معلومة

ماذا يعني مصطلح "موضع البقايا المعدلة" في الفسفرة؟

ماذا يعني مصطلح



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل هذا يعني موقع الحمض الأميني في تسلسل البروتين أم شيء آخر؟

على سبيل المثال ، صادفت عبارة "S 368 phosphoryation" حيث S هي البقايا المعدلة و 368 هي موضع البقايا المعدل. ماذا يعني كل ذلك؟


أنت على صواب368يرمز إلى موضع الحمض الأميني في تسلسل البروتين - هذا السيرين المعين هو البقايا رقم 368 في عد البروتين من النهاية الطرفية الأمينية.


تعديل آخر ترجمة

تعديل آخر ترجمة (PTM) يشير إلى التعديل التساهمي والأنزيمي عمومًا للبروتينات بعد التخليق الحيوي للبروتين. يتم تصنيع البروتينات عن طريق ترجمة الريبوسومات mRNA إلى سلاسل متعددة الببتيد ، والتي قد تخضع بعد ذلك لـ PTM لتشكيل منتج البروتين الناضج. تعد PTM مكونات مهمة في إشارات الخلية ، على سبيل المثال عندما يتم تحويل prohormones إلى هرمونات.

يمكن أن تحدث تعديلات ما بعد الترجمة على السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية أو في البروتين C- أو N- Termini. [1] يمكنهم توسيع الذخيرة الكيميائية للأحماض الأمينية القياسية العشرين عن طريق تعديل مجموعة وظيفية موجودة أو إدخال مجموعة جديدة مثل الفوسفات. الفسفرة هي آلية شائعة جدًا لتنظيم نشاط الإنزيمات وهي أكثر التعديلات شيوعًا بعد الترجمة. [2] العديد من البروتينات حقيقية النواة وبدائية النواة لها أيضًا جزيئات كربوهيدرات مرتبطة بها في عملية تسمى الارتباط بالجليكوزيل ، والتي يمكن أن تعزز طي البروتين وتحسين الاستقرار بالإضافة إلى تقديم الوظائف التنظيمية. غالبًا ما يستهدف ارتباط جزيئات الدهون ، المعروف باسم الليبيدات ، بروتينًا أو جزءًا من بروتين مرتبط بغشاء الخلية.

تتكون الأشكال الأخرى من التعديل اللاحق للترجمة من شق روابط الببتيد ، كما هو الحال في معالجة البروببتيد إلى شكل ناضج أو إزالة بقايا الميثيونين البادئ. يمكن أيضًا الإشارة إلى تكوين روابط ثاني كبريتيد من بقايا السيستين على أنه تعديل لاحق للترجمة. [3] على سبيل المثال ، يتم قطع هرمون الأنسولين الببتيد مرتين بعد تكوين روابط ثاني كبريتيد ، ويتم إزالة البروببتيد من منتصف السلسلة ويتكون البروتين الناتج من سلسلتين عديد الببتيد متصلتين بروابط ثاني كبريتيد.

بعض أنواع التعديل اللاحق للترجمة هي عواقب الإجهاد التأكسدي. يعد الكربونيلين أحد الأمثلة التي تستهدف البروتين المعدل للتحلل ويمكن أن يؤدي إلى تكوين مجاميع البروتين. [4] [5] يمكن استخدام تعديلات الأحماض الأمينية المحددة كمؤشرات حيوية تشير إلى الضرر التأكسدي. [6]

المواقع التي غالبًا ما تخضع لتعديل ما بعد الترجمة هي تلك التي تحتوي على مجموعة وظيفية يمكن أن تكون بمثابة محب للنواة في التفاعل: مجموعات الهيدروكسيل من السيرين ، والثريونين ، والتيروزين ، والأشكال الأمينية لليسين ، والأرجينين ، والهيستيدين ، وأنيون ثيولات السيستين. كربوكسيلات الأسبارتات والغلوتامات و N- و C-termini. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن أميد الأسباراجين هو نواة ضعيفة ، إلا أنه يمكن أن يكون بمثابة نقطة ارتباط للجليكان. يمكن أن تحدث تعديلات نادرة في الميثيونين المؤكسد وفي بعض الميثيلينات في السلاسل الجانبية. [7]

يمكن اكتشاف التعديل اللاحق للترجمة للبروتينات بشكل تجريبي من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات ، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي ، والنشاف الشرقي ، والنشاف الغربي. يتم توفير طرق إضافية في أقسام الروابط الخارجية.


