معلومة

استكشاف أخطاء SDS-PAGE من BSA المعالج بالتريبسين وإصلاحها

استكشاف أخطاء SDS-PAGE من BSA المعالج بالتريبسين وإصلاحها



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أعمل حاليًا على تقنية SDS-PAGE التي تحتوي على تركيز 20٪ من مادة الأكريلاميد لبروتين BSA المتحلل بالماء. أرفقت هنا صورة جل لـ BSA المتحلل بالتريبسين. لا أعلم هل هي نتيجة جيدة وكيف فسرت هذه النتيجة؟


سوف أتعامل مع هذا على أنه سؤال واجب منزلي جزئي ولكن سأقدم بعض الإرشادات حول كيفية معالجة سؤالك والحصول على نظرية قوية لدعمه. يشق الكيموتريبسين بشكل تفضيلي روابط الببتيد أميد حيث يكون جانب الكربوكسيل من رابطة الأميد (موضع P1) عبارة عن حمض أميني كبير مسعور (التيروزين ، التربتوفان ، الفنيل ألانين). لذا فإن أحد الحلول التي يستخدمها غالبًا علماء الأحياء التجريبيون (مثلي) الذين يقومون بإجراء قياس الطيف الكتلي (MS) هو وضع تسلسل البروتين الخاص بهم (في هذه الحالة BSA) في خوارزمية مثل PeptideCutter (من ExPASy) ، والتي تقوم بإجراء ملخص نظري لـ بعد أن اختار تسلسل البروتين الإنزيم المطلوب أو مجموعة الإنزيمات) وشاهد ما من شظايا الببتيد المتوقع إنتاجها وحدد طولها / وزنها الجزيئي وقارن ذلك ببياناتك التجريبية.

بعد إلقاء نظرة أولية ، لاحظت أن علامة / سلم البروتين الخاص بك مفقود ، وهو أمر مهم جدًا في معرفة أحجام الببتيد المنتجة! وأيضًا ما هي الممرات من 1 إلى 8؟ هل هم تركيز مختلف من الانزيمات؟ إذا كان الأمر كذلك ، فهذا يبدو جيدًا بالنسبة لي لأنه كلما زاد تركيز الإنزيم من اليسار إلى اليمين ، زادت كمية منتجات الهضم لديك. إذا كانت أحجام الببتيد التي تم الحصول عليها غير المتوقعة ، فربما تزيد أو تقلل من وقت الهضم لأنك قد تواجه مشكلة إما بسبب الهضم غير الكامل أو الهضم غير المحدد ، حسب. أعتقد أن تركيز الجل مناسبًا نظرًا لأن BSA MW يبلغ 66 كيلو دالتون تقريبًا نظرًا لأن لديك مشكلة مع الجل بنسبة 15٪ نظرًا لأن المنتجات صغيرة جدًا وفيرة جدًا بحيث يتعذر حلها.


COmplete ™ بروتوكول عمود التنقية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

تتوافق أعمدة تنقية علاماته الكاملة (رقم المنتج COHISC-RO) مع أنظمة الكروماتوغرافيا الآلية مثل ÄKTAexplorer.

تنقية في ظل الظروف الأصلية

يجب إجراء تنقية البروتينات الأصلية باستخدام الظروف العازلة المثلى للبروتين المستهدف. المخازن المؤقتة الموصى بها في هذه الوثيقة هي أمثلة راسخة ويمكن تكييفها لتحقيق الظروف المثلى لبروتين مستهدف محدد.
توفر أعمدة التنقية الخاصة بعلاماته مرونة في اختيار ظروف المخزن المؤقت المثلى.
تحذير: قد تنخفض سعة الربط بشكل كبير إذا كان تكوين المخزن المؤقت دون المستوى الأمثل.
ملحوظة: للحصول على أفضل النتائج ، قم بتحميله بمعدل تدفق منخفض لربط البروتينات المستهدفة بشكل أكثر كفاءة بالراتنج.
تحذير: تم تحسين أعمدة تنقية العلامة الخاصة به cOmplete باستخدام العازلة أ و العازلة ب المحدد في الجدول أدناه. قد تعمل المخازن المؤقتة الأخرى أيضًا ، ولكن يجب اختبارها قبل استخدامها مع أعمدة تنقية العلامة الخاصة به cOmplete.
العازلة أ: 50 ملي ناه2ص4، الرقم الهيدروجيني 8.0 300 ملي كلوريد الصوديوم
العازلة ب: 50 ملي ناه2ص4، درجة الحموضة 8.0 300 ملي كلوريد الصوديوم 250 ملي إيميدازول
ملحوظة: يصف البروتوكول التالي الإجراءات التجريبية عند استخدام نظام ÄKTAexplorer 100 (Cytiva) لتنقية FPLC.

  1. اغسل المضخة بـ 10 إلى 20 مل العازلة أ باستخدام غسل النظام وظيفة نظام اكسبلورر ÄKTA بمعدل تدفق 10 مل / دقيقة. تأكد من إزاحة كل الهواء من مضخات وأنابيب النظام.
  2. قم بإزالة القابس الموجود في مخرج العمود وقم بتوصيله بأنبوب مخرج نظام ÄKTAexplorer System. ملحوظة: احفظ قابس مخرج العمود في حالة احتياج العمود إلى التخزين أو التخطيط لإعادة استخدامه.
  3. في أقرب وقت العازلة أ ينفد من أنبوب مدخل نظام ÄKTAexplorer System ، قم بإزالة السدادة العلوية من العمود وقم على الفور بتوصيلها بأنبوب مدخل نظام ÄKTAexplorer System. باستمرار قياس OD280 القيم على نظام ÄKTAexplorer. ملحوظة: إذا تمت تنقية البروتين الفلوري ، فقم بقياس قيم OD باستمرار عند أقصى امتصاص لصبغة التألق على سبيل المثال ، التطوير التنظيمي485 بالنسبة لـ GFP (البروتين الفلوري الأخضر) أو OD435 ل CFP (بروتين فلوري سماوي). ملحوظة: احفظ قابس مدخل العمود في حالة احتياج العمود إلى التخزين أو التخطيط لإعادة استخدامه.
  4. حدد معدل التدفق على أنه 10 مل / دقيقة لعمود 5 مل أو 2 مل / دقيقة لعمود 1 مل وقم بموازنة العمود بـ 10 مجلدات من الأعمدة العازلة أ.
  5. وقفة الجري. قم بتحميل العينة التي تم مسحها (على سبيل المثال، بعد خطوة تنبيذ فائق أو ترشيح) على العمود بمعدل تدفق حجمي يبلغ 2.5 مل / دقيقة لعمود 5 مل أو 0.5 إلى 1 مل / دقيقة لعمود 1 مل. تحذير: لمنع انسداد العمود ، قم بإزالة المواد غير القابلة للذوبان قبل تحميل العمود. تحذير: نظرًا لأن خصوصية الارتباط للراتنج عالية ، فإن حركية التصاق البروتين بالراتنج تكون أبطأ من الراتنجات الأخرى المتاحة. في حالة استخدام معدلات تدفق حجمية عالية للتحميل ، يمكن أن ينخفض ​​إنتاج البروتين.
  6. اغسل العمود مع المخزن المؤقت A حتى OD280 تصل القيمة إلى مستوى خط الأساس (حوالي 10 أحجام أعمدة).
  7. أزل البروتين ذي الوسم بتدرج العازلة أ (بدون إيميدازول) و العازلة ب (250 ملي إيميدازول). تحذير: يمكن توقع قمم البروتين بين 25 إلى 45 ملي إيميدازول. نظرًا للخصائص المحددة لأعمدة تنقية علاماته الكاملة ، يمكن بالفعل استخلاص البروتين باستخدام ما يقرب من 25 ملي إيميدازول. تحذير: تعتمد كمية الإيميدازول المطلوبة في المخزن المؤقت للشطف للإفراج الفعال للبروتين المستهدف من الراتينج على معايير مختلفة ، مثل: • طول علامة His ، • إمكانية الوصول إلى علامة His.
  8. اغسل وقم بالتوازن للتشغيل التالي. لمزيد من التفاصيل ، راجع القسم إجراءات التنظيف. تحذير: إذا لم يتم إعادة استخدام العمود على الفور ، فقم بتنظيف العمود باستخدام حجمي عمود من 2 م إيميدازول لإزالة الارتباط غير المحدد للبروتينات. قم بمعايرة العمود في محلول إيثانول بنسبة 20٪ وأغلق العمود بإحكام في كل من الخيوط باستخدام المقابس. يخزن في درجة حرارة +2 إلى +8 درجة مئوية لمنع نمو الخلايا.

ملحوظة:الرجوع إلى الأقسام تنقية عملية التحسين و استكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على المشورة الفنية في تحسين نتائج التنقية.

تنقية تحت ظروف تغيير الطبيعة

يجب إجراء تنقية البروتينات المشوهة باستخدام الظروف العازلة المثلى للبروتين المستهدف. المخازن المؤقتة الموصى بها في هذه الوثيقة هي أمثلة راسخة ويمكن تكييفها لتحقيق الظروف المثلى لبروتين مستهدف محدد.
توفر أعمدة التنقية الخاصة بعلاماته مرونة في اختيار ظروف المخزن المؤقت المثلى.
تفسد البروتين أو تذوب الأجسام المتضمنة في مخزن مؤقت يحتوي على 6 M guanidinium-HCl أو 8 M من اليوريا.
تحذير:ستؤدي إضافة اليوريا إلى المحاليل المخزنة إلى انخفاض الرقم الهيدروجيني. من الضروري ضبط الرقم الهيدروجيني للعازل باستخدام هيدروكسيد الصوديوم بعد إضافة اليوريا.
تحذير: قد تنخفض أيضًا سعة الربط بشكل كبير إذا كان تكوين المخزن المؤقت دون المستوى الأمثل.
ملحوظة: للحصول على أفضل النتائج ، قم بتحميله بمعدل تدفق منخفض لربط البروتينات المستهدفة بشكل أكثر كفاءة بالراتنج.
تحذير: تم تحسين أعمدة تنقية العلامة الخاصة به cOmplete باستخدام العازلة ج, العازلة د, العازلة ه، و العازلة F المحدد في الجدول أدناه. قد تعمل المخازن المؤقتة الأخرى أيضًا ، ولكن يجب اختبارها قبل استخدامها مع أعمدة تنقية العلامة الخاصة به cOmplete.
العازلة ج: 100 ملي ص2ص4 10 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك 8 م اليوريا 8.0 درجة الحموضة
العازلة D: 100 ملي ص2ص4 10 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك 8 م اليوريا 6.3 درجة الحموضة
العازلة ه: 100 ملي ص2ص4 10 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك 8 م اليوريا الرقم الهيدروجيني 5.9
العازلة F: 100 ملي ص2ص4 10 ملي تريس- حمض الهيدروكلوريك 8 م اليوريا الرقم الهيدروجيني 4.5
ملحوظة: يصف البروتوكول التالي الإجراءات التجريبية عند استخدام نظام ÄKTAexplorer 100 System (Cytiva) لتنقية FPLC.

