التشابك ، بما في ذلك β-VAE و FactorVAE و β-TCVAE [9 ، 29-31]. في المقابل ، فإن المساحة الكامنة لشبكة GAN التقليدية متشابكة للغاية. تشجع بعض بنى GAN المعدلة ، مثل InfoGAN [32] ، فك التشابك باستخدام تقنيات غير خاضعة للإشراف البحت ، ولكن هذه الأساليب لا تزال غير مطابقة لأداء فك التشابك لـ VAEs [33-40].

عادةً ما يتم تقييم أداء فك التشابك كميًا على مجموعات بيانات الصور القياسية مع عوامل تباين حقيقة أساسية معروفة [41-44]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم التمثيلات غير المتشابكة نوعياً عن طريق إجراء عمليات المسح أو الحساب الخطي في الفضاء الكامن وفحص الصور الناتجة بصريًا [45-49].

في الآونة الأخيرة ، شهدت البيولوجيا الجزيئية نموًا سريعًا لتقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية التي يمكنها قياس مستويات التعبير لجميع الجينات عبر آلاف إلى ملايين الخلايا [50]. مثل بيانات الصور ، التي أثبتت النماذج التوليدية العميقة نجاحها ، فإن مجموعات بيانات RNA-seq أحادية الخلية كبيرة وعالية الأبعاد. وبالتالي ، يبدو من المحتمل أن التعلم العميق سيكون مفيدًا لبيانات الخلية الواحدة. على وجه الخصوص ، تحمل النماذج التوليدية العميقة وعودًا كبيرة لاستخلاص جوانب مميزة لغويًا للهوية الخلوية والتنبؤ بحالات الخلايا غير المرئية.

قامت العديد من الأوراق بالفعل بتطبيق VAEs [51–61] و GANs [62] على بيانات الخلية المفردة. طريقة VAE التمثيلية هي scGen ، والتي تستخدم نفس الوظيفة الموضوعية مثل β-VAE [9]. يتم استخدام القيم الكامنة المكتسبة في scGen للتنبؤات خارج العينة عن طريق حساب المساحة الكامنة. تتكيف ورقة cscGAN مع نهج Wasserstein GAN لبيانات الخلية الواحدة وتوضح أنه يمكن أن تولد ملفات تعريف واقعية للتعبير الجيني ، مقترحة استخدامها لزيادة البيانات.

يعد تقييم أداء فك التشابك للنماذج على بيانات الخلية المفردة أكثر صعوبة من بيانات الصورة ، لأن البشر لا يستطيعون فهم البيانات بشكل حدسي من خلال النظر إليها كما هو الحال مع الصور. استخدمت المناهج السابقة مثل scGen ضمنًا خصائص التمثيلات غير المتشابكة [51] ، ولكن لم يتم تقييم أداء فك التشابك بدقة على بيانات الخلية الواحدة.

هنا ، نقوم بشكل منهجي بتقييم أداء فك التشابك والتوليد للنماذج التوليدية العميقة على بيانات RNA-seq أحادية الخلية. نوضح أن نقاط القوة والضعف التكميلية في VAEs و GANs تنطبق على البيانات أحادية الخلية بطريقة مماثلة لبيانات الصورة. نقوم بتطوير MichiGAN ، وهي شبكة عصبية تجمع بين نقاط القوة في VAEs و GANs لأخذ عينات من التمثيلات غير المتشابكة دون التضحية بجودة توليد البيانات. نحن نستخدم MichiGAN وطرق أخرى في محاكاة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية [63 ، 64] ونقدم مقارنات كمية من خلال عدة مقاييس فك التشابك [29 ، 30]. نتعلم أيضًا تمثيلات غير متشابكة لثلاث مجموعات بيانات RNA-seq أحادية الخلية حقيقية [65-67] ونبين أن التمثيلات غير المتشابكة يمكنها التحكم في جوانب مميزة لغويًا للهوية الخلوية والتنبؤ بالتركيبات غير المرئية لحالات الخلية.

يعتمد عملنا على عمل لطف الله وآخرين. [51] ، الذي أظهر أن VAE بسيط (والذي أطلقوا عليه اسم scGen) يمكن أن يتنبأ باستجابات اضطراب الخلية المفردة. كما أظهروا العديد من السياقات البيولوجية المحددة التي يكون فيها هذا النوع من النهج مفيدًا. أولاً ، توقعوا تغيرات التعبير الجيني الخاص بنوع الخلية عن طريق معالجة الخلايا المناعية بعديد السكاريد الدهني. ثانيًا ، توقعوا التغييرات الخاصة بنوع الخلية التي تحدث عندما تصاب الخلايا الظهارية المعوية بالعدوى السالمونيلا أو Heligmosomoides polygyrus. أخيرًا ، أظهروا أن scGen يمكنها استخدام بيانات الفئران للتنبؤ باستجابات الاضطراب في الخلايا البشرية أو عبر الأنواع الأخرى. لمثل هذه المهام ، يمكن للمرء أن يكتسب رؤى بيولوجية مهمة من ملفات تعريف تسلسل scRNA التي تم إنشاؤها.