مطلوب فسفرة بروتينات مستشعر الكالسيوم التي تشبه الكالسينورين B (CBL) بواسطة بروتينات البروتين المتفاعلة مع CBL (CIPKs) للنشاط الكامل لمجمعات CBL-CIPK تجاه البروتينات المستهدفة *

تمثل البروتينات الشبيهة بالكالسينورين B (CBLs) عائلة من بروتينات مستشعر الكالسيوم التي تتفاعل مع مجموعة من كينازات السيرين / ثريونين المصنفة على أنها كينازات البروتين المتفاعل مع CBL (CIPKs). تشترك مجمعات CBL-CIPK بشكل حاسم في نقل استجابات النبات للعديد من الإشارات البيئية وفي تنظيم تدفقات الأيونات. ومع ذلك ، فإن التوصيف الكيميائي الحيوي لمجمعات CBL-CIPK قد تم إعاقته حتى الآن بسبب الأنشطة المنخفضة لـ CIPKs المؤتلف. هنا ، نقدم تقريرًا عن كفاءة مستخلص جرثومة القمح في المختبر بروتوكول النسخ / الترجمة الذي ينتج بروتينات CIPK نشطة كاملة الطول من النوع البري. حددنا بقايا سيرين محفوظة داخل الطرف C من CBLs على أنها فسفرة بواسطة CIPKs المتفاعلة. بشكل ملحوظ ، كشفت دراساتنا أن فسفرة CBL المعتمدة على CIPK تعتمد بشكل صارم على تفاعل CBL-CIPK عبر مجال CIPK NAF. لا يبدو أن حالة الفسفرة في CBL تؤثر على الاستقرار أو التوطين أو تفاعل CIPK لبروتينات مستشعر الكالسيوم هذه بشكل عام. ومع ذلك ، فإن الفسفرة المناسبة لـ CBL1 مطلوبة تمامًا لـ في الجسم الحي تنشيط قناة AKT1 K + بواسطة مجمعات CBL1-CIPK23 و CBL9-CIPK23 في البويضات. علاوة على ذلك ، نظهر أنه من خلال الجمع بين CBL1 و CIPK23 و AKT1 ، يمكننا بأمانة إعادة تشكيل التعزيز المعتمد على CBL لفسفرة البروتينات المستهدفة بواسطة CIPKs. في المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، أبلغنا أن الفسفرة لـ CBL1 بواسطة CIPK23 مطلوب أيضًا من أجل التعزيز المعتمد على CBL1 لنشاط CIPK23 تجاه الركيزة. تحدد هذه البيانات معًا آلية تنظيمية عامة جديدة لمجمعات CBL-CIPK في أن الفسفرة CBL في نهايتها C المرنة من المحتمل أن تثير تغييرات توافقية تعزز خصوصية ونشاط مجمعات CBL-CIPK تجاه البروتينات المستهدفة.

تم دعم هذا العمل من خلال منح Deutsche Forschungsgemeinschaft ضمن إطار وحدة البحث 964 (إلى D.B و M.H و J.K).

العنوان الحالي: قسم العلوم البيولوجية ، قسم الأحياء الخلوية والنمائية ومركز علم الوراثة الجزيئية ، جامعة كاليفورنيا سان دييغو ، 9500 Gilman Dr.، 0116، La Jolla، CA 92093-0116.

ريهيرز ، هاشيموتو ، جيه كودلا ، نتائج غير منشورة.


ملخص المؤلف

يتميز مرض باركنسون بفقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في الدماغ المتوسط ​​ووجود شوائب بروتين αSyn. يحاكي تطبيق αSyn البشري علم أمراض الخميرة مما يؤدي إلى السمية الخلوية والتكوين الكلي. تتم فسفرة αSyn بكثرة في سيرين S129 وتمتلك أربعة أنواع من التيروزينات (Y39 و Y125 و Y133 و Y136) والتي يمكن تعديلها بعد الترجمة عن طريق النترات أو الفسفرة. لا تزال نتيجة كل من هذه التعديلات المحتملة غير واضحة. تعتبر النترات نتيجة الإجهاد التأكسدي سمة مميزة للأمراض التنكسية العصبية. هنا ، تناولنا الآلية الجزيئية ، كيف تؤثر تعديلات التيروزين بعد الترجمة على السمية الخلوية αSyn. يمكن أن تساهم نترات التيروزين في سمية αSyn أو يمكن أن تكون جزءًا من مسار الإنقاذ الخلوي عند تكوين ثنائيات التيروزين المتشابكة. تحدد بقايا Y133 ، والتي يمكن أن تكون فسفرة أو نترات ، ما إذا كان S129 مُفسفرة بشكل وقائي ويتم مسح محتويات αSyn. يوضح هذا التفاعل مع الفسفرة S129 دورًا مزدوجًا لبقايا التيروزين C- الطرفية. تحمي الخميرة flavohemoglobin Yhb1 ونظيره البشري NGB الخلايا من السمية الخلوية والتكوين الكلي. تشير هذه الرؤى الجديدة في المسارات الجزيئية المسؤولة عن السمية الخلوية αSyn إلى NGB كهدف محتمل للتدخل العلاجي في PD.