  1. اغسل المضخة بـ 10 إلى 20 مل العازلة ج باستخدام غسل النظام وظيفة نظام الاستكشاف ÄKTA بمعدل تدفق ، على سبيل المثال، 10 مل / دقيقة. تأكد من إزاحة كل الهواء من مضخات وأنابيب النظام.
  2. قم بإزالة القابس الموجود في مخرج العمود وقم بتوصيله بأنبوب مخرج نظام ÄKTAexplorer System. ملحوظة: احفظ قابس مخرج العمود في حالة احتياج العمود إلى التخزين أو إعادة استخدامه.
  3. في أقرب وقت العازلة ج ينفد من أنبوب مدخل نظام ÄKTAexplorer System ، قم بإزالة السدادة العلوية من العمود وقم على الفور بتوصيلها بأنبوب مدخل نظام ÄKTAexplorer System. باستمرار قياس OD280 القيم على نظام ÄKTAexplorer. ملحوظة: إذا تمت تنقية البروتين الفلوري ، فقم بقياس قيم OD باستمرار عند أقصى امتصاص لصبغة التألق على سبيل المثال، OD485 بالنسبة لـ GFP (البروتين الفلوري الأخضر أو ​​OD435 ل CFP (بروتين فلوري سماوي). ملحوظة: احفظ قابس مدخل العمود في حالة احتياج العمود إلى التخزين أو إعادة استخدامه.
  4. حدد معدل التدفق على أنه 10 مل / دقيقة لعمود 5 مل أو 2 مل / دقيقة لعمود 1 مل وقم بموازنة العمود بـ 10 مجلدات من الأعمدة العازلة ج.
  5. وقفة الجري. قم بتحميل العينة التي تم مسحها (على سبيل المثال، بعد خطوة تنبيذ فائق أو ترشيح) على العمود بمعدل تدفق حجمي يبلغ 2.5 مل / دقيقة لعمود 5 مل أو 0.5 إلى 1 مل / دقيقة لعمود 1 مل. تحذير: لمنع انسداد العمود ، قم بإزالة المواد غير القابلة للذوبان قبل تحميل العمود. تحذير: نظرًا لأن خصوصية الارتباط للراتنج عالية ، فإن حركية التصاق البروتين بالراتنج تكون أبطأ من الراتنجات الأخرى المتاحة. في حالة استخدام معدلات تدفق حجمية عالية للتحميل ، يمكن أن ينخفض ​​إنتاج البروتين.
  6. اغسل العمود باستخدام العازلة ج حتى التطوير التنظيمي280 تصل القيمة إلى مستوى خط الأساس (حوالي 10 أحجام أعمدة).
  7. يغسل بـ 10 إلى 20 حجم عمود من العازلة د.
  8. يغسل بـ 10 إلى 20 حجم عمود من العازلة E.
  9. أزل البروتين الذي يحمل علامة His مع 10 إلى 20 مجلدات عمود العازلة F. ملحوظة: بدلاً من ذلك ، يمكن أيضًا إجراء الشطف باستخدام تدرج يصل إلى 200 ملي مولار من محلول إيميدازول العازلة أ و العازلة ب بدلاً من خيار تغيير الأس الهيدروجيني (راجع خطوة الشطف داخل القسم تنقية في ظل الظروف الأصلية).
  10. اغسل وقم بالتوازن للتشغيل التالي في ظل ظروف تغيير الطبيعة مع العازلة ج أو تغسل به العازلة أ لإزالة عوامل تغيير الطبيعة إذا كان سيتم استخدام العمود بعد ذلك في ظل الظروف الأصلية. لمزيد من التفاصيل ، راجع القسم إجراءات التنظيف. تحذير: إذا لم يتم إعادة استخدام العمود على الفور ، فقم بتنظيف العمود باستخدام حجمي عمود من 2 م إيميدازول لإزالة الارتباط غير المحدد للبروتينات. قم بمعايرة العمود في محلول إيثانول بنسبة 20٪ وأغلق العمود بإحكام في كل من الخيوط باستخدام المقابس. يخزن في درجة حرارة +2 إلى +8 درجة مئوية لمنع نمو الخلايا.

ملحوظة: الرجوع إلى القسم تنقية عملية التحسين و استكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على المشورة الفنية في تحسين نتائج التنقية.

إجراءات التنظيف

يمكن استخدام أعمدة تنقية العلامة الخاصة به عدة مرات دون فقدان سعة الربط. ومع ذلك ، بمرور الوقت ، قد تتراكم بعض مجاميع البروتين ، مما يؤدي إلى انخفاض كفاءة الراتنج داخل الأعمدة. يمكن تحديد ذلك من خلال معدل تدفق أبطأ أو ارتفاع ضغط خلفي.
تقوم إجراءات التنظيف بإزالة الركام لمزيد من الكفاءة في استخدام الأعمدة. يمكن تنفيذ إجراءات تنظيف مختلفة ، بناءً على التطبيقات المختلفة. بمجرد اكتمال إجراء التنظيف ، يجب نقل الراتينج إلى 20٪ إيثانول.

تنظيف أصلي صارم

هذه الطريقة مناسبة عندما يتم تنقية البروتينات غير المتجمعة ، وإذا تم استخدام العمود مرة أخرى لتنقية نفس البروتين.

  • يغسل ب 10 أحجام أعمدة من 1 م إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ،
  • يغسل ب 10 أحجام أعمدة من 4 م إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ،
  • قم بموازنة العمود مع المخزن المؤقت للربط وانتقل إلى الجولة التالية من التنقية أو نقل المادة إلى الإيثانول بنسبة 20٪.

تغيير طبيعة التنظيف باستخدام SDS

هذه الطريقة مناسبة لإزالة البروتينات والدهون المتجمعة.
تحذير: يجب تنفيذ إجراء التنظيف هذا عند +15 إلى +25 درجة مئوية لأن قابلية ذوبان SDS تكون أكثر فعالية عند درجة الحرارة هذه من +2 إلى +8 درجة مئوية.
ملحوظة: قد يحتوي المخزن المؤقت SDS أيضًا على 50 ملي مولار من DTT.
تحذير:تجنب استخدام K + في هذا المخزن المؤقت لمنع هطول الأمطار مع SDS.

  • يغسل ب 10 أحجام أعمدة من 1 م إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ،
  • اغسل مرتين مع 10 أحجام أعمدة من 1 م إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 20٪ إيثانول ، و 2 إلى 4٪ SDS ،
  • قم بإزالة SDS بثلاث مرات بحجم 10 عمود من الإيثانول بنسبة 20٪.

تغيير طبيعة التنظيف باستخدام Guanidinium-HCl

هذه الطريقة مناسبة لإزالة البروتينات المتجمعة.
ملحوظة:قد يحتوي المخزن المؤقت guanidinium-HCl أيضًا على 50 ملي مولار من DTT.

  • يغسل ب 10 أحجام أعمدة من 1 م إيميدازول / حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.5 ،
  • اغسل مرتين مع 10 أحجام أعمدة من 6 M guanidinium-HCl ، 1 M إيميدازول ، pH7.5 ،
  • اغسل مرتين مع 10 مجلدات عمود من الإيثانول 20٪.

ملحوظة: بشكل عام ، يعتمد اختيار طريقة التنظيف على نوع البروتين.
ملحوظة: يمثل إجراء تنظيف تغيير الطبيعة باستخدام الجوانيدينيوم-حمض الهيدروكلوريك قيودًا أقل من طريقة تنظيف تغيير الطبيعة باستخدام SDS.

تنقية عملية التحسين

قد تختلف المعلمات التي تسمح بإنتاجية البروتين القصوى ونقاوتها بشكل كبير اعتمادًا على خصائص البروتين المستهدف المحدد. لتحسين إجراء تنقية البروتين للحصول على أعلى نقاء بروتين ، حدد ظروف التشغيل المثلى للبروتين المستهدف المحدد. يعتمد كل من نقاء ومردودية تحضير البروتين على كمية العينة. إذا كانت كمية العينة عالية جدًا ، فقد لا تكون قدرة الارتباط بالراتنج كافية لربط كل البروتين المستهدف ، وسيؤدي ذلك إلى إنتاج بروتين دون المستوى الأمثل. إذا كانت كمية العينة منخفضة جدًا ، فقد تتيح مواقع الربط المتبقية على الراتينج الربط الخلفي لمكونات المحللة. يتم الحصول على أفضل النتائج عندما تتطابق كمية البروتين المستهدف مع كمية الراتنج داخل الأعمدة. تعتمد قدرة البروتين المستهدف المحدد على عدة عوامل مثل حجم البروتين المستهدف ، والتشكيل ، وحالة التعددية ، وطول وإمكانية الوصول إلى علامته ، ومستوى التعبير وقابلية الذوبان للبروتين الذي يحمل علامة His ، وتركيز المحللة ، بالإضافة إلى المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني والتكوين. للحصول على أفضل النتائج ، حدد النسبة المثلى لحجم المحللة والراتنج داخل الأعمدة المطلوبة لتنقية بروتين معين ذي أهمية ، والذي يعتمد على معدل تعبير البروتين:

  • احتضان الأعمدة بأحجام مختلفة من المحللات ، في تجارب اختبار موازية ،
  • اغسل الأعمدة وأزل البروتينات المرتبطة ،
  • تحديد كمية البروتين المستهدف في الكسور غير المقيدة وفي النذرة بواسطة SDS-PAGE ،
  • يكون حجم lysate هو الأمثل عندما تبقى كمية صغيرة فقط من البروتين المستهدف في التدفق من خلاله ويتم الكشف عن الحد الأقصى من البروتين في الكسور النذرة.