طريقتنا ، MichiGAN ، يمكن أن تقدم نفس أنواع التنبؤات وتنتج نفس أنواع الرؤى البيولوجية مثل scGen ، لكننا نظهر أن MichiGAN لها فوائد كبيرة مقارنة بـ scGen (بما في ذلك فك التشابك وأداء توليد البيانات). بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن MichiGAN يمكنه التنبؤ باستجابة خلية واحدة للعلاج الدوائي ، وهو تطبيق بيولوجي لم يتم توضيحه في ورقة scGen.


ما هو منحنى المعايرة؟ (مع صورة)

منحنى المعايرة هو طريقة مستخدمة في الكيمياء التحليلية لتحديد تركيز محلول عينة غير معروف. إنه رسم بياني تم إنشاؤه بوسائل تجريبية ، مع رسم تركيز المحلول على المحور السيني والمتغير الذي يمكن ملاحظته - على سبيل المثال ، امتصاص المحلول - مرسوم على المحور ص. يتم إنشاء المنحنى عن طريق قياس تركيز وامتصاص العديد من الحلول المعدة ، والتي تسمى معايير المعايرة. بمجرد رسم المنحنى ، يمكن تحديد تركيز المحلول غير المعروف عن طريق وضعه على المنحنى بناءً على امتصاصه أو متغير آخر يمكن ملاحظته.

تمتص المحاليل الكيميائية كميات مختلفة من الضوء بناءً على تركيزها. يتم قياس هذه الحقيقة في معادلة تُعرف باسم قانون بير ، والتي تُظهر علاقة خطية بين امتصاص الضوء للمحلول وتركيزه. يمكن للباحثين قياس امتصاص المحلول باستخدام أداة معملية تسمى مقياس الطيف الضوئي. هذه العملية ككل تسمى القياس الطيفي.

يمكن أن يكون قياس الطيف الضوئي مفيدًا في تحديد تركيز محلول غير معروف. على سبيل المثال ، إذا كان لدى الباحث عينة من مياه النهر ويريد معرفة محتواها من الرصاص ، فيمكنه تحديدها باستخدام مقياس الطيف الضوئي لرسم منحنى معايرة. أولاً ، يقوم الباحث بإنشاء عدة حلول قياسية للرصاص ، تتراوح من الأقل إلى الأكثر تركيزًا. يتم وضع هذه العينات في مقياس الطيف الضوئي ، والذي يسجل امتصاصًا مختلفًا لكل عينة.

تم رسم قيم الامتصاص المحددة تجريبياً على رسم بياني مقابل التركيز المعروف لكل معيار معايرة. يتم إنشاء مجموعة من النقاط ، والتي في حالة الامتصاص يجب أن تكون خطية تقريبًا بسبب قانون بير. يتم رسم خط لربط نقاط البيانات هذه ، لتشكيل منحنى المعايرة. في كل حالة تقريبًا ، لن تكون نقاط البيانات دقيقة من الناحية الحسابية ، لذلك يجب رسم الخط لاعتراض الحد الأقصى لعدد النقاط - إنه خط أفضل ملاءمة. على الرغم من أن علاقة الامتصاصية بالتركيز خطية ، إلا أن هذا لا ينطبق دائمًا على المتغيرات الأخرى المحددة تجريبياً ، وفي بعض الأحيان يجب استخدام المنحنيات لوصف العلاقة.

في هذه المرحلة ، يمكن تحليل الحل المجهول. يتم إدخال العينة في مقياس الطيف الضوئي ، ويتم قياس امتصاصها. نظرًا لأنه يتم قياس هذه العينة وفقًا لعدة معايير تحتوي على نفس المركب ، يجب أن يقع امتصاصها وتركيزها في مكان ما على طول منحنى المعايرة لهذا المركب. هذا يعني أنه بمجرد معرفة امتصاص المحلول ، يمكن استنتاج تركيزه رياضياً أو بيانياً.

يمكن رسم خط أفقي من قيمة y للمحلول غير المعروف - امتصاصه ، والذي تم قياسه للتو. ستشير النقطة التي يتقاطع عندها الخط مع منحنى المعايرة إلى قيمة x - التركيز. يعطي الخط العمودي ، المرسوم لأسفل من هذه النقطة ، تركيز الحل المجهول. يمكن أيضًا استخدام معادلة خط منحنى المعايرة لتحديد تركيز المحلول رياضيًا.


محتويات

في الاستخدام الأكثر عمومية ، منحنى المعايرة هو منحنى أو جدول لأداة قياس تقيس بعض المعلمات بشكل غير مباشر ، مع إعطاء قيم للكمية المرغوبة كدالة لقيم خرج المستشعر. على سبيل المثال ، يمكن عمل منحنى معايرة لمحول ضغط معين لتحديد الضغط المطبق من خرج محول الطاقة (جهد كهربائي). [3] يتم استخدام هذا المنحنى عادةً عندما تستخدم الأداة مستشعرًا تختلف معايرته من عينة إلى أخرى ، أو تتغير بمرور الوقت أو الاستخدام إذا كان ناتج المستشعر متسقًا ، فسيتم تمييز الأداة مباشرة من حيث الوحدة المقاسة.