الاقتباس: Kleinknecht A و Popova B و Lázaro DF و Pinho R و Valerius O و Outeiro TF وآخرون. (2016) تعديلات بقايا التيروزين C-Terminal تعدل الفسفرة الوقائية لسيرين 129 من α-Synuclein في نموذج الخميرة لمرض باركنسون. بلوس جينيت 12 (6): e1006098. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006098

محرر: بينغوي لو ، كلية الطب بجامعة ستانفورد ، الولايات المتحدة

تم الاستلام: 22 ديسمبر 2015 وافقت: 10 مايو 2016 نشرت: 24 يونيو 2016

حقوق النشر: © 2016 Kleinknecht et al. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ في أي وسيط ، بشرط ذكر المؤلف والمصدر الأصليين.

توافر البيانات: جميع البيانات ذات الصلة موجودة داخل الورقة.

التمويل: تم تمويل هذا العمل من قبل DFG Cluster of Excellence و DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (CNMPB). يتم دعم RP بواسطة زمالة الدكتوراه من FCT Portugal (SFRH / BD / 80884/2011). لم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

تضارب المصالح: وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.


مناقشة

يعتبر الربط بين البروتينات المضطربة جوهريًا والمرتبة مجالًا مهمًا ، وتعد محاكاة الديناميكيات الجزيئية إحدى الطرق الأكثر ملاءمة لدراستها ، خاصة للإجابة على الأسئلة الميكانيكية. لقد وصفنا التغييرات التوافقية لبروتين مضطرب جوهريًا ، AANAT ، قبل وبعد الفسفرة وأثناء الارتباط بـ 14-3-3ζ، وهو بروتين سقالة مرتب. من أجل المتانة الإحصائية ، نجري ثلاث تجارب مستقلة تعطي نتائج واستنتاجات مكافئة (تتضمن كل واحدة ثلاث عمليات محاكاة 110 نانوثانية مع أو بدون فسفرة Thr31 ، تلخيصًا لوقت المحاكاة الإجمالي لأكثر من 300 نانوثانية × 2). يتم تضمين التفاصيل الكاملة والمؤامرات لجميع الكميات المقاسة في كل تشغيل محاكاة في قسم المعلومات التكميلية. في عمل سابق ، اقترحنا نظريًا وجود مركب شبه أصلي غير مستقر بين هذين البروتينين ، ووصفنا دور بقايا المرساة في هذه العملية. يساهم Glu87 في عملية الربط بين AANAT و 14-3-3ζ عبر اتصالات جزيئية محددة ، ويلاحظ فقدان الألفة عند تحور هذه البقايا المحددة إلى Ala (الشكل 1). ومع ذلك ، لم تظهر تجربة التدفق المتوقف لدينا أي مؤشرات على وجود معقدات أقل تقارب أثناء ربط Glu87Ala mutant AANAT و 14-3-3ζلذلك ظلت ديناميكيات هذه العملية نحو المجمع المستقر النهائي غير مفسرة.

تم نشر بعض المقالات التي تصف آليات الربط باستخدام مجال نظام KID النموذجي لعامل النسخ CREB بواسطة الديناميات الجزيئية الحرة. ومع ذلك ، في الوقت الحالي ، فإن محاكاة الديناميكيات الجزيئية المتوازنة لجميع الذرات للطي والربط المقترنين بعيدة المنال بالنسبة لغالبية الباحثين. من الواضح إذن أن أفضل فرصة للحصول على معلومات الاستبانة الذرية حول الطي والربط المقترنين تعتمد على استخدام طرق أخذ العينات المحسنة 15 ، مثل الإمكانات المقيدة بشكل متناغم. تؤدي الفسفرة KID إلى حدوث تحول طفيف في توزيع التوازن للمناطق المطوية. يمكن أن يؤدي ربط المناطق المقيدة والمغلقة حركيًا إلى إعطاء تفاعلات عابرة أخرى وقتًا لتشكيلها ، مما قد يؤدي إلى زيادة عدد أحداث الربط المنتجة وبالتالي زيادة التقارب لشريك الربط. وبالمثل ، فإن المناطق المغلقة حركيًا التي تشارك في التعرف الجزيئي يمكن أن تحبط عملية فك الارتباط. سيؤدي هذا إلى تحول في توازن الربط نحو حالة الربط 16،17. مثال آخر هو فسفرة مجال KH1 من KSR ، والذي يتكشف وينشئ موقعًا لـ 14-3-3ζ تجليد 18. يتفاعل المجال KH1 مع 14-3-3ζ فقط عندما يتم فسفرته وفتحه. إن فسفرة AKT لـ KH1 هي المسؤولة عن كشفها ، والتي تشكل موقع الربط لـ 14-3-3ζ. إعادة الترتيب الهيكلي عند الفسفرة هي آلية تنظيمية شائعة 19 ، ولكن لا توجد أمثلة مبلَّغ عنها ، على حد علمنا ، لتحليل ربط البروتين بالبروتين الكامل.