ملحوظة: يمكن تحسين عائد البروتين المستهدف من خلال إتاحة المزيد من الوقت للبروتين للارتباط بالراتنج. يمكن إجراء ذلك عن طريق تقليل معدل التدفق أثناء خطوة التحميل لتنقية الكروماتوغرافيا.
ملحوظة: يمكن أيضًا تحديد التركيز الأمثل للإيميدازول أثناء خطوات الربط والغسيل والشطف أثناء التجارب السابقة للمحاكمة.
ملحوظة: يمكن تحقيق النتائج المثلى عادةً باستخدام المحاليل المعيارية التي تحتوي على تركيز عالٍ من الملح (300 ملي مولار) عند درجة الحموضة 8.0 للبروتينات المستهدفة المتوافقة مع تلك الظروف.


نقل البروتينات عالية الوزن الجزيئي - (14 نوفمبر 2008)

أهلا
أحاول البحث عن مركب عالي الوزن الجزيئي ولكني لا أحصل على اكتشاف ثابت. أستخدم المواد الهلامية المتدرجة وغشاء PVDF لفحص مجمع 350 كيلو دالتون. في كثير من الأحيان تكون الخلفية هائلة على الرغم من وجود العصابات أيضًا. أي اقتراحات من فضلك ؟؟

تأكد من أنها تتسرب إلى مادة هلامية وليست عالقة في البئر.
-التدرج جيد.
-ركض لفترة أطول.
-غلي أو لا تغلي حسب نوع العمل.

تأكد من اكتمال التحويل.
-PVDF جيد.
- أكد عن طريق تلطيخ الجل. بونسيوس للغشاء.
- استخدم أرق الجل.
-وقت نقل أطول.
-يمكن التفكير في إضافة SDS إضافية لنقل العازلة.
- زيادة الميثانول في عازلة النقل قد تساعد أيضًا.

إذا اكتمل النقل ، فستكون مشكلة الخلفية جيدة مثل أي مشكلة غربية.
- الرجوع إلى المناقشات حول كيفية تقليل الخلفية.

لطخة باردة (4 درجات مئوية) وطويلة (بين عشية وضحاها - 24 ساعة). من الأفضل أن تحاول عدة مرات مختلفة لمعرفة الأفضل بالنسبة لك.

أنا أعمل مع بروتين عالي الوزن الجزيئي (MW 512kDa). بالنسبة لاكتشاف البروتين ، جربت هلام SDS PAGE بنسبة 5٪ ولكن البروتين عالق في الواجهة بين التراص وجل التشغيل. أنا أستخدم 1 ٪ SDS (على أساس TGS) لتشغيل هلام و 1 ٪ SDS و 20 ٪ ميثانول في المخزن المؤقت للنقل. إذا كان لدى أي شخص خبرة في العمل مع مثل هذه البروتينات عالية الوزن الجزيئي ، من فضلك أعطني اقتراحات.

يبدو واضحًا نوعًا ما ولكن لا يتعين عليك استخدام مكدس. إنها ليست ضرورية للغاية ، خاصة بالنسبة لبروتينات MW العالية ، على الرغم من أنها تجعل البروتينات الصغيرة تعمل بشكل متساوٍ. كنت سأقول أيضًا أن 5 ٪ كانت مرتفعة قليلاً بالنسبة لبروتين 500 كيلو دالتون ، قد تحتاج إلى التبديل إلى نظام جل آخر.

أود أيضًا أن أخفض تركيز الميثانول في نقلك ، فهو يقلل من الحركة أثناء النقل.

تقليل sds في المخزن المؤقت للنقل الخاص بك. أكثر من 0.05٪ سوف تتداخل مع الربط.

سيساعد الميثانول 20٪ على تجريد البروتين الدهني من البروتين للمساعدة في الارتباط ، ويمكنك تركه بمفرده إذا أردت (يمكنك تمديد وقت النقل ، إذا لزم الأمر).

اعتدنا تشغيل هلام متدرج 3.5-5٪ لبروتينات عالية ميغاواط (مع تدرج يوريا 8M-0 ، لشحذ العصابات).

أوه عظيم ، الكثير من عشاق البروتين الضخم هنا. أنا أيضا بحاجة لمساعدتكم

أحاول اكتشاف بروتين 310 كيلو دالتون. حتى الآن كنت أستخدم 6٪ جل حل و 5٪ جل تكديس ونظام عازلة Tris-glycine.
لقد قمت بتلطيخ الجل ويبدو أن هناك بروتينات و GT 250 كيلو دالتون على الجل الخاص بي (وهو أكبر بروتين في العلامة الخاصة بي). لم أقم بتلطيخ غشاء PVDF بعد النقل لأنني قرأت أن هذا قد يتداخل مع الكشف بعد ذلك (صحيح؟ خطأ؟) ، لكنني سأفعل ذلك في المرة القادمة. عانيت من مشاكل في الحجب وحصلت على جسم مضاد ثانوي لطيف للغاية يصل إلى 250 كيلو دالتون ، ولكن ليس أكثر من ذلك. لذلك أعتقد أن مشكلتي الرئيسية هي النقل.

لقد ذكرت عدم استخدام مواد هلامية التراص - هل ينطبق هذا أيضًا إذا كان بإمكاني & # 39t استخدام المواد الهلامية المتدرجة؟ هل تقترح 5٪ أو 6٪ من المواد الهلامية؟ أو حتى أقل من ذلك؟

بالنسبة للنقل ، استخدمت وحدة تنشيف شبه جافة ، لكن عندما قرأت أن هذا قد يكون دون المستوى الأمثل ، طلبت وحدة لطخة الخزان. هل لديك أي اقتراحات لمخزن نقل مؤقت جيد؟ هل SDS ضروري في المخزن المؤقت للنقل؟ يحتوي المنجم على ميثانول فقط ، لكن لا يحتوي على مادة SDS.

وسؤال واحد للحظر: عادة ما نستخدم 5٪ من مساحة سطح الجسم في TBS-T. في ورقة بيانات الجسم المضاد الأساسي الخاص بي ، يقترحون 5 ٪ مسحوق حليب في TBS-T. كيف أعقم هذا المحلول؟ قيل لي ألا أستخدم الأوتوكلاف ، لكن الترشيح كان. بعض الشيء. غير فعال

أوه عظيم ، الكثير من عشاق البروتين الضخم هنا. أنا أيضا بحاجة لمساعدتكم

أحاول اكتشاف بروتين 310 كيلو دالتون. حتى الآن كنت أستخدم 6٪ جل حل و 5٪ جل تكديس ونظام عازلة Tris-glycine.
لقد قمت بتلطيخ الجل ويبدو أن هناك بروتينات و GT 250 كيلو دالتون على الجل الخاص بي (وهو أكبر بروتين في العلامة الخاصة بي). لم أقم بتلطيخ غشاء PVDF بعد النقل لأنني قرأت أن هذا قد يتداخل مع الكشف بعد ذلك (صحيح؟ خطأ؟) ، لكنني سأفعل ذلك في المرة القادمة. عانيت من مشاكل في الحجب وحصلت على جسم مضاد ثانوي لطيف للغاية يصل إلى 250 كيلو دالتون ، ولكن ليس أكثر من ذلك. لذلك أعتقد أن مشكلتي الرئيسية هي النقل.

لقد ذكرت عدم استخدام مواد هلامية التراص - هل ينطبق هذا أيضًا إذا كان بإمكاني & # 39t استخدام المواد الهلامية المتدرجة؟ هل تقترح 5٪ أو 6٪ من المواد الهلامية؟ أو حتى أقل من ذلك؟

بالنسبة للنقل ، استخدمت وحدة تنشيف شبه جافة ، لكن عندما قرأت أن هذا قد يكون دون المستوى الأمثل ، طلبت وحدة لطخة الخزان. هل لديك أي اقتراحات لمخزن نقل مؤقت جيد؟ هل SDS ضروري في المخزن المؤقت للنقل؟ يحتوي المنجم على ميثانول فقط ، لكن لا يحتوي على مادة SDS.

وسؤال واحد للحجب: عادة ما نستخدم 5٪ من مساحة سطح الجسم في TBS-T. في ورقة بيانات الجسم المضاد الأساسي الخاص بي ، يقترحون 5 ٪ مسحوق حليب في TBS-T. كيف أعقم هذا المحلول؟ قيل لي ألا أستخدم الأوتوكلاف ، لكن الترشيح كان. بعض الشيء. غير فعال

إذا بدأت بنسبة 5-6٪ في جل الفصل ، فلن تحتاج إلى جل تكديس إذا تم استخدامه يجب أن يكون أقل من & lt5٪

أنت بحاجة إلى بروتين مرجعي و GT / = 310 كيلو دالتون

لماذا استخدام محلول الحليب المعقم؟ من خلاله بعيدا بعد الاستخدام.

إذا بدأت بنسبة 5-6٪ في جل الفصل ، فلن تحتاج إلى جل تكديس إذا تم استخدامه يجب أن يكون أقل من & lt5٪

أنت بحاجة إلى بروتين مرجعي و GT / = 310 كيلو دالتون

لماذا استخدام محلول الحليب المعقم؟ من خلاله بعيدا بعد الاستخدام.

ما زلت أنتظر وحدة النشاف الجديدة ، ولكن بعد ذلك سأحاول استخدام هلام بنسبة 6٪ ومخزن مؤقت باستخدام SDS.

بروتين مرجعي. جلالة الملك أريد فقط إظهار الاختلافات في الحجم والشكل الثاني من البروتين يقع في نطاق محدداتي ولدي تحكم إيجابي (خط الخلية).

اعتقدت أن محلول الحليب المعقم قد يكون أفضل إذا كان هناك أي شيء داخل المسحوق (ألياف أو أي شيء آخر) قد يتداخل مع البقعة. لكنك على حق ، سأقوم بإعداده طازجًا ، وهذه أسهل طريقة.


دليل استكشاف أخطاء إنزيم التقييد

يمكن استخدام الدليل التالي لاستكشاف أخطاء هضم إنزيم التقييد وإصلاحها. قد تكون مهتمًا أيضًا بمراجعة نصائح إضافية لتحسين تفاعلات الهضم.

يسعدنا أن نعلن أننا بصدد تحويل جميع مخازن التفاعل لتكون خالية من BSA. اعتبارًا من أبريل 2021 ، ستقوم NEB بتحويل مخازن رد الفعل الحالية المحتوية على BSA (NEBuffer & trade 1.1 و 2.1 و 3.1 و CutSmart & reg Buffer) إلى مخازن مؤقتة تحتوي على الألبومين المؤتلف (الرالبومين) (NEBuffer r1.1 و r2.1 و r3.1 و rCutSmart & Trade Buffer). نتوقع أن يستغرق هذا التبديل ما يصل إلى 6 أشهر حتى يكتمل. نشعر أن الابتعاد عن المنتجات التي تحتوي على حيوانات هو خطوة في الاتجاه الصحيح ويمكننا تقديم هذا التحسين بنفس السعر. اعثر على مزيد من التفاصيل على www.neb.com/BSA-free.