يمكن أن تتناسب البيانات - تركيزات التحليل واستجابة الأداة لكل معيار - مع خط مستقيم ، باستخدام تحليل الانحدار الخطي. ينتج عن هذا نموذج موصوف بواسطة المعادلة ص = م س + ص0، أين ذ هي استجابة الأداة ، م يمثل الحساسية ، و ذ0 هو ثابت يصف الخلفية. تركيز الحليلة (x) من العينات غير المعروفة يمكن حسابها من هذه المعادلة.

يمكن استخدام العديد من المتغيرات المختلفة كإشارة تحليلية. على سبيل المثال ، يمكن قياس الكروم (III) باستخدام طريقة التلألؤ الكيميائي ، في أداة تحتوي على أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) ككاشف. يقوم الكاشف بتحويل الضوء الناتج عن العينة إلى جهد كهربائي يزيد مع شدة الضوء. كمية الضوء المقاسة هي الإشارة التحليلية.

تستخدم معظم التقنيات التحليلية منحنى المعايرة. هناك عدد من المزايا لهذا النهج. أولاً ، يوفر منحنى المعايرة طريقة موثوقة لحساب عدم اليقين في التركيز المحسوب من منحنى المعايرة (باستخدام إحصائيات خط المربعات الصغرى الملائمة للبيانات). [4] [5]

ثانيًا ، يوفر منحنى المعايرة بيانات عن علاقة تجريبية. يمكن التنبؤ بآلية استجابة الأداة للتحليل أو فهمها وفقًا لبعض النماذج النظرية ، ولكن معظم هذه النماذج لها قيمة محدودة للعينات الحقيقية. (عادة ما تعتمد الاستجابة الآلية بشكل كبير على حالة المادة التحليلية ، والمذيبات المستخدمة والشوائب التي قد تحتويها يمكن أن تتأثر أيضًا بعوامل خارجية مثل الضغط ودرجة الحرارة.)

تتطلب العديد من العلاقات النظرية ، مثل التألق ، تحديد ثابت فعال على أي حال ، من خلال تحليل معيار مرجعي واحد أو أكثر ، يعتبر منحنى المعايرة امتدادًا مناسبًا لهذا النهج. يوفر منحنى المعايرة لتحليل معين في (نوع) عينة معينة العلاقة التجريبية اللازمة لتلك القياسات الخاصة.

تتمثل العيوب الرئيسية في (1) أن المعايير تتطلب إمدادًا بالمواد التحليلية ، ويفضل أن يكون عالي النقاء وبتركيز معروف ، و (2) أن المعايير والمجهول موجودان في نفس المصفوفة. من الصعب للغاية الحصول على بعض التحليلات - على سبيل المثال ، بروتينات معينة - نقية بكميات كافية. غالبًا ما تكون التحليلات الأخرى في مصفوفات معقدة ، على سبيل المثال ، المعادن الثقيلة في مياه البركة. في هذه الحالة ، قد تتداخل المصفوفة مع إشارة التحليل أو تخففها. لذلك ، لا يمكن إجراء مقارنة بين المعايير (التي لا تحتوي على مركبات متداخلة) والمجهول. طريقة الإضافة القياسية هي طريقة للتعامل مع مثل هذا الموقف.

كما هو متوقع ، سيكون لتركيز المجهول بعض الخطأ الذي يمكن حسابه من الصيغة أدناه. [6] [7] [8] تفترض هذه الصيغة أنه يتم ملاحظة علاقة خطية لجميع المعايير. من المهم ملاحظة أن الخطأ في التركيز سيكون ضئيلاً إذا كانت الإشارة من المجهول تقع في منتصف إشارات جميع المعايير (المصطلح y u n k - y ¯ - < بار >> يذهب إلى الصفر إذا y u n k = y ¯ = < بار >> )


قيمة p من اختبار t

تذكر أن القيمة p هي الاحتمال (محسوبًا على افتراض أن الفرضية الصفرية صحيحة) أن ستنتج إحصائية الاختبار قيمًا على الأقل متطرفة مثل درجة t المنتجة لعينتك. نظرًا لأن الاحتمالات تتوافق مع المناطق الواقعة تحت دالة الكثافة ، يمكن توضيح قيمة p من اختبار t بشكل جيد بمساعدة الصور التالية:

توضح الصيغ التالية كيفية حساب قيمة p من اختبار t. بواسطة cdfر ، د نشير إلى دالة التوزيع التراكمي من توزيع t-Student بدرجة د من الحرية:

قيمة p من أيسر الذيل اختبار t:

قيمة p من الذيل الأيمن اختبار t:

قيمة p من ثنائي الذيل اختبار t:

أو بشكل مكافئ: قيمة p = 2 - 2 * cdfر ، د(| تنتيجة|)

ومع ذلك ، فإن cdf لتوزيع t يتم الحصول عليها من خلال صيغة معقدة إلى حد ما. للعثور على القيمة p يدويًا ، ستحتاج إلى اللجوء إلى الجداول الإحصائية ، حيث يتم جمع قيم cdf التقريبية ، أو إلى برامج إحصائية متخصصة. لحسن الحظ ، تحدد آلة حاسبة t-test الخاصة بنا قيمة p من اختبار t لك في غمضة عين!