تشير نتائجنا إلى أن الفسفرة في 14-3-3ζ البروتينات المستهدفة لها آثار واسعة أثناء عملية الربط وليس فقط في تثبيت المجمعات النهائية. يحتوي AANAT على موقعين أساسيين ، أحدهما في الطرف N والآخر في الطرف C للبروتين. ومع ذلك ، لا يمكن حل التركيب البلوري المعقد إلا عند إزالة موقع الربط الطرفي C الثاني (يعتبر أقل صلة). هنا ، استخدمنا الوحدة الأولية (مونومر واحد من 14-3-3ζ و C- الطرفية المقطوعة AANAT) لتحليل كيفية تأثير الفسفرة على الارتباط بين AANAT و 14-3-3 ميكانيكيًاζ. لتقليل التكاليف الحسابية ، طبقنا بروتوكولًا مقسمًا إلى ثلاث مناطق بإجمالي 110 نانوثانية من وقت المحاكاة. من أجل المتانة الإحصائية ، نجري ثلاث عمليات محاكاة مستقلة تعطي نتائج واستنتاجات متطابقة. في أول وآخر 10 نانوثانية ، طبقنا إمكانات توافقية للحث على تكوين المجمعات الزائفة الأصلية والمجمعات الأصلية ، على التوالي. في المنطقة الثانية ، نقوم بتشغيل 90 نانوثانية من الديناميكيات غير المقيدة. لقد لاحظنا بوضوح أن فسفرة Thr31 تعطي هذه البقايا (والأحماض الأمينية المحيطة) القدرة على استكشاف المزيد من المطابقات باتباع آلية تسمى "fly-casting" 5. خلال هذه العملية ، يتم زيادة نصف قطر الالتقاط وتحسين عملية الربط. حسبنا نصف قطر الالتقاط كنصف قطر دوران المخلفات محل الاهتمام (انظر المعادلة 2) ولاحظنا زيادة بنسبة 40٪ في Thr31 (انظر الشكل 7 ب). والمثير للدهشة أن هذه الفسفرة لها آثار أيضًا في 14-3-3ζ، بشكل رئيسي من خلال التفاعلات طويلة المدى. لاحظنا أن المنطقة التنظيمية الرئيسية في 14-3-3 (α-helix 9) يتأثر أيضًا بفسفرة Thr31 في AANAT كحركة هذه المنطقة (α- حلزوني 9) يزداد أيضًا (الشكل 7 أ). تسمح هذه الحركات المحسّنة لنظام البروتين البروتين بالوصول إلى مجمع نهائي أكثر إحكاما في نهاية عمليات المحاكاة الخاصة بنا. لقياس هذا ، تُستخدم خرائط 3D-SASA هنا كتقديرات شبه كمية للطاقة الخالية من الذوبان عند معقد البروتين 20. لشرطيننا (AANAT و AANAT *) المجمع النهائي هو

3.5 Å فيما يتعلق بالهيكل البلوري المعقد ، ومع ذلك ، في حالة AANAT ، يكون للهيكل النهائي سطح معرض للمذيبات أكثر بكثير مما هو عليه في AANAT * واحد ، مما يشير إلى تشكل أقل استقرارًا (انظر الشكل 7 ج ، د).

غالبًا ما يعتمد الارتباط الأولي بين البروتينات التي تحتوي على IDR بشدة على القوة الأيونية ، مما يدل على أن تفاعلات الشحن والشحن المحددة أو غير المحددة تحكم معدل الارتباط 21. يوجه المجال الكهروستاتيكي البروتين إلى هدفه وبالتالي يسرع معدل الارتباط. تسهل مرونة البروتين أيضًا الارتباط عبر آلية صب الذباب 22. نتائجنا تتفق بشدة مع هذا التفسير. 14-3-3ζ هو بروتين بشحنة سالبة صافية 23 ونقطة ساخنة موجبة حيث ترسو مجموعة الفوسفوريل من شركائها ، مما يدل على أن فسفرة Thr31 على AANAT هي المفتاح خلال عملية الربط.

الرؤية الحالية لفسفرة البروتين لديها سؤال بدون إجابة واضحة: هل الفسفرة المتبقية المفردة يتوسطها بروتين سقالة؟ وعلى وجه الخصوص ، هل البروتينات 14-3-3 قراء التعديل فقط؟ كما تبين في هذا العمل ، فإن الفسفرة لها تأثيرات على كل من بروتين الشريك والقارئ بمعنى واسع. نقترح أن الفسفرة يجب أن تحدث قبل ارتباط البروتين بالبروتين وأن 14-3-3 بروتينات تقرأ فقط التعديل ولا تشارك فيه.