خلال هذه الفترة الانتقالية ، قد تتلقى منتجًا به مخازن مؤقتة تحتوي على BSA أو rAlbumin. اختبر NEB كلاهما بدقة ولم يلاحظ أي اختلاف في أداء الإنزيم عند استخدام أي من المخزن المؤقت. يمكن استخدام أي من المخزن المؤقت مع الإنزيم الخاص بك. سيتم تبديل كل محتوى موقع الويب في أبريل لتعكس التغييرات ، على الرغم من أنك قد لا تتلقى المخزن المؤقت الجديد مع منتجك على الفور.

أشرطة فيديو

مشكلة هضم إنزيم التقييد: مسحة الحمض النووي على جل الاغاروز

تعرف على المزيد حول أسباب هذه المشكلة الشائعة ، وكيف يتم مراقبة الجودة في إنزيمات NEB لتجنب تلطيخ الحمض النووي.

لماذا لا يقطع إنزيم التقييد الخاص بي الحمض النووي؟

لا تحصل على الانقسام الذي توقعته؟ دع عالم NEB يساعدك في استكشاف رد فعلك.

مشكلة الهضم في إنزيم التقييد: الكثير من عصابات الحمض النووي

هل تجد نطاقات غير متوقعة في رد فعل الهضم لديك؟ فيما يلي بعض النصائح لمساعدتك في تحديد السبب.

بروتوكول هضم إنزيم التقييد: قطع بالقرب من نهاية الحمض النووي

عند القطع بالقرب من نهاية جزيء الحمض النووي ، تأكد من معرفة عدد القواعد التي يجب إضافتها إلى نهايات بادئات PCR.

بروتوكول توفير الوقت والتجارة لهضم إنزيم التقييد

هل تحتاج إلى بروتوكول للاستيعاب بسرعة وبشكل كامل؟ جرب هذا البروتوكول للإنزيمات الموفرة للوقت والتجارة المؤهلة من NEB.

قلل نشاط النجوم باستخدام إنزيمات تقييد عالية الدقة

صمم NEB إنزيمات HF & reg للقضاء على نشاط النجوم. تعلم كيف وماذا يعني هذا بالنسبة لهضم الخاص بك.

البروتوكول القياسي لهضم إنزيم التقييد

دع أحد خبراء إنزيم التقييد في NEB يساعدك على تحسين أسلوبك وتجنب الأخطاء الشائعة في إعداد الهضم.

  • تحقق من حساسية المثيلة للإنزيم (الإنزيمات) لتحديد ما إذا كان الإنزيم مسدودًا عن طريق مثيلة تسلسل التعرف
  • استخدم المخزن المؤقت الموصى به المزود بإنزيم التقييد
  • نظف الحمض النووي لإزالة أي ملوثات قد تثبط الإنزيم
  • عند هضم جزء من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تأكد من وجود 6 نيوكليوتيدات على الأقل بين موقع التعرف ونهاية جزيء الحمض النووي
  • قلل عدد الوحدات
  • أضف SDS (0.1 & ndash0.5٪) إلى المخزن المؤقت للتحميل لفصل الإنزيم عن الحمض النووي أو استخدم صبغة جل تحميل ، أرجواني (6X) (NEB # B7024)
  • استخدم عازلة تشغيل نظيفة وجديدة
  • استخدم هلام الاغاروز الطازج
  • تنظيف الحمض النووي (NEB # T1030)
  • تحقق من حساسية المثيلة للإنزيم (الإنزيمات) لتحديد ما إذا كان الإنزيم مسدودًا عن طريق مثيلة تسلسل التعرف
  • قد يتم حظر الحمض النووي المعزول من مصدر بكتيري بواسطة مثيلة Dam و Dcm
  • إذا تم تثبيط الإنزيم بواسطة مثيلة السد أو Dcm ، فقم بتنمية البلازميد في a السد- / dcm- سلالة (NEB # C2925)
  • قد يتم حظر الحمض النووي المعزول من مصدر حقيقيات النوى بواسطة مثيلة CpG
  • قد تكون الإنزيمات التي لها نشاط منخفض في المحاليل التي تحتوي على الملح (NEBuffer r3.1) حساسة للملح ، لذا نظف الحمض النووي (NEB # T1030) قبل الهضم
  • يمكن أن تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم الأعمدة الدورانية إلى ارتفاع مستويات الملح ، مما يثبط نشاط الإنزيم. 1 لمنع هذا ، يجب ألا يزيد محلول الحمض النووي عن 25٪ من إجمالي حجم التفاعل.
  • تنظيف جزء PCR قبل ملخص التقييد (NEB # T1030)
  • استخدم المخزن المؤقت الموصى به المزود بإنزيم التقييد
  • استخدم ما لا يقل عن 3 & ndash5 وحدات من الإنزيم لكل & كوب من الحمض النووي
  • زيادة وقت الحضانة
  • بعض الإنزيمات لها نشاط أقل على الحمض النووي فائق التوليف. زيادة عدد وحدات الإنزيم في التفاعل.
  • يمكن أن تظهر بعض الإنزيمات انقسامًا أبطأ نحو مواقع محددة. زيادة وقت الحضانة ، 1 & ndash2 ساعة كافية عادة.
  • تتطلب بعض الإنزيمات وجود موقعين للتعرف على القطع بكفاءة
  • فحص الركيزة DNA في وجود DNA تحكم. لن ينكسر DNA الضبط إذا كان هناك مثبط. الحمض النووي المصغر للإعدادات معرض بشكل خاص للملوثات.
  • نظف الحمض النووي باستخدام عمود الدوران (NEB # T1030) أو قم بزيادة الحجم لتخفيف الملوثات
  • قلل عدد الوحدات في التفاعل
  • أضف SDS (0.1 & ndash0.5٪) إلى المخزن المؤقت للتحميل لفصل الإنزيم عن الركيزة
  • استخدم المخزن المؤقت الموصى به المزود بإنزيم التقييد
  • قلل عدد وحدات الإنزيم في التفاعل
  • تأكد من أن كمية الإنزيم المضاف لا تتجاوز 10٪ من إجمالي حجم التفاعل. هذا يضمن أن تركيز الجلسرين الكلي لا يتجاوز 5٪ حجم / حجم
  • تقليل وقت الحضانة. إن استخدام الحد الأدنى من وقت رد الفعل المطلوب لعملية الهضم الكامل سيساعد في منع نشاط النجوم.
  • جرب استخدام إنزيم تقييد عالي الدقة (HF). تم تصميم إنزيمات HF لتقليل نشاط النجوم.
  • قد تكون الإنزيمات التي لها نشاط منخفض في المحاليل التي تحتوي على الملح (على سبيل المثال ، NEBuffer r3.1) حساسة للملح. تأكد من تنظيف الحمض النووي (NEB # T1030) قبل الهضم.
  • يمكن أن تؤدي إجراءات تنقية الحمض النووي التي تستخدم الأعمدة الدورانية إلى ارتفاع مستويات الملح ، مما يثبط نشاط الإنزيم. 1 لمنع هذا ، يجب ألا يزيد محلول الحمض النووي عن 25٪ من إجمالي حجم التفاعل.
  • تنظيف جزء PCR قبل ملخص التقييد (NEB # T1030)
  • استخدم المخزن المؤقت الموصى به المزود بإنزيم التقييد
  • استخدم ما لا يقل عن 5 & ndash10 وحدات من الإنزيم لكل & كوب من الحمض النووي
  • هضم الحمض النووي لمدة 1 & ndash2 ساعة


1 Monarch Kits (NEB # T1010 و NEB # T1020 و NEB # T1030) تستخدم الأعمدة التي تم تصميمها لتقليل انتقال الملح إلى الحمض النووي المزال ، لذلك يمكن أن يؤدي استخدامها إلى تقليل هذه المشكلة.


الكميات

من بين جميع الطرق المتاحة لتقدير كمية البروتين (بما في ذلك التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر ، والمقايسات القائمة على الصبغة اللونية ، والرحلان الكهربائي جنبًا إلى جنب مع تحليل الحصول على الصور) ، فإن تحديد كمية البروتين فقط عن طريق الرحلان الكهربائي يتيح تقييم النقاء أو الإنتاجية أو النسبة المئوية لاسترداد البروتينات الفردية في مخاليط عينات معقدة.

هناك نوعان من الكميات الممكنة: الكميات النسبية (الكميات لأنواع بروتينية واحدة بالنسبة لكمية أخرى) والكمية المطلقة (تقدير كمية البروتين باستخدام منحنى المعايرة الناتج عن مجموعة من التركيزات المعروفة لهذا البروتين). نظرًا لأن البروتينات تتفاعل بشكل مختلف مع بقع البروتين ، فإن كثافة تلطيخ البروتينات المختلفة بأحمال بروتين متطابقة يمكن أن تكون مختلفة تمامًا ، لذلك يمكن تحديد القيم الكمية النسبية فقط في معظم الحالات. لا يمكن إجراء قياسات البروتين المطلق إلا إذا كان البروتين قيد البحث متاحًا في شكل نقي ويستخدم كعامل معاير.


عينة تمسخ

تم استخدام العديد من المخازن المؤقتة للعينات من أجل SDS-PAGE ولكن جميعها تستخدم نفس المبادئ لإفساد العينات. نحصل على تمسخ جيد عن طريق تحضير عينة لتركيز نهائي من 2 مجم / مل بروتين مع 1٪ SDS ، 10٪ جلسرين ، 10 ملي مولار Tris-Cl ، pH 6.8 ، 1 ملي إيثيلين ديامين تتراسيتيك حمض (EDTA) ، عامل اختزال مثل مثل dithiothreitol (DTT) أو 2-mercaptoethanol ، وقليل من البروموفينول الأزرق ليكون بمثابة صبغة تتبع (

نقوم بإعداد تركيز 2x من محلول العينة الذي يتكون من 2٪ SDS ، و 20٪ جلسرين ، و 20 ملي مولار من Tris-Cl ، ودرجة الحموضة 6.8 ، و 2 ملي مولار من إيثيلين ديامين تتراكتيك أسيد (EDTA) ، و 160 ملي ديثيوثريتول (DTT) ، و 0.1 مجم / مل برومفينول صبغة زرقاء. أنا أفضل DTT على 2-مركابتوإيثانول لأن الأخير له رائحة كريهة أقوى بكثير ولا يفسد أجزاء الدم لدينا بشكل جيد. جزء من المشكلة هو أن حمامات الماء لدينا لا تصل إلى درجة الغليان ، وقد يكون الغليان ضروريًا باستخدام مركبتين مركبتينول. نقوم بإعداد جميع المجهول لدينا بنفس التركيز ثم نخلط عينة واحدة معدة بحجم واحد إلى مخزن مؤقت بحجم 2x.