تحليل ELISA

  • إليسا النوعية يحدد فقط ما إذا كان المستضد موجودًا أم لا في العينة. يتطلب بئرًا فارغًا لا يحتوي على مستضد أو مستضد تحكم غير ذي صلة.
  • ELISA شبه الكمي يسمح بالمقارنة النسبية لمستويات المستضد بين العينات.
  • إليسا الكمي يسمح بحساب كمية المستضد الموجودة في العينة. يتطلب مقارنة القيم المقاسة للعينات بمنحنى قياسي محضر من التخفيف التسلسلي لمولد ضد منقى بتركيز معروف. هذه هي بيانات ELISA الأكثر شيوعًا.

منحنى ELISA القياسي
​​
منحنى المعيار أو المعايرة هو عنصر ELISA الكمي الذي سيسمح بحساب تركيز المستضد في العينة.
يُشتق المنحنى القياسي من رسم تركيزات معروفة لمولد ضد مرجعي مقابل القراءة التي تم الحصول عليها لكل تركيز (عادةً كثافة بصرية عند 450 نانومتر).
معظم أجهزة قراءة لوحات ELISA ستدمج برنامجًا لتركيب المنحنى وتحليل البيانات. يتم حساب تركيز المستضد في العينة عن طريق استقراء الجزء الخطي من المنحنى القياسي.

شكل 1: مثال لمنحنى معياري ELISA كمي من Human ICAM1 SimpleStep ELISA® Kit (ab174445).

برنامج تركيب المنحنى السماح باستخدام نماذج مختلفة لرسم بياناتك.


كيف يمكنني ملاءمة A595 لعيناتي غير المعروفة للبيانات؟ - مادة الاحياء

كيمياء المياه 2: القياس الطيفي والمنحنيات القياسية

المنحنيات القياسية عبارة عن رسوم بيانية لامتصاص الضوء مقابل تركيز المحلول والتي يمكن استخدامها لمعرفة تركيز المادة المذابة في عينات غير معروفة. قمنا بإنشاء منحنى قياسي لمجموعة من عينات الألبومين.

تفسير المنحنى القياسي

يقيس مقياس الطيف الضوئي كمية الضوء. يخبرك مقدار الضوء الذي يمر عبر المحلول (النفاذية) أو مقدار الضوء الذي يمتصه المحلول (امتصاص).

إذا قمت بالرسم البياني للامتصاصية مقابل التركيز لسلسلة من الحلول المعروفة ، فإن الخط ، أو المنحنى القياسي، التي تتناسب مع نقاطك ، يمكن استخدامها لمعرفة تركيزات حل غير معروف. يتم وضع الامتصاصية ، المتغير التابع ، على المحور الصادي (المحور الرأسي). التركيز ، المتغير المستقل (لأنه تم تعيينه بواسطتك عند إعداد التجربة) ، يتم رسمه على المحور x. عندما تقيس امتصاص عينة غير معروفة ، ابحث عن قيمة y على المنحنى القياسي. ثم تتبع لأسفل لترى التركيز الذي يتوافق معه. مرر الماوس فوق الرسم البياني أدناه لمشاهدة مثال على ذلك.

يوجد أدناه منحنى قياسي تم إنشاؤه من بيانات الامتصاص مشابه لما أنشأناه في الفصل. لاحظ أنه مع زيادة التركيز ، تزداد الامتصاصية أيضًا. بينما يمكنك تقدير تركيز المجهول بمجرد النظر إلى الرسم البياني ، هناك طريقة أكثر دقة لتحديد التركيز لاستخدام معادلة الخط الذي يناسب نقاط البيانات الخاصة بك. هذه المعادلة معطاة بصيغة تقاطع y: y = mx + b
حيث m هو ميل الخط و b هو تقاطع y (حيث يلمس الخط المحور y).

يمكن ترجمة المعادلة y = mx + b هنا كـ & quotabsorbance يساوي الانحدار مضروبًا في التركيز بالإضافة إلى قيمة امتصاص تقاطع y. & quot يتم توفير المنحدر وتقاطع y عندما يلائم الكمبيوتر خطًا لبيانات المنحنى القياسية الخاصة بك. الامتصاص (أو y) هو ما تقيسه من المجهول. لذا ، كل ما عليك فعله هو إدخال هذه الأرقام الثلاثة في المعادلة وحلها من أجل x (التركيز).

مثال: الامتصاص المجهول (y) هو 6.00
بناءً على المنحنى أدناه ، الميل (م) = 8 و ب = 0
إذا كانت y = mx + b فإن 6.00 = 8 * x + 0
و 6/8 = س
و 0.75 = س
لذا فإن تركيز المجهول سيكون 75٪ من المخزون الأصلي والذي كان 100 ميكروغرام / مل. 75٪ من 100 ميكروغرام / مل = 75 ميكروغرام / مل تركيز.