مقدمة

تتوسط مجموعتان متميزتان على الأقل من الحويصلات الإفرازية في الإطلاق المنظم للخلايا الخارجية للناقلات العصبية. تظهر الحويصلات المشبكية (SVs) بشكل حصري تقريبًا في النهايات العصبية حيث تتجمع عند الشق المشبكي (Calakos and Scheller 1996). في المقابل ، تظهر الحويصلات الأساسية الكثيفة الكبيرة (LDCVs) في جميع أنحاء الخلية ، وتطلق جهاز الإرسال بشكل أبطأ واستجابة لمحفزات مختلفة عن SVs (De Camilli and Jahn 1990 Martin 1994). على الرغم من أن SVs يُنظر إليها عمومًا على أنها تحتوي على أجهزة إرسال كلاسيكية ، في حين أن LDCVs تخزن الببتيدات العصبية ، فإن كلا النوعين من الحويصلات الإفرازية المنظمة يحتويان على أحادي الأمين ، مما يشير إلى إمكانية إطلاق جهاز إرسال واحد من خلال آليتين متميزتين (Thureson-Klein 1983 Bruns and Jahn 1995). نظرًا لأن المرسلات الكلاسيكية ، بما في ذلك أحادي الأمين ، يتم تصنيعها في السيتوبلازم ، فإن الموقع تحت الخلوي للناقلات المطلوبة لتعبئتها في حويصلات إفرازية يحدد موقع التخزين الحويصلي ، وبالتالي ، طريقة إطلاق الخلايا الخارجية.

تُظهر الحويصلات الإفرازية أربعة أنشطة نقل عصبية متميزة ، بما في ذلك نشاط أحادي الأمين ، وثاني لأسيتيل كولين (ACh) ، وثالث لحمض am-aminobutyric (GABA) ، ورابع للجلوتامات (Liu and Edwards 1997b). تعتمد كل هذه الأنشطة على التدرج الكهروكيميائي H + عبر غشاء الحويصلة ، وتبادل البروتونات التجويف لجهاز الإرسال السيتوبلازمي (Schuldiner et al. 1995). يشير التلاعب الدوائي في النقل الحويصلي إلى أهمية هذه الأنشطة للسلوك. يثبط عقار ريزيربين الخافض للضغط النقل الأحادي الأمين الحويصلي ويؤدي إلى متلازمة تشبه الاكتئاب (فريز 1954). بالإضافة إلى ذلك ، تحفز الأمفيتامينات التدفق من مخازن أحادي الأمين الحويصلي (Sulzer et al. 1995) ويمكن أن تسبب الذهان. وبالتالي ، فإن التغييرات في نشاط النقل الحويصلي لديها القدرة على التأثير على السلوك ، لكن مدى خضوعها للتنظيم ظل غير معروف.

بدأ الاستنساخ الجزيئي في تحديد البروتينات المسؤولة عن نقل الناقل العصبي إلى الحويصلات الإفرازية. تشتمل عائلة واحدة من البروتينات على ناقلتي أحادي الأمين الحويصلي (VMATs) وناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (VAChT). يتم التعبير عن VMAT1 بشكل أساسي في الأنسجة المحيطية غير العصبية ويتم التعبير عن VMAT2 بواسطة الخلايا العصبية أحادية الأمين المركزية (Varoqui and Erickson 1997 Liu and Edwards 1997b). تمشيا مع الإطلاق الملحوظ للأمينات الأحادية من كل من SVs و LDCVs ، تحدث VMAT على مجموعات متعددة من الحويصلات الإفرازية. في الدماغ ، يتم توطين VMAT2 بشكل تفضيلي على LDCVs ، ولكنه يتواجد أيضًا على SVs ، وكذلك الهياكل الأنبوبية الحويصلية في جسم الخلية والتشعبات في الخلايا العصبية المركزية للدوبامين (Nirenberg et al. 1995 ، Nirenberg et al.1996). وبالمثل ، يتواجد VMAT2 في الغالب على LDCVs بدلاً من الحويصلات الدقيقة الشبيهة بالمشابك (SLMVs) الموجودة في خلايا PC12 (Liu et al. 1994 Erickson et al. 1996). في المقابل ، يتم توطين VAChT في الغالب إلى SVs في الدماغ (Gilmor et al. 1996 Weihe et al. 1996) والأغشية الأخف ، بما في ذلك SLMVs في خلايا PC12 (Liu and Edwards 1997a Varoqui and Erickson 1998). ومع ذلك ، يحدث VAChT أيضًا عند مستويات منخفضة في LDCV في خلايا PC12 (Liu and Edwards 1997a) وفي الخلايا العصبية (Lundberg et al. 1981 Agoston and Whittaker 1989). وهكذا ، فإن اثنين من الناقلات العصبية الحويصلية وثيقة الصلة ببعضها البعض يتم توطين مجموعات متميزة من الحويصلات الإفرازية التي تختلف في طريقة إطلاقها.