إذن ، ماذا تفعل المكونات المختلفة؟ EDTA هي مادة حافظة تخلب الكاتيونات ثنائية التكافؤ ، مما يقلل من نشاط الإنزيمات المحللة للبروتين التي تتطلب أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم كعوامل مساعدة. يعمل tris كمخزن مؤقت ، وهو أمر مهم للغاية لأن عملية التكديس في الرحلان الكهربائي المتقطع تتطلب درجة حموضة معينة. يجعل الجلسرين العينة أكثر كثافة من المخزن المؤقت للعينة ، لذلك ستبقى العينة في قاع البئر بدلاً من الطفو. تسمح الصبغة للمحقق بتتبع تقدم الرحلان الكهربائي.

SDS و DTT والحرارة هي المسؤولة عن التمسخ الفعلي للعينة. يكسر SDS البنية ثنائية وثلاثية الأبعاد للبروتينات عن طريق إضافة شحنة سالبة إلى الأحماض الأمينية. نظرًا لأن الشحنات المتشابهة تتنافر ، يتم تقويم البروتينات بشكل أو بآخر ، مما يجعلها على الفور بلا وظيفة. قد تبقى بعض الهياكل الرباعية بسبب الترابط ثنائي الكبريتيد (التساهمي) وبسبب الروابط التساهمية وغير التساهمية مع أنواع أخرى من الجزيئات. بالمناسبة ، اسم آخر لـ SDS هو كبريتات لوريل. قد يحتوي الشامبو الخاص بك على كبريتات لوريل - ألا يوحي ذلك بالثقة في المنتج الآن؟

العديد من البروتينات لها خصائص كارهة للماء وقد ترتبط ارتباطًا وثيقًا بجزيئات أخرى ، مثل الدهون ، من خلال تفاعل كاره للماء. يؤدي تسخين العينات إلى 60 درجة مئوية على الأقل إلى زعزعة الجزيئات ، مما يسمح لـ SDS بالارتباط في المناطق الكارهة للماء وإكمال التمسخ.

يحتوي سيستين الأحماض الأمينية على مجموعة سلفهيدريل (-SH) التي تشكل تلقائيًا رابطة ثاني كبريتيد (-S-S-) مع مجموعة سلفهيدريل أخرى في ظل ظروف طبيعية داخل الخلايا. الرابطة ثاني كبريتيد تساهمية ولا تتعطل بواسطة SDS. DTT هو عامل اختزال قوي. يتمثل دوره المحدد في تمسخ العينة في إزالة الجزء الأخير من الهيكل الثلاثي والرباعي عن طريق تقليل روابط ثاني كبريتيد.

لا تزيل معظم المحاليل المعيارية للعينات مجموعات الكربوهيدرات أو الفوسفات المرتبطة تساهميًا ، ويصعب تعطيل بعض الارتباطات مع أنواع أخرى من الجزيئات الكبيرة. تحتوي البولي ببتيدات على كميات متفاوتة من الأحماض الأمينية الأساسية والحمضية التي تضيف شحنة إلى الجزيئات ، وتتنوع الأحماض الأمينية الفردية في الوزن الجزيئي على الرغم من أنها قد تربط SDS بنفس التقارب. لذلك ، تتأثر نسبة الشحنة إلى الكتلة والحركة النسبية للعديد من البروتينات بعوامل أخرى غير الوزن الجزيئي بدقة. تعد SDS-PAGE فعالة جدًا في توفير نتائج قابلة للتكرار ، ولكن لا تعتمد على القيم الدقيقة لتحديد MW.


6 أسئلة شائعة مهمة حول الألبومين المصل البقري (BSA)

يعتبر Bovine Serum Albumin (BSA) عالميًا في المختبر ، حيث يستخدم في اللطخة الغربية ، وزراعة الأنسجة الخلوية ، و PCR والمزيد ، ولكن تعدد استخدامات BSA دفع الباحثين إلى طرح العديد من الأسئلة الشائعة. بدلاً من متابعة الإجابات عبر الإنترنت ، حددنا 6 أسئلة شائعة جدًا تتعلق بـ BSA وقدمنا ​​بعض الإجابات التفصيلية للغاية لتكون بمثابة دليل مفيد.

1. ما نوع BSA الذي يجب علي استخدامه لتجربتي؟

في مقالنا السابق حول هذا الموضوع بالذات ، تناولنا هذا السؤال بمزيد من التفصيل. يظهر هذا السؤال غالبًا بسبب وجود العديد من أنواع BSAs المتاحة والتي يتم توجيهها نحو مجموعة واسعة من التطبيقات المعملية ، ولكل منها خصائص تعمل على تحسينها بشكل أفضل لتقنية معملية. على سبيل المثال ، قد ترغب في الحصول على BSA مجاني IgG إذا كنت بحاجة إلى عامل حظر.

سيعتمد تحديد نوع BSA الذي يجب استخدامه على نوع التجربة التي تجريها واحتياجاتك الخاصة. بعد إلقاء نظرة على المقالة المذكورة أعلاه وجدول دليل التحديد الخاص بها ، لا يزال من الجيد الرجوع إلى مصادر أخرى مثل ResearchGate للحصول على مزيد من المعلومات وإجابة أكثر تفصيلاً.

2. كيف يعمل BSA كعامل حظر؟

تهدف عوامل الحظر إلى منع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة. بشكل عام ، طالما أن البروتين ليس له صلة بالمسبار الخاص بك ، فيمكن نظريًا استخدامه كعامل مانع. ولكن إذا اخترت أي شيء عشوائيًا ، فمن المحتمل أن تكون تجربتك غير فعالة. لذلك ، هناك بروتينات معينة موجهة لهذا النوع من العمل. ترتبط هذه البروتينات بشكل أكثر ثباتًا بالغشاء ، مما يحسن حساسية الفحص ويقلل من التداخل في الخلفية.

فلماذا إذن BSA؟ بادئ ذي بدء ، أنت لا تريد فقط أي مساحة تخزين BSA. تحتوي العديد من أنواع BSAs على IgGs (مناسب للتطبيقات الأخرى) والتي يمكن أن تؤدي إلى ربط غير محدد. الهدف هو العمل مع بروتين يحافظ على تجربتك في الظروف المثلى ، لذلك في حالة وجود عامل مانع ، خاصةً BSA ، فأنت تريد التفكير في الأنواع الخالية من الغلوبولين المناعي.

3. هل يجب أن أستخدم BSA أو Milk من أجل لطخة ويسترن الخاصة بي؟

أكثر عوامل الحجب استخدامًا في المختبرات هما الحليب الخالي من الدسم و BSA. وهناك إيجابيات وسلبيات لكل منهما. عادةً ما يكون الحليب ميسور التكلفة ويمكن تحضيره بسهولة من البودرة مقارنةً بـ BSA ، ومع ذلك ، فإن الحليب ليس جيدًا للاستخدام في أنظمة avidin-biotin لأن الحليب يحتوي على البيوتين ، ويجب عدم استخدام الحليب على البروتينات الفسفرة.

عادةً ، عند العمل مع البروتينات المفسفرة ، يميل BSA إلى العمل بشكل أفضل كعامل مانع. وذلك لأن الحليب يحتوي على مجموعة متنوعة من البروتينات ، أحدها بروتين الفوسفوبروتين الكازين ، مما يؤدي إلى خلفية أعلى. بالطبع مع كل النصائح هناك حالات خاصة. أفضل قاعدة أساسية عند العمل مع البروتينات المفسفرة هي لتبدأ بـ BSA، ثم التحسين من هناك.

4. لماذا يتطلب تقدير تركيز البروتين عادة مساحة سطح الجسم؟

لتقدير تركيز البروتين لعينة غير معروفة ، تحتاج إلى مقارنتها بمرجع يشبه إلى حد كبير عينتك. ومع ذلك ، ليس من السهل دائمًا العثور على هذا ، لذلك يلعب BSA دور المرجع. هناك بعض العوامل التي تجعل BSA مرجعًا مناسبًا للاستخدام: إنه متوفر بكثرة ، وبأسعار معقولة جدًا ، ومستقر للغاية ولن يكون له تأثير كبير في التفاعلات الكيميائية الحيوية.

5. هل يعتبر مصل الزلال البقري (BSA) ومصل الأبقار الجنينية (FBS) نفس الشيء؟

لا. انه ليس نفس الشيئ. مصل بقري الجنين هو مكمل مصل شائع الاستخدام لزراعة الخلايا حقيقية النواة. تتمثل فائدة FBS في زراعة الخلايا في انخفاض مستويات الأجسام المضادة وارتفاع مستويات عامل النمو. يستخدم Bovine Serum Albumin (BSA) في مجموعة متنوعة من التطبيقات المختبرية بما في ذلك وظيفته كمعيار لتركيز البروتين ، ووظيفته كمغذٍ للخلايا وقدرته على تثبيت الإنزيمات أثناء هضم التقييد. ومع ذلك ، فإن المهم هنا هو أنه بينما يظهر كلاهما غالبًا في عمليات بحث Google عندما تبحث فقط عن أحدهما أو الآخر ، وتبدو متشابهة جدًا ، إلا أنهما مختلفان بالفعل.

6. لماذا من المهم أن يتم تصنيع BSA في الولايات المتحدة؟

ترجع أهمية الحصول على BSA الخاص بك من الولايات المتحدة أو أستراليا إلى القلق بشأن التهاب الدماغ الإسفنجي البقري (BSE). لم يكن هناك تفشي في الولايات المتحدة مما يجعل هذه المنتجات أكثر جدارة بالثقة. تؤكد GoldBio بشكل خاص أن BSA الخاصة بهم مصنوعة في الولايات المتحدة في نظام حلقة مغلقة من الحيوانات التي تم فحصها من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ، وهي معتمدة لتكون خالية من مرض جنون البقر / TSE.