الوحدات الموجودة على الرسم البياني أدناه هي الامتصاص (ص) مقابل عامل التخفيف (س) لكل محلول مستخدم (0 = ماء إلى 1 = مخزون غير مخفف).


استخدام معادلة الخط لحساب قيم عينة غير معروفة

إذن لديك الآن معادلة الخط المستقيم. لتحديد قيم غير معروفة بناءً على ذلك ، لذلك في هذا المثال ، سيتم استخدام قيم امتصاص مصححة في الخلفية لعينات غير معروفة ('ذ) لحساب تركيز البروتين الكلي ("x") ، عليك إعادة تنظيم المعادلة لتحديد ماx' يكون. لنفعل هذا في المثال:

الآن يمكنك فقط استخدام المعادلة المعاد ترتيبها لإدخالذ"القيم من أجل العمل"x'. على سبيل المثال ، لنفترض أن لدينا عينة لا نعرف تركيز البروتين الكلي فيها. نقيس امتصاص العينة عند 562 نانومتر ونطرح قيمة الخلفية لحساب إشارة الخلفية. تحتوي العينة على امتصاص مصحح في الخلفية لـ0.497'. سيكون هذاذ"القيمة في المعادلة. إدخال هذا سيعطي:

لذا ، فإن تركيز البروتين الكلي للعينة غير المعروفة هو "550.33 ميكروغرام / مل‘.


منحنيات المعايرة

تُستخدم منحنيات المعايرة لفهم الاستجابة الآلية لتحليلها والتنبؤ بالتركيز في عينة غير معروفة. بشكل عام ، يتم إجراء مجموعة من العينات القياسية بتركيزات مختلفة بنطاق يتضمن غير معروف الفائدة ويتم تسجيل الاستجابة الآلية عند كل تركيز. لمزيد من الدقة وفهم الخطأ ، يمكن تكرار الاستجابة عند كل تركيز بحيث يتم الحصول على شريط خطأ. ثم تتلاءم البيانات مع وظيفة بحيث يمكن التنبؤ بالتركيزات غير المعروفة. Typically the response is linear, however, a curve can be made with other functions as long as the function is known. The calibration curve can be used to calculate the limit of detection and limit of quantitation.

When making solutions for a calibration curve, each solution can be made separately. However, that can take a lot of starting material and be time consuming. Another method for making many different concentrations of a solution is to use serial dilutions. With serial dilutions, a concentrated sample is diluted down in a stepwise manner to make lower concentrations. The next sample is made from the previous dilution, and the dilution factor is often kept constant. The advantage is that only one initial solution is needed. The disadvantage is that any errors in solution making—pipetting, massing, etc.—get propagated as more solutions are made. Thus, care must be taken when making the initial solution.

مبادئ

Calibration curves can be used to predict the concentration of an unknown sample. To be completely accurate, the standard samples should be run in the same matrix as the unknown sample. A sample matrix is the components of the sample other than the analyte of interest, including the solvent and all salts, proteins, metal ions, etc. that might be present in the sample. In practice, running calibration samples in the same matrix as the unknown is sometimes difficult, as the unknown sample may be from a complex biological or environmental sample. Thus, many calibration curves are made in a sample matrix that closely approximates the real sample, such as artificial cerebral spinal fluid or artificial urine, but may not be exact. The range of concentrations of the calibration curve should bracket that in the expected unknown sample. Ideally a few concentrations above and below the expected concentration sample are measured.

Many calibration curves are linear and can be fit with the basic equation y=mx+b, where m is the slope and b is the y-intercept. However, not all curves are linear and sometimes to get a line, one or both set of axes will be on a logarithmic scale. Linear regression is typically performed using a computer program and the most common method is to use a least squares fitting. With a linear regression analysis, an R 2 value, called the coefficient of determination, is given. For a simple single regression, R 2 is the square of the correlation coefficient (r) and provides information about how far away the y values are from the predicted line. A perfect line would have an R 2 value of 1, and most R 2 values for calibration curves are over 0.95. When the calibration curve is linear, the slope is a measure of sensitivity: how much the signal changes for a change in concentration. A steeper line with a larger slope indicates a more sensitive measurement. A calibration curve can also help define the linear range, the range of concentrations that the instrument gives a linear response. Outside this range, the response may taper off due to instrumental considerations, and the equation from the calibration cannot be used. This is known as the limit of linearity.

Limit of detection is the lowest amount that can be statistically determined from the noise. Generally this is defined as a signal that is 3 times the noise. The limit of detection can be calculated from the slope of the calibration curve and is generally defined as LOD=3*S.D./m, where S.D. is the standard deviation of the noise. The noise is measured by taking the standard deviation of multiple measurements. Alternatively, in one trace, noise can be estimated as the standard deviation of the baseline. The limit of quantitation is the amount that can be differentiated between samples and is usually defined as 10 times the noise.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

إجراء

1. Making the Standards: Serial Dilutions

  1. Make a concentrated stock solution of the standard. Typically, the compound is accurately weighed out and then quantitatively transferred into a volumetric flask. Add some solvent, mix so the sample dissolves, then fill to the line with the proper solvent.
  2. Perform serial dilutions. Take another volumetric flask and pipette the amount of standard needed for the dilution, then fill to the line with solvent and mix. A ten-fold dilution is typically made, so for a 10-mL volumetric flask, add 1 mL of the previous dilution.
  3. Continue as needed for more dilutions, pipetting from the previous solution to dilute it to make the next sample. For a good calibration curve, at least 5 concentrations are needed.