لفهم كيفية توطين VMAT2 و VAChT لحويصلات إفرازية مختلفة ، سعينا لتحديد إشارات الفرز الخاصة بهم. كبروتينات غشائية متكاملة ، من المفترض أن تعتمد الناقلات على الإشارات في مجالاتها السيتوبلازمية التي تتفاعل مع آلية الفرز الخلوي. لقد وجدنا سابقًا أن أشكال ديليوسين تقع على طرف COOH في مجال الغشاء (TMD) لكل من VMAT2 و VAChT (انظر الشكل 1 أ) تتوسط استيعاب الناقلات من غشاء البلازما (تان وآخرون ، 1998). تتطلب أشكال Dileucine المتورطة في الالتقام الخلوي لبعض البروتينات الأخرى وجود بقايا حمضية في الموضعين 4 و 5 بالنسبة إلى الليوسينين (Pond et al. 1995 Dietrich et al. 1997) و VMATs تحتوي على غلوتامات محفوظة بدرجة عالية في كلاهما. هذه المواقف. ومع ذلك ، فإن استبدال هذه الجلوتامات بالألانين لا يضعف استيعاب VMAT2 (تان وآخرون ، 1998). نظرًا لأن أشكال الديليوسين تتوسط في الاتجار في مواقع متعددة في المسار الإفرازي ، فقد تؤثر هذه البقايا على أحداث أخرى ، تختلف عن الالتقام الخلوي. على الرغم من أن VAChT ، مثل VMATs ، يحتوي على غلوتامات عند −4 بالنسبة إلى الديليوسين ، إلا أنه يحتوي على سيرين عند −5 ، مما يزيد من احتمال توطين الناقلات على مجموعات متميزة من الحويصلات الإفرازية. بالإضافة إلى ذلك ، يشير وجود سيرين عند −5 بالنسبة إلى ديليوسين في VAChT إلى أن فسفرة هذه البقايا قد تؤثر على فرز الناقل. في الواقع ، فإن فسفرة مخلفات السيرين عند −5 بالنسبة إلى أشكال الديليوسين في CD4 (شين وآخرون 1991) و CD3γ (ديتريش وآخرون 1994) تؤثر بشكل كبير على تهريب هذه البروتينات.

نبلغ الآن أن السيرين عند −5 بالنسبة لعزر ديليوسين في VAChT (Ser-480) يخضع للفسفرة بواسطة شكل إسوي معتمد على الكالسيوم من بروتين كيناز C (PKC). استبدال Ser-480 بواسطة الألانين ، الذي يمنع الفسفرة ، يقلل من التعبير عن VAChT على LDCVs بالنسبة إلى البروتين من النوع البري. في المقابل ، فإن استبدال Ser-480 بالغلوتامات ، لتقليد تسلسل VMAT2 في هذا الموضع وحدث الفسفرة ، يزيد من التعبير عن VAChT على LDCVs. تمشيا مع أهمية المخلفات الحمضية المنبع لعزر ديليوسين في الفرز إلى LDCVs ، فإن استبدال Glu-478 و -479 المنبع من الشكل الشبيه بالديليوسين في VMAT2 يقلل من التوطين إلى LDCVs. توفر النتائج بعض المعلومات الأولى حول الإشارات المتضمنة في الفرز إلى فئات مختلفة من الحويصلات الإفرازية. بالإضافة إلى ذلك ، يقترحون أن الفسفرة تنظم استهداف VAChT إلى LDCVs ، مما يوفر آلية محتملة لتنظيم إطلاق جهاز الإرسال.


ماذا يعني مصطلح "موضع البقايا المعدلة" في الفسفرة؟ - مادة الاحياء

تعمل kinases المنشط p21 (Paks) كمؤثرات لعائلة Rho GTPases Rac و Cdc42. تنقسم الباكست البشرية الستة إلى مجموعتين بناءً على تشابه التسلسل. تقوم المجموعة الأولى باكس (باك 1 إلى -3) بفوسفوريلات عدد من الركائز التي تربط هذه المجموعة بتنظيم الهيكل الخلوي والإشارات التكاثرية والمضادة للاستماتة. يُعتقد أن Group II Paks (Pak4 to -6) تلعب أدوارًا وظيفية مميزة ، ومع ذلك فإن ركائزها القليلة المعروفة مستهدفة أيضًا من قبل Group I Paks. لتحديد ما إذا كانت المجموعتان تتعرفان على تسلسلات مستهدفة متميزة ، استخدمنا طريقة مكتبة الببتيد المتدهورة لتوصيف أشكال الفسفرة الإجماعية لمجموعة باكز المجموعة الأولى والثانية. نجد أن Pak1 و Pak2 يُظهران خصوصية ركيزة متطابقة تقريبًا تختلف عن خصوصية Pak4. استنادًا إلى المقارنات الهيكلية والطفرات ، حددنا اثنين من بقايا الأحماض الأمينية الرئيسية التي تتوسط الخصائص المميزة للمجموعة الأولى والثانية من باكس وتقترح أساسًا هيكليًا لهذه الاختلافات. تشير هذه النتائج ، لأول مرة ، إلى بقايا من الفص الصغير للكيناز في انتقائية الركيزة. أخيرًا ، استخدمنا نموذج إجماع Pak1 للتنبؤ بموقع جديد للفسفرة Pak1 في Pix (صak-أناغير نشط هxعامل التغيير) وإثبات أن Pak1 فسفوريلات هذا الموقع على حد سواء في المختبر وفي الخلايا المستنبتة. بشكل جماعي ، توضح هذه النتائج خصوصية باك كينازات وتوضح طريقة عامة لتحديد المواقع الجديدة التي تمت فسفرتها بواسطة باكس.