2-D الكهربائي سير العمل

يوفر سير العمل الكهربائي ثنائي الأبعاد مجموعة شاملة من حلول المنتجات والموارد التعليمية التي تمنحك نتائج أفضل لاكتشاف العلامات الحيوية وتوصيف البروتين وتطوير اختبار HCP.

إعداد عينة

البعد الأول الكهربائي

البعد الثاني الكهربائي

التلوين والتصوير والتحليل

2-D معدات الرحلان الكهربائي والكواشف

أنظمة كاملة للرحلان الكهربي ثنائي الأبعاد بما في ذلك خلايا التركيز الكهربي متساوي الأبعاد ذات البعد الأول ، والمخازن المؤقتة والكواشف "2DE" ، والمواد الهلامية الجاهزة ، وخلايا الرحلان الكهربائي ذات البعد الثاني الصغيرة والمتوسطة والكبيرة.

الكهربائي التحضيري

يمكن لأنظمة الرحلان الكهربي التحضيري Bio-Rad و rsquos تجزئة وتنقية كميات النانوجرام إلى الجرام من البروتينات أو الأحماض النووية عن طريق الرحلان الكهربي أو التحلل الكهربائي المستمر من المواد الهلامية.


النشاط النسبي لأنزيمات التقييد في المخازن المؤقتة العالمية والقاعدية

يتم تزويد إنزيمات التقييد الخاصة بنا بمخزن مؤقت عالمي مثالي (واحد من خمسة مخازن عالمية موضحة باللون الأزرق في الجدول أدناه). يتم تطبيع النشاط النسبي في كل من المخازن المؤقتة العالمية الأخرى إلى المخزن المؤقت الأمثل ، حيث يتم التعبير عن نشاط كل إنزيم في المخزن المؤقت الأمثل بنسبة 100٪. تشير القيم الموجودة في () إلى المخازن المؤقتة التي من المحتمل أن تتأثر بنشاط النجوم. من أجل تجنب هذه الآثار ، يوصى باستخدام المخازن المؤقتة المظللة باللون الأزرق أو الوردي.

يتم تزويد بعض الإنزيمات المحددة (AccIII و BalI و BcnI و BglI و Bpu1102I و Cfr10I و Eco52I و NruI و PshBI و SnaBI و SspI و TaqI و VpaK11BI) بمخزن أساسي متخصص للإنزيم المعين. تختلف تركيبات هذه المحاليل القاعدية باختلاف الإنزيم.

انزيم التقييد الأنشطة النسبية (٪)
إلمحكT + BSAالقاعدية ***
آاتي & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 100 120
AccI 20 100 & lt20 (& lt20) 160 80
أكيي (260) 100 & lt20 20 200 160
AccIII (& lt20) (& lt20) 20 (80) (& lt20) 100
افاي 60 60 40 60 100 100
AflII 20 80* & lt20 & lt20 140 120
ألوي 100 100 & lt20 40 200 120
Aor13HI & lt20 20 & lt20 80 * 80 100
Aor51HI 80 100 & lt20 20 120 120
ابي 100 & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 120
أبالي 100 20 & lt20 & lt20 120 120
افاي (& lt20) 100 20 40 100 120
افي 80 100 & lt20 20 100 100
بالي 20 20 & lt20 & lt20 40 100
بامهي (& lt20) & lt20 40 100 (& lt20) 80
باني (120) (120) 100 80 (100) 100
أنا & lt20 20 40 60 60 100
BglI & lt20 & lt20 20 40 & lt20 100
BglII & lt20 20 100 (100) (60) 100
أنا & lt20 20 40 100 20 120
BmeT110I & lt20 & lt20 20 100 & lt20 140
BmgT120I & lt20 & lt20 100 40 & lt20 240
بو 1102 ا & lt20 & lt20 & lt20 40 60 100
BspT104I 100 60 & lt20 & lt20 100 120
BspT107I & lt20 20 80 100 20 100
أنا 100 20 & lt20 & lt20 60 100
Bsp1407I 20 60 20 20 100 100
BssHII 100 100 60 20 140 100
BstPI (& lt20) (60) 100 (100) (100) 100
BstXI & lt20 40 100 & lt20 & lt20 120
Bst1107I (& lt20) 60 100 100 40 100
CFR10I (& lt20) (& lt20) (& lt20) 40 (20) 100
CLI 40 100 120 100 60 100
CpoI & lt20 & lt20 80 100 & lt20 100
دراي 100 100 60 100 80 80
EaeI 60 100 & lt20 & lt20 120 160
EcoO65I (20) (60) 60 * 40 40 100
إيكو 109 أ 100 60 & lt20 & lt20 100 160
ايكو ارى (20) (100) 100 (120) (80) 120
EcoRV (& lt20) (40) 100 (120) (40) 100
EcoT14I (& lt20) (40) 100 120 (60) 100
EcoT22I & lt20 20 100 (140) (20) 120
Eco52I & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 100
Eco81I & lt20 100 & lt20 & lt20 100 160
FbaI (& lt20) (& lt20) (80) 100 (20) 100
فوكي (20) (60) & lt20 & lt20 (200) 100
هايي 80 100 & lt20 80 140 100
هايييي 60 100 100 60 100 100
HapII 100 60 & lt20 & lt20 100 80
HhaI 80 100 100 120 120 100
HincII 20 100 20 40 100 80
هند III (60) 100 & lt20 200 (100) 80
HinfI 80 100 100 160 60 100
هين 1 40 80* & lt20 20 60 160
هبا & lt20 (40) 20 100 (80) 100
أنا 100 60 & lt20 & lt20 (100) 80
مبوي 20 40 60 100 40 100
مبوي 100 60 & lt20 & lt20 60 100
MflI 100 80 & lt20 & lt20 80 100
أنا 60 60 100 (100) 60 100
MspI 80 80 & lt20 100 100 80
موني (200) 100* & lt20 & lt20 160 100
MvaI (& lt20) (40) 80 100 (20) 120
ناي 100 & lt20 & lt20 & lt20 100 120
NcoI (40) (60) 20 60* (60) 160
NdeI & lt20 40 100 100 80 100
أنا (120) 100 & lt20 & lt20 (160) 100
لا (& lt20) (& lt20) 20** & lt20 (& lt20) 100
NruI 0 & lt20 20 20 & lt20 100
NsbI 40 20 & lt20 60 100 100
PmaCI 100 80 & lt20 & lt20 100 100
PshAI 20 40 & lt20 100 60 160
PshBI (20) (40) 20 40 40 100
PS1406I 20 60 & lt20 & lt20 100 100
PstI (& lt20) (60) 100 80 (20) 80
PvuI (& lt20) (20) (40) 80* (40) 120
PvuII (80) 100 40 & lt20 (40) 100
ساسي 100 60 & lt20 & lt20 80 80
SacII 40 20 & lt20 & lt20 100 40
سالي & lt20 & lt20 100 (20) & lt20 120
Sau3AI (60) 80 100 & lt20 (80) 100
ScaI (& lt20) (& lt20) 100 (60) (& lt20) 100
SfiI (40) 100 & lt20 & lt20 100 100
SmaI & lt20 & lt20 & lt20 & lt20 100 100
SmiI & lt10 & lt20 100 40 & lt10 100
سنابي (20) (40) & lt20 & lt20 (40) 100
SpeI (80) 100 80 100 (80) 100
SphI (20) (40) 100 120 (20) 100
Sse8387I (120) 60* & lt20 & lt20 (60) 100
SSPI (& lt20) (60) 40 (100) (80) 100
ستوي 60 100 60 80 140 100
تقي 40 80 60 60 80 100
Tth111I (20) 80 40 100 (80) 120
فان 91 & lt20 (20) 60 100 (60) 100
VpaK11BI & lt20 & lt20 60 (40) & lt20 100
XbaI & lt20 80* 20 & lt20 120 120
XhoI & lt20 60 100 160 60 100
XspI & lt20 60 & lt20 100 160 100

الأزرق: المخزن المؤقت المزود بإنزيم التقييد
اللون الوردي: يوصى باستخدام مخزن مؤقت بديل

* + 0.01٪ BSA & rarr 100٪ AflII، EcoO65I، FokI، Hin1I، MunI، NcoI، PvuI، SplI، Sse8387I، XbaI
** + 0.01٪ BSA + 01٪ Triton X-100 & rarr 100٪ NotI
*** تركيبات المخازن القاعدية خاصة بالإنزيم.


استكشاف الأخطاء وإصلاحها SDS-PAGE من BSA المعالج بالتريبسين - علم الأحياء

في مهمة لجعل الكيمياء الحيوية ممتعة ومتاحة للجميع

هل يمكن أن يكون هذا بروتينًا ضخمًا أراه؟ يمكننا فصل البروتينات حسب الحجم عن طريق إرسالها عبر هلام SDS-PAGE ، ولكن من أجل العثور على كنز البروتين لدينا ، نحتاج إلى إرسال بعض الباحثين عن الكنوز. والصبغة التي نستخدمها غالبًا هي صبغة تسمى Coomassie Brilliant Blue (CBB) ، إما بالطريقة الكلاسيكية أو على شكل بقع غروانية أسرع (غالبًا ما يتم الإعلان عنها على أنها بعض النسخ المسجلة كعلامة تجارية من & ldquoinstant blue & rdquo).

ملاحظة: تم تجديد هذا المنشور اعتبارًا من سبتمبر 2019 ، منذ حوالي 300 SDS-PAGEs (حرفيًا ، ليس مبالغة & ndash اليوم قمت بتشغيل 732 و 733 و 734!)

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate & ndash PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) هي تقنية نستخدمها لفصل البروتينات في خليط حسب الحجم (جيدًا ، الطول) باستخدام الكهرباء لإرسال البروتينات عبر شبكة هلامية. الهدف هنا ليس & rsquot لتنقية البروتينات ، بدلاً من ذلك الهدف هو مجرد رؤية ماذا & rsquos هناك. لكن البروتين و rsquos غير مرئي للعين المجردة ، لذلك نحتاج إلى نوع من الصبغة من أجل تجسس البروتين.

ملاحظة: اللون الأزرق الذي تراه أثناء تشغيل الجل هو مجرد صبغة تعقب في مخزن تحميل العينة مما يساعدك على معرفة وقت إيقاف تشغيل الكهرباء وبدء التلوين.