2. Run the Samples for the Calibration Curve and the Unknown

  1. Run the samples with the UV-Vis spectrophotometer to determine the instrumental response needed for the calibration curve.
  2. Take the reading with the first sample. It is a good idea to run the samples in random order (بمعنى آخر. not highest to lowest or lowest to highest) in case there are any systematic errors. In order to get an estimate of noise, repeat the reading on any given sample 3𔃃x.
  3. Run the additional standard samples, repeating the measurements for each sample to get an estimate of noise. Record the data to make a plot later.
  4. Run the unknown sample(s). Use as similar conditions to running the standards as possible. Thus, the sample matrix or buffer should be the same, the pH should be the same, and the concentration should be in the range of the standards run.

3. Making the Calibration Curve

  1. Record the data in a spreadsheet and use a computer program to plot the data vs concentration. If at least triplicate measurements were taken for each point, error bars can be plotted of the standard deviation of those measurements to estimate of the error of each point. For some curves, the data might need to be plotted with an axis as a log to get a line. The equation that governs the calibration curve is generally known ahead of time, so a log-plot is used when there is a log in the equation.
  2. Examine the calibration curve. Does it look linear? Does it have a portion that looks non-linear (بمعنى آخر. reached the limit of the instrumental response)? To check, fit all the data to a linear regression using the software. If the coefficient of determination (R 2 ) is not high, remove some of the points at the beginning or ending of the curve that do not appear to fit the line and perform the linear regression again. It is not acceptable to remove points in the middle just because they have a large error bar. From this analysis, decide what portion of the curve is linear.
  3. The output of the linear should be an equation of the format y=mx+b, where m is the slope and b is the y-intercept. The units for the slope are the y-axis unit/concentration, in this example (شكل 1) absorbance/μM. The units for the y-intercept are the y-axis units. A coefficient of determination (R 2 ) is obtained. The higher the R 2 the better the fit a perfect fit gives an R 2 of 1. The program may also be able to give an estimate of the error on the slope and the intercept.

4. Results: Calibration Curve of Absorbance of Blue Dye #1

  1. The calibration curve for absorbance of blue dye #1 (at 631 nm) is shown below (شكل 1). The response is linear from 0 to 10 µM. Above that concentration the signal begins to level off because the response is out of the linear range of the UV-Vis spectrophotometer.
  2. Calculate the LOD. From the slope of the calibration curve, the LOD is 3*S.D. (noise)/m. For this calibration curve, the noise was obtained by taking a standard deviation of repeated measurements and was 0.021. The LOD would be 3*0.021/.109=0.58 µM.
  3. Calculate the LOQ. The LOQ is 10*S.D.(noise)/m. For this calibration curve, LOQ is 10*0.021/.109 =1.93 µM.
  4. Calculate the concentration of the unknown. Use the line equation to calculate the concentration of the unknown sample. The calibration curve is only valid if the unknown falls into the linear range of the standard samples. If the readings are too high, dilution might be necessary. In this example, the unknown sports drink was diluted 1:1. The absorbance was 0.243 and this corresponded to a concentration of 2.02 µM. Thus the final concentration of blue dye #1 in the in the sports drink was 4.04 µM.


Figure 1. Calibration curves for UV-Vis absorbance of blue dye. اليسار: The absorbance was measured of different concentrations of blue dye #1. The responses level off after 10 µM, when the absorbance is over 1. The error bars are from repeated measurements of the same sample and are standard deviations. Right: The linear portion of the calibration curve is fit with a line, y=0.109*x + 0.0286. The unknown data is shown in black. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Calibration curves are used to understand the instrumental response to an analyte, and to predict the concentration of analyte in a sample.

A calibration curve is created by first preparing a set of standard solutions with known concentrations of the analyte. The instrument response is measured for each, and plotted vs. concentration of the standard solution. The linear portion of this plot can then be used to predict the concentration of a sample of the analyte, by correlating its response to concentration.

This video will introduce calibration curves and their use, by demonstrating the preparation of a set of standards, followed by the analysis of a sample with unknown concentration.

A set of standard solutions is used to prepare the calibration curve. These solutions consist of a range of concentrations that encompass the approximate concentration of the analyte. 

Standard solutions are often prepared with a serial dilution. A serial dilution is performed by first preparing a stock solution of the analyte. The stock solution is then diluted by a known amount, often one order of magnitude. The new solution is then diluted in the same manner, and so on. This results in a set of solutions with concentrations ranging over several orders of magnitude.