تم دعم هذا البحث جزئيًا من قبل الجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان - جائزة مركز فوكس تشيس للتطوير الوظيفي في أبحاث السرطان متعدية ، من خلال منحة برنامج أبحاث الورم العصبي الليفي التابع لوزارة الدفاع W81XWH-05-1-0200 ، ومنحة من قسم بنسلفانيا الصحة (الكل لـ JRP). تم تقديم دعم إضافي من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنحة CA006927 ومن خلال اعتماد من كومنولث بنسلفانيا إلى مركز فوكس تشيس للسرطان. اتحاد الجينوم الإنشائي مؤسسة خيرية مسجلة (رقم 1097737) ممولة من Wellcome Trust و GlaxoSmithKline و Genome Canada والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية و Ontario Innovation Trust و Ontario Research and Development Challenge Fund والمؤسسة الكندية للابتكار و VINNOVA ، ومؤسسة Knut and Alice Wallenberg ، والمؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية ، ومعهد Karolinska. تم تحمل تكاليف نشر هذه المقالة جزئيًا عن طريق دفع رسوم الصفحة. لذلك يجب وضع علامة على هذه المقالة بموجب هذا "الإعلانات"وفقًا لـ 18 U.S.C. القسم 1734 فقط للإشارة إلى هذه الحقيقة.

تحتوي النسخة الإلكترونية من هذه المقالة (متوفرة على http://www.jbc.org) على الجدولين التكميليين 1 و 2 والشكل 1.

بدعم من تمويل من NCI ، المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، منحة T32 CA009035.

العنوان الحالي: قسم علم الأحياء ، جامعة ولاية كانساس ، مانهاتن ، كانساس 66502.


دعم المعلومات

يوفر هذا وصفًا مفصلاً للتحليل الهيكلي الثانوي والتحليل RMSF لـ KLHL3 (المعلومات الداعمة الشكل S1) ، والإمكانات الكهروستاتيكية لـ KLHL3 لعمليات المحاكاة المتوازنة (المعلومات الداعمة الشكل S2) ، روابط هيدروجينية تعتمد على الوقت وتتكون بين المخلفات الرئيسية لـ KLHL3 و الشكل الحمضي لـ WNK4 (المعلومات الداعمة الشكل S3) ، مقارنة طاقة التفاعل لبقايا KLHL3 المتضمنة في التفاعلات الكارهة للماء بين مجال Kelch والعنصر الحمضي لـ WNK4 (دعم المعلومات الشكل S4) ، والمسافة بين الشكل الحمضي و Kelch (المعلومات الداعمة الشكل S5) وكذلك مقارنة بين المسافات في وجود pS433 و pS433 البروتوني (المعلومات الداعمة الشكل S6).


الكاتب الاشتراكات

صممت DB و FDR و AB تجارب هذه الدراسة. أجرى DB و ES و AA و AT و CB و AN التجارب. أجرى DB و FDR و AB تحليل البيانات ومناقشة نقدية للنتائج. ساهم كل من DB و DR و SP و FDR و AB في كتابة وتحرير المخطوطة. وافق جميع المؤلفين على المسودة النهائية للمخطوطة.