يمكنك التفكير في هلام SDS-PAGE ومصفوفة rsquos على أنها متاهة تحتوي على بروتين و ldquotreasure و rdquo مخفية طوال الوقت. على عكس البروتينات ، يتم تحريك الجل مباشرة لأسفل لأن المجال الكهربائي كان يجبرهم على هذا النحو ، تحدث خطوة الصباغة بعد إيقاف تشغيل الكهرباء ونقل الجل الخاص بك من شطيرة اللوحة إلى صندوق التلوين. هنا ، لا يوجد اتجاه لحركة الأشياء ، لذلك ستتحرك الصبغة أينما تريد! (على الرغم من أن البروتين سوف يظل عالقًا في مكانه من خلال التكتل الناجم عن المواد الكيميائية كما نرى).

تنتقل الصبغة عشوائياً عبر متاهة الهلام عن طريق الانتشار (تتحرك الجزيئات بشكل عشوائي ، وتنتقل من الأشياء التي تصطدم بها مع النتيجة الصافية التي تنتقل من مناطق عالية التركيز إلى مناطق ذات تركيز منخفض). عندما تجد كنزًا من البروتين ، فإنها تلتصق به. وبما أن الصبغة & rsquos blue فإنها تخبرنا بمكان وجود البروتين.

ولكن من الصعب حقًا العثور على الكنز الذي يحاول الهروب! لذلك نحن بحاجة إلى الحصول على الكنز للبقاء في مكانه - تستخدم خطوة التثبيت الكحول و / أو الحمض لجعل البروتين يترسب (يتكتل) بحيث يتعطل في مكانه حتى تتمكن صبغة البحث عن الكنوز لدينا من العثور عليه. علينا أيضًا أن ننتبه إلى الباحثين عن الكنوز المتحمسين للغاية الذين يمسكون بالذهب و ldquofool و rsquos rdquo (يلطخ الجل نفسه) مما يتسبب في خلفية عالية. يؤدي هذا إلى مخطط شامل للبحث عن الكنوز يتألف من:

  1. يفصل الجل الكهربي & ndash البروتينات حسب الحجم عن طريق فكها وتغليفها بمنظف سالب الشحنة (SDS) وأمبير باستخدام تلك الشحنة السالبة لتحفيزها على الانتقال عبر شبكة جل بولي أكريلاميد نحو شحنة موجبة. تتشابك البروتينات الأكبر (الأطول) بشكل أكبر ، لذا فهي تتحرك بشكل أبطأ وتتقدم أقل (أعلى على الهلام) عند إيقاف الطاقة. المزيد هنا: http://bit.ly/2GZc3tG
  2. WASH & ndash يزيل SDS المجاني ، إلخ.
  3. FIX & ndash اصطاد الكنز & ndash يجب أن يسمح الجل للبروتينات بالتحرك عندما تريدها ، ولكن ليس بسهولة كبيرة & ndash من الناحية المثالية أنها & rsquod تتحرك فقط عند تشغيل power & rsquos ، لكن الجزيئات ترغب في التحرك وإذا كان بإمكانها أن تتحرك & ndash (خاصة الصغيرة تلك) يمكن أن تبدأ بالتجول حتى عند انقطاع التيار الكهربائي و rsquos). لمنع هذا الشرود ، أضف الكحول و / أو الحمض لجعلها تتكتل وتعلق في مكانها.
  4. يرسل STAIN & ndash صائدي الكنوز & ndash ضع الجل في حمام من الصبغة وندش الصبغة وتلتصق بالبروتين وتعلق أيضًا (هذه الخطوة و rsquos غالبًا ما يتم دمجها مع خطوة التثبيت)
  5. DESTAIN & ndash قم بإيقاف البحث & ndash احصل على صائدي الكنوز الذين لا يملكون كنوزًا ليغادروا حتى تتمكن من رؤية مكان وجود الكنوز الممتلئة بالكنوز بشكل أفضل (بعض البقع السريعة لها خلفيات منخفضة وأمبير تتخلص منها في الماء ، مما يسمح للصبغة بالانتشار ، ولكن بعضها طرق استخدام طريقة أكثر تعقيدًا)

كما أشرت إلى ذلك ، هناك الكثير من الصيغ المختلفة بما في ذلك & ldquoClassic Coomassie & rdquo التي لديها باحثون عن الكنوز شغوفون حقًا يمكنهم العثور على كميات ضئيلة من الكنوز ولكنهم أيضًا أحمق و rsquos-gold-happy & ndash it & rsquos فائقة الحساسية ، وفي النهاية تمنحك فرقًا هشة لطيفة ، ولكنها تأخذ الكثير من المصير للكشف عنها. البديل & ldquoColloidal Coomassie & rdquo أصبحت وصفات غروانية Coomassie & rdquo أكثر شيوعًا لأنها & rsquore أسرع وأكثر صداقة للبيئة و ndash تحافظ هذه الأشكال على مجموعات من الباحثين عن الكنوز تتسكع خارج الجل وترسلهم تدريجيًا حتى يتم العثور على كل الكنوز و rsquos وربطها.

دعونا نلقي نظرة فاحصة على صائد الكنوز لدينا ، Coomassie Brilliant Blue (CBB). معظم الكواشف العلمية لها أسماء مملة (رغم أنها وصفية) ، لذلك قد تتساءل كيف حصل Coomassie Brilliant Blue (CBB) على اسمه. إذا كنت & rsquore nerdy نوعًا ما ، فقد تبحث عنه. وإذا كنت & rsquore أكثر ذكاءً مثلي ، (احتضنه!) فقد تخبر الآخرين عنه!

& ldquoCoomassie & rdquo هو في الواقع اسم علامة تجارية و ndash مملوك لشركة لم تعد حتى تجعلها & ndash & amp ؛ اسم مدينة (كوماسي الحديثة ، غانا). لم يتم اكتشاف أو إنتاج CBB هناك ، ولا اعتقدت شركة بريطانية أن تسمية منتجاتها على اسم عاصمة إمبراطورية أشانتي التي احتلوها مؤخرًا ستكون استراتيجية عمل جيدة. هذا يجعلني غاضبًا ، لذلك سأطلق عليه اسم مصرف البحرين المركزي في معظم الأوقات.

& ldquoCoomassie & rdquo تم استخدامه في البداية لتسويق مجموعة واسعة من أصباغ الصوف ، حيث تم تصنيع CBB لأول مرة في عام 1913 وتم استخدامه لأول مرة في تلطيخ البروتينات في الستينيات. الصباغة لمعرفة المزيد عن الصبغة نفسها؟ لها بنية كيميائية تشبه المروحة وتتميز بصبغة ثلاثي فينيل ميثان. على عكس الاسم الشائع الذي قررت الشركة تقديمه لمنتج ، هذا مثال على اسم وظيفي وندش يصف التركيب الكيميائي & ndash في هذه الحالة ثلاث مجموعات فينيل ميثان & ndash phenyl هو نوع من الحلقة المستقرة بالرنين (حلقة أو الذرات التي تشترك في الإلكترونات بطريقة غير محددة مما يجعلها جيدة في امتصاص الضوء وبالتالي جعل الأشياء تبدو ملونة) & ndash والميثيل هي مجموعة -CH & # 8323.

هناك نوعان رئيسيان من صبغة ldquotriphenylmethane و rdquo ، R-250 & amp G-250. كلاهما أزرق ، لكن R & rsquos more & ldquoreddish & rdquo & amp G & rsquos more & ldquogreenish & rdquo (على الرغم من أن اللون يعتمد على الرقم الهيدروجيني وما إذا كان وماذا هو و rsquos ملزمة لذلك يمكن استخدامه لقياس تركيزات البروتين في شيء يسمى & ldquoBradford assay & rdquo http: // http: // لي / برادفوردوف). كان ldquo250 & rdquo في الأصل مؤشرًا للنقاء / القوة. يعتبر R-250 أكثر حساسية ، ولكن يمكن تحويل G-250 إلى أشكال تنتج خلفية أقل ، مع بروتوكولات أسرع.

نحصل على صبغة ldquoquick المستندة إلى G-250 و rdquo نستخدمها في معظم الأوقات مسبقة الصنع ، لكننا نصنع وصمة عار ldquoClassic & rdquo R-250 الخاصة بنا. إنها وصفة بسيطة حقًا وندش فقط 4 مكونات: الماء ، وحمض الخليك (AcOH) ، والميثانول (MeOH) ، و CBB & ndash ، لكن الأمر يستغرق بعض الوقت للتحضير والمزيد هنا: http://bit.ly/2QJNwLy

لكن لا شيء من ذلك يهم حقًا إذا لم تكن الصبغة و rsquos في المكان الذي تريده وندش - وفي المكان الذي تريده فقط. حيث نريده يكون عالقًا بالبروتين (الذي هو نفسه عالق في هلامنا). وحيث لا نريد أن يكون هناك أي بروتين في أي مكان في الجل. فكيف يلتصق بالبروتين وليس الجل؟ عالم الكيمياء الحيوية المتلعثم و rsquos هنا ليقول!

يحتوي مصرف البحرين المركزي على مجموعات حامض الكبريتيك يمكن أن تكون سلبية أو محايدة اعتمادًا على الرقم الهيدروجيني. في ظل ظروف محلول التلوين ، فإنه يحتوي على شحن إجمالي & # 10134 (أنيوني) ، لذلك يرتبط (بشكل عكسي) بأجزاء مشحونة من البروتينات & # 10133 (الأحماض الأمينية الأساسية مثل Arg و Lys و amp His) من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية (جذب الأضداد ). ملحوظة: هذه السلاسل الجانبية aren & rsquot إيجابية دائمًا ، لكننا نصبغ الجل في الظروف الحمضية ، حيث من المرجح أن تكون & ndash المزيد هنا: http://bit.ly/30qzHH6

يرتبط مصرف البحرين المركزي أيضًا بأجزاء البروتين غير المشحونة (خاصةً الأحماض الأمينية الحلقية (الملقبة بالعطرية) مثل Phe و Tyr و amp Trp) & ldquogenerically & rdquo من خلال & ldquoVan der waals & rdquo التفاعلات ، والتي تتضمن تغيير الإلكترونات عندما تقترب الجزيئات من بعضها. هذه التفاعلات ضعيفة بشكل فردي لكنها تضاف (فهم & rsquore ما يسمح للأبراص بالسير على الجدران!). تميل البروتينات ذات النسب العالية بشكل غير عادي من الأحماض الأمينية الحلقية إلى تلطيخها بشكل أفضل. مثال على ذلك هو BSA (ألبومين المصل البقري) ، الذي يجند ضعف عدد الباحثين عن الكنوز لكل وزن من البروتين مقارنة بمتوسط ​​البروتين الخاص بك.