The calibration curve is a plot of instrumental signal vs. concentration. The plot of the standards should be linear, and can be fit with the equation y=mx+b. The non-linear portions of the plot should be discarded, as these concentration ranges are out of the limit of linearity.

The equation of the best-fit line can then be used to determine the concentration of the sample, by using the instrument signal to correlate to concentration. Samples with measurements that lie outside of the linear range of the plot must be diluted, in order to be in the linear range.

The limit of detection of the instrument, or the lowest measurement that can be statistically determined over the noise, can be calculated from the calibration curve as well. A blank sample is measured multiple times. The limit of detection is generally defined as the average blank signal plus 3 times its standard deviation.

Finally, the limit of quantification can also be calculated. The limit of quantification is the lowest amount of analyte that can be accurately quantified. This is calculated as 10 standard deviations above the blank signal.

Now that you've learned the basics of a calibration curve, let's see how to prepare and use one in the laboratory.

First, prepare a concentrated stock solution of the standard. Accurately weigh the standard, and transfer it into a volumetric flask. Add a small amount of solvent, and mix so that the sample dissolves. Then, fill to the line with solvent. It is important to use the same solvent as the sample.

To prepare the standards, pipette the required amount in the volumetric flask. Then fill the flask to the line with solvent, and mix. 

Continue making the standards by pipetting from the stock solution and diluting. For a good calibration curve, at least 5 concentrations are needed.

Now, run samples with the analytical instrument, in this case a UV-Vis spectrophotometer, in order to determine the instrumental response needed for the calibration curve.

Take the measurement of the first standard. Run the standards in random order, in case there are any systematic errors. Measure each standard 3𔃃x to get an estimate of noise.

Measure the rest of the standards, repeating the measurements for each. Record all data.

Finally, run the sample. Use the same sample matrix and measurement conditions as were used for the standards. Make sure that the sample is within the range of the standards and the limit of the instrument.

To construct the calibration curve, use a computer program to plot the data as signal vs. concentration. Use the standard deviation of the repeated measurements for each data point to make error bars.

Remove portions of the curve that are non-linear, then perform a linear regression and determine the best-fit line. The output should be an equation in the form y = m x + b. An R 2 -value near 1 denotes a good fit.

This is the calibration curve for blue dye #1, measured at 631 nm. The response is linear between 0 and 15 mM.

Calculate the concentration of the sample using the equation of the best-fit line. The absorbance for the sample was 0.141, and corresponded to a concentration of 6.02 mM.

Now that you've seen how a calibration curve can be used with a UV-Vis spectrophotometer, let's take a look at some other useful applications.

Calibration curves are often used with electrochemistry applications, as the electrode signal must be calibrated to the concentration of ions in the solution. In this example, data were collected for an ion-selective electrode for fluoride.

The concentration data must be plotted on the log scale to obtain a line. This calibration curve can be used to measure the concentration of fluoride in a solution, such as toothpaste or drinking water.

High-performance liquid chromatography, or HPLC, is a separation and analysis technique that is used heavily in analytical chemistry. HPLC separates components of a mixture based on the time required for the molecules to travel the length of the chromatography column. This time varies depending on a range of chemical properties of the molecules.

The elution of the molecules is measured using a detector, resulting in a chromatogram. The peak area can be correlated to concentration using a simple calibration curve of a range of standard solutions, like in this example of popular soda ingredients.

In some cases, where the solution matrix interferes with the measurement of the solute, a classical calibration curve can be inaccurate. In those cases, a modified calibration curve is prepared. For this, a range of standard solution volumes is added to the sample. The signal to concentration plot is created, where the x intercept is equal to the original concentration of the sample solution. For more detail on this technique, please watch the JoVE science education video, "The method of standard addition".

You've just watched JoVE's introduction to the calibration curve. You should now understand where the calibration curve is used, how to create it, and how to use it to calculate concentrations of samples.

كما هو الحال دائما، وذلك بفضل لمشاهدة!

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

Applications and Summary

Calibration curves are used in many fields of analytical chemistry, biochemistry, and pharmaceutical chemistry. It is common to use them with spectroscopy, chromatography, and electrochemistry measurements. A calibration curve can be used to understand the concentration of an environmental pollutant in a soil sample. It could be used determine the concentration of a neurotransmitter in a sample of brain fluid, vitamin in pharmaceutical samples, or caffeine in food. Thus, calibration curves are useful in environmental, biological, pharmaceutical, and food science applications. The most important part of making a calibration curve is to make accurate standard samples that are in a matrix that closely approximates the sample mixture.

An example of an electrochemistry calibration curve is shown below (الشكل 2). The data were collected with an ion-selective electrode for fluoride. Electrochemical data follow the Nernst equation E=E 0 + 2.03*R*T/(nF) * log C. Thus, the concentration data (x-axis) must be plotted on a log scale to obtain a line. This calibration curve could be used to measure the concentration of fluoride in toothpaste or drinking water.


Figure 2. Calibration curve for an ion-selective electrode. The response of a fluoride selective electrode (in mV) to different concentrations of fluoride is plotted. The expected equation for the electrode response is y (in mV)=-59.2*log x+b at 25 °C. The actual equation is y=-57.4*log x +56.38. The R 2 value is 0.998. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الاشتراك المطلوبة. يرجى التوصية بـ JoVE لأمين المكتبة الخاص بك.