عند الحديث عن الوزن ، فإن البروتينات المختلفة لها أوزان مختلفة لأن لها عددًا مختلفًا من أحرف الأحماض الأمينية. نتحدث عادة عن أوزان البروتين من حيث & ldquomolecular weight (MW) & rdquo ووحدات ldquokiloDaltons & rdquo (kDa). يبلغ الوزن الجزيئي لـ BSA & rsquos 66.5 كيلو دالتون ، مما يعني أن 1 مول (6 × 10 ^ 23) من جزيئات BSA يزن 66.5 كجم. المزيد عن الشامات هنا: http://bit.ly/2KQLw4k

لكن الشيء الرئيسي هنا هو أن البروتينات الأكبر حجمًا لها & ldquomore لتحبها & rdquo في عيون CBB & rsquos & ndash فهي توفر مواقع ارتباط أكثر وبالتالي ستزيد من مساحة سطح الجسم لكل جزيء بروتين أكثر من بروتين أصغر. لذا فإن العصابات الخاصة بك ستبدو أغمق لبروتينات أكبر من البروتينات الأصغر إذا قمت بتشغيل نفس عدد جزيئات البروتين لكل منها.

إن قدرة CBB و rsquos على ربط البروتين تجعله أيضًا صبغة صوف جيدة لأن الصوف و rsquos ممتلئ ببروتين يسمى الكيراتين. وهذه القدرة على ربط الكيراتين التي تجعله جيدًا في صبغ الصوف تجعله جيدًا أيضًا في صبغ بشرتك - لذا ارتدِ القفازات وتجنب تناثرها. يمكن لمصرف البحرين المركزي أيضًا ربط SDS (هذا المنظف الذي استخدمناه سابقًا لإذابة البروتينات وشحنها سلبًا) والذي يمكن أن يفسد النتائج. لذلك تريد غسل الجل في الماء قبل تلطيخه لإزالة SDS.

تسير طريقة مصرف البحرين المركزي الكلاسيكية إلى شيء من هذا القبيل (نعتذر عن التنسيق الشبيه بالملاحظات المكتوبة) & hellip

  1. غسيل بالماء - & gt الحصول على مكونات عازلة لتنتشر من الجل - & gt تبدأ بـ & ldquoclean slate & rdquo
  2. التثبيت / وصمة عار - & gt غمر هلام في محلول تلطيخ (CBB + ميثانول (MeOH) + حمض أسيتيك (AcOH)) (تستخدم بعض الطرق الصديقة للبيئة الإيثانول)
    • نقوم بحل مصرف البحرين المركزي في محلول MeOH / AcOH للجمع بين خطوات التثبيت والتلطيخ. ملحوظة: يستغرق مسحوق مصرف البحرين المركزي وقتًا طويلاً حقًا ليذوب ، لذا اتركه يحرك لعدة ساعات على لوح تحريك مغناطيسي ثم قم بالتصفية من خلال مرشح قهوة لإزالة أي مواد غير منحلة
    • التثبيت: يترسب البروتين لذلك يتم حجزه في مصفوفة الهلام
    • وصمة عار: تنتشر الصبغة في هلام
      • عندما تلتقي الصبغة بالبروتين - وتربط صبغة gt - يتم احتجاز gt لأن البروتين و rsquos محاصرون
      • حيث لا يوجد أي بروتين ، لا تزال الصبغة تملأ مسام الجل ، لكنها لا تحبس (يمكن أن تتدفق إلى الداخل والخارج ولكن في هذه المرحلة تتدفق بشكل أساسي لأن تركيز الصبغة ([الصبغة] أعلى في البقعة منه في الجل).
      • عندما [صبغ خارج هلام] = [صبغ داخل هلام] أنت & rsquove وصلت & ldquoequilibrium. & rdquo التوازن ليس نقطة توقف & ndash it & rsquos في الواقع عملية ديناميكية (جزيئات الصبغة الفردية لا تزال تتحرك ولكن معدل الجزيئات التي تدخل المسام = معدل الخروج من المسام ، لذلك يمكنك & rsquot إخبار أي شيء & rsquos يتغير.
  3. التخلص - & gt استبدل محلول البقع بمحلول بسيط (MeOH + AcOH لكن NO CBB) - & gt قم بإزالة CBB غير المرتبط بالبروتين
    1. يمكن وصمة عار أن تنزل في البالوعة & ndash بدلاً من ذلك نقوم بتجميعها في حاويات النفايات الخطرة التي يتخلص منها عمال الصحة البيئية والسلامة (EH & amp S) بشكل صحيح
    2. في البداية ، هناك & rsquos عالية CBB في هلام ، لا يوجد مصرف البحرين المركزي في الحمام - & gt CBB ينشر الجل في الحمام
    3. هذا يجعل تركيز مصرف البحرين المركزي في الحمام يزداد - ويقل الاختلاف بين الجل والحمام - & gt CBB ينتشر بشكل أبطأ

    كما يمكنك أن ترى من الصور ، يقوم Classic CBB في البداية بتلطيخ جلك باللون الأزرق بالكامل بحيث يمكنك & rsquot رؤية العصابات حتى تتخلص منها وتزيل اللون الأزرق الذي لا يفترض أن يكون أزرق. هذا لأنه من أجل العثور على كنز صغير ، يمكنك إطلاق العنان لعدد كبير من الباحثين عن الكنوز الذين يتسابقون من حمام الصبغة ، حيث يوجد تركيز عالٍ من الصبغة ، إلى مسام الجل حيث يوجد المزيد من المساحة والأمل والبروتين! لكنهم & rsquoll يواصلون التطفل حتى لو لم يتبق أي بروتين للعثور عليه لأن لديك تركيزات عالية من الصبغة المجانية داخل وخارج الجل.

    لكن Colloidal CBB لا يتطلب الكثير من التدمير (على الرغم من أنه يساعد في جعل العصابات أكثر هشاشة) لأنه ، بدلاً من إرسال الكثير من الباحثين عن الكنوز ، عليك بعد ذلك طردهم ، فإن لديه مجموعات من الصيادين يتسكعون خارج الجل ويذهبون فقط إلى & ldquoas مطلوب و rdquo

    الغرواني هو حل حيث بدلاً من انتشار الجزيئات الفردية في جميع أنحاء ، لديك & ldquoclumps & rdquo من تلك الجزيئات ، ولكن لا تزال منتشرة بشكل متساوٍ مثل محلول & ldquonormal & rdquo. وهذه الكتل هي حقًا & ldquodissolved & rdquo (لا تأتي & rsquot & ldquoundone & rdquo عندما تترك الحل يجلس).

    الغرويات كبيرة جدًا لدرجة أنها لا تدخل الجل ، لذا لا يمكنك أن تفرط في الترسبات. & rdquo ولكن الجزيئات المجانية يمكن أن تأتي وتذهب من الجل كما يحلو لها وتحدث ، تمامًا كما كان من قبل ، ماعدا الآن أنها & rsquore بتركيز أقل. إذن كيف تحصل على ما يكفي لتلطيخ البروتين؟ لا توجد مشكلة & ndash يمكن تجديد سكان مصرف البحرين المركزي المجانيين باستمرار من الغرف الغروية & ldquostock & rdquo (لديك نوع من التوازن بين الغرويات المجانية والأمبيرية).

    النتيجة؟ بدلاً من إغراق الجل بالصبغة (مثل طريقة & ldquoclassical & rdquo) ، يمكنك توفير تدفق ثابت ومعتدل من جزيئات CBB & ndash بما يكفي لإخماد البروتينات والعطش ، ولكن ليس كثيرًا بحيث يمكن أن تلتصق بالجل.

    وهكذا ، يمكنك أن ترى العصابات حتى من دون توجيه. كما أنه يساعد في ذلك ، على الرغم من أننا نعتقد أن مصرف البحرين المركزي على أنه أزرق ، إلا أن لونه & rsquos يعتمد على شحنته. عند درجة الحموضة المنخفضة ، يكون CBB G-250 & rsquos بنيًا ، ولكن عندما يرتبط بالبروتينات ، فإنه يستقر في الحالة الزرقاء حتى تتمكن من تمييز الخلفية باللون البني من الكنز الأزرق. http://bit.ly/bradforduv

    على الأقل ، البقعة التي اعتدنا الحصول عليها كانت بنية أكثر. كان هذا وصمة عار و rsquos في الطلب الخلفي لعدة أشهر. وأشهر. وأشهر. لذلك نحن & rsquove نجرب بعض الصيغ الأخرى ولكن يبدو أنها تبدأ أكثر زرقة وتعطي خلفية أعلى.

    عند الحديث عن اللون ، فإن الشيء العظيم في بقع coomassie هو أنه ، على عكس المواد الهلامية للحمض النووي التي تستخدم الأصباغ الفلورية ، يجب أن نلتصق بصينية للأشعة فوق البنفسجية ، http://bit.ly/2zjHH0K. إن مصرف البحرين المركزي هو & ldquocolorimetric & rdquo & ndash ، القراءة ملونة ، لذا فإن النتائج موجودة حقًا لتراها ، لا توجد معدات خاصة مطلوبة (ما لم تحسب العين ، وهي أداة رائعة جدًا!) (وصينية الضوء تساعد أيضًا # 128578).

    بقعة البروتين اللونية الأخرى هي تلطيخ الفضة ، وهي أكثر حساسية ، ولكنها أيضًا أكثر صعوبة. http://bit.ly/2JGHuto

    هناك أيضًا بقع بروتين فلورية. بقع CBB والفضية كلاهما وبقع بروتين ldquoall و rdquo و ndash تلطخ جميع البروتينات (على الرغم من أنها ليست بنفس الجودة في بعض الأحيان). توجد أيضًا جميع بقع البروتين الفلورية. لكن بقع الفلورسنت الرائعة حقًا تلطخ البروتينات المعدلة بشكل خاص فقط مثل البروتينات السكرية (التي تحتوي على سلاسل سكر مضافة) أو البروتينات الفوسفورية (التي تحتوي على مجموعات فوسفات مضافة)

    بعض المصادر عن تاريخ مصرف البحرين المركزي واستخداماته:

    المزيد عن الموضوعات المذكورة (وأمبير أخرى) # 365DaysOfScience الكل (مع الموضوعات المدرجة) & # 128073 http://bit.ly/2OllAB0

    # العلوم # الكيمياء الحيوية # علم الجزيئات # علم الأحياء # علوم الحياة # علوم # realtimechem