كشف الدرجات

Calibration curves are used to understand the instrumental response to an analyte, and to predict the concentration of analyte in a sample.

A calibration curve is created by first preparing a set of standard solutions with known concentrations of the analyte. The instrument response is measured for each, and plotted vs. concentration of the standard solution. The linear portion of this plot can then be used to predict the concentration of a sample of the analyte, by correlating its response to concentration.

This video will introduce calibration curves and their use, by demonstrating the preparation of a set of standards, followed by the analysis of a sample with unknown concentration.

A set of standard solutions is used to prepare the calibration curve. These solutions consist of a range of concentrations that encompass the approximate concentration of the analyte.

Standard solutions are often prepared with a serial dilution. A serial dilution is performed by first preparing a stock solution of the analyte. The stock solution is then diluted by a known amount, often one order of magnitude. The new solution is then diluted in the same manner, and so on. This results in a set of solutions with concentrations ranging over several orders of magnitude.

The calibration curve is a plot of instrumental signal vs. concentration. The plot of the standards should be linear, and can be fit with the equation y=mx+b. The non-linear portions of the plot should be discarded, as these concentration ranges are out of the limit of linearity.

The equation of the best-fit line can then be used to determine the concentration of the sample, by using the instrument signal to correlate to concentration. Samples with measurements that lie outside of the linear range of the plot must be diluted, in order to be in the linear range.

The limit of detection of the instrument, or the lowest measurement that can be statistically determined over the noise, can be calculated from the calibration curve as well. A blank sample is measured multiple times. The limit of detection is generally defined as the average blank signal plus 3 times its standard deviation.

Finally, the limit of quantification can also be calculated. The limit of quantification is the lowest amount of analyte that can be accurately quantified. This is calculated as 10 standard deviations above the blank signal.

Now that you've learned the basics of a calibration curve, let's see how to prepare and use one in the laboratory.

First, prepare a concentrated stock solution of the standard. Accurately weigh the standard, and transfer it into a volumetric flask. Add a small amount of solvent, and mix so that the sample dissolves. Then, fill to the line with solvent. It is important to use the same solvent as the sample.

To prepare the standards, pipette the required amount in the volumetric flask. Then fill the flask to the line with solvent, and mix.

Continue making the standards by pipetting from the stock solution and diluting. For a good calibration curve, at least 5 concentrations are needed.

Now, run samples with the analytical instrument, in this case a UV-Vis spectrophotometer, in order to determine the instrumental response needed for the calibration curve.

Take the measurement of the first standard. Run the standards in random order, in case there are any systematic errors. Measure each standard 3–5x to get an estimate of noise.

Measure the rest of the standards, repeating the measurements for each. Record all data.

Finally, run the sample. Use the same sample matrix and measurement conditions as were used for the standards. Make sure that the sample is within the range of the standards and the limit of the instrument.

To construct the calibration curve, use a computer program to plot the data as signal vs. concentration. Use the standard deviation of the repeated measurements for each data point to make error bars.

Remove portions of the curve that are non-linear, then perform a linear regression and determine the best-fit line. The output should be an equation in the form y = m x + b. An R2-value near 1 denotes a good fit.

This is the calibration curve for blue dye #1, measured at 631 nm. The response is linear between 0 and 15 mM.

Calculate the concentration of the sample using the equation of the best-fit line. The absorbance for the sample was 0.141, and corresponded to a concentration of 6.02 mM.

Now that you've seen how a calibration curve can be used with a UV-Vis spectrophotometer, let's take a look at some other useful applications.

Calibration curves are often used with electrochemistry applications, as the electrode signal must be calibrated to the concentration of ions in the solution. In this example, data were collected for an ion-selective electrode for fluoride.

The concentration data must be plotted on the log scale to obtain a line. This calibration curve can be used to measure the concentration of fluoride in a solution, such as toothpaste or drinking water.

High-performance liquid chromatography, or HPLC, is a separation and analysis technique that is used heavily in analytical chemistry. HPLC separates components of a mixture based on the time required for the molecules to travel the length of the chromatography column. This time varies depending on a range of chemical properties of the molecules.

The elution of the molecules is measured using a detector, resulting in a chromatogram. The peak area can be correlated to concentration using a simple calibration curve of a range of standard solutions, like in this example of popular soda ingredients.

In some cases, where the solution matrix interferes with the measurement of the solute, a classical calibration curve can be inaccurate. In those cases, a modified calibration curve is prepared. For this, a range of standard solution volumes is added to the sample. The signal to concentration plot is created, where the x intercept is equal to the original concentration of the sample solution. For more detail on this technique, please watch the JoVE science education video, "The method of standard addition".

You've just watched JoVE's introduction to the calibration curve. You should now understand where the calibration curve is used, how to create it, and how to use it to calculate concentrations of samples.


شاهد الفيديو: Using Standard Curve to Estimate DNA Quantity - Forensic Focus #4 (أغسطس 2022).