اسم الملف وصف
mol212881-sup-0001-FigS1.jpg صورة JPEG ، 1.3 ميجا بايت الشكل S1. تقييم كفاءة تعداء. تم تلطيخ خلايا HEK-293 المنقولة لمدة 48 ساعة باستخدام ناقل تجريبي (CTRL) ووزن p27 و G9R-p27 بأجسام مضادة ثانوية مضادة لـ p27 مللي أمبير وأضداد ثانوية ذات علامات مضان وتم تحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي باستخدام FACScalibur. تم إجراء الحسابات على أكثر من 30000 حدث. يتضمن M2 خلايا معبرة عن الوزن والطفرة p27 ، تتوافق على الأقل مع 50 ٪ من مجموعات الخلايا بأكملها. يشتمل M1 على خلايا ذات مستوى منخفض جدًا من التألق يتوافق مع تلطيخ p27 الداخلي.
mol212881-sup-0002-FigS2.jpg صورة JPEG ، 1.8 ميجا بايت الشكل S2. قدرة تكوين الخلايا الكروية التي تعبر عن wt-p27 و G9R-p27. تم نقل خلايا LN-229 الورم الأرومي الدبقي في اليوم السابق باستخدام ناقل فارغ (CTRL) أو ترميز البلازميدات WT- ، وتم زرع G9R-p27 في matrigel لفحص غزو الورم ثلاثي الأبعاد القائم على كروي. يتم الإبلاغ عن التفاصيل تحت عنوان "المواد والأساليب". لوحظت الثقافات تحت المجهر الضوئي وأخذت الصور في 4 و 5 و 6 أيام بعد البذر. تكررت التجربة ثلاث مرات ، بينما يوضح الشكل نتائج مكررين لكل نقطة زمنية. على اليمين ، الصور التي تم الحصول عليها بعد 6 أيام من التضمين بتكبير أعلى: تظهر الثقافات المعبرة عن G9R وجود خلايا تظهر منفصلة عن المجالات (الخلايا البارزة).
mol212881-sup-0003-FigS3.jpg صورة JPEG ، 1.5 ميجا بايت الشكل S3. قدرة تكوين كروي لخلايا PC-3 تعبر عن wt-p27 و G9R-p27. تم نقل خلايا PC-3 في اليوم السابق باستخدام ناقل فارغ (CTRL) أو ترميز البلازميدات WT- ، وتم زرع G9R-p27 في matrigel لفحص غزو الورم ثلاثي الأبعاد القائم على كروي. يتم الإبلاغ عن التفاصيل تحت عنوان "المواد والأساليب". لوحظت الثقافات تحت المجهر الضوئي وأخذت الصور في 6 أيام بعد البذر. أعيدت التجربة ثلاث مرات ، بينما أظهر الشكل نتائج مكررين. على اليمين واليسار ، تم الحصول على صور بتكبير مختلف. في المركز ، تم قياس قطر المستعمرات التي تم الحصول عليها باستخدام شريط المقياس (50 ميكرومتر) كمرجع. النتائج المعروضة هي متوسط ​​3 قرارات تم الحصول عليها في ثلاث تجارب مستقلة ويظهر الانحراف المعياري. تم تحليل البيانات من قبل الطالب ر اختبار. *ص & لتر 0.05.
mol212881-sup-0004-FigS4.jpg صورة JPEG ، 961.2 كيلوبايت الشكل S4. تحليل موت الخلايا المبرمج للخلايا التي تعبر عن G9R-p27 مقارنة بالوزن p27. تم نقل خلايا PC-3 لمدة 48 ساعة باستخدام ناقل فارغ pcDNA3.0 وترميز pcDNA3.0 p27 أو G9R-p27. بعد ذلك ، عولجت الخلايا لمدة 18 ساعة باستخدام 1 ميكرومتر من الستوروسبورين. تم جمع الخلايا ومعالجتها باستخدام Alexa Fluor 488 Annexin V / Dead Cell Apoptosis Kit وفقًا لإشارات الشركة المصنعة. يتم التحكم في هذه التجربة عن طريق الخلايا المنقولة بالناقل الفارغ ومعالجتها باستخدام ستوروسبورين (ستوروسبورين) كما ورد تحت عنوان "المواد والأساليب". تم الكشف عن موت الخلايا المبرمج عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام FACScalibur وحساب 50000 حدث. يشتمل الربع العلوي الأيمن (UR) على خلايا موت الخلايا المبرمج.
mol212881-sup-0005-FigS5.jpg صورة JPEG ، 839.8 كيلوبايت الشكل S5. تحليل ثنائي الأبعاد للطفرات المنقولة من G9R-p27. (أ) تحليل 2D / WB لمقتطفات الخلايا من خلايا PC-3 المنقولة باستخدام بلازميدات pcDNA3.0 التي تشفر S10A / G9R-p27 ، S10A / T187A / G9R-p27 [* T187A] ، S10A / T198V / G9R-p27 [* T198V ] و S10A / T157A / G9R-p27 [* T157A] و S10A / Y (74،88،89) F / G9R-p27 [* Y (74،88،89) F] على اليسار ، والبلازميدات ترميز S10A / G9R-p27، S7A / S10A / G9R-p27 [* S7A]، S183A / S10A / G9R-p27 [* S183A]، S83A / S10A / G9R-p27 [* S83A] على اليمين. بعد النشاف ، تم تحليل المرشحات بواسطة mAb anti-p27. الإشارات 0 و 1 تتوافق مع البروتين غير المعدل و 1Pi على التوالي. (ب) تم نقل خلايا هيلا بواسطة بلازميدات pcDNA3.0 التي تشفر G9R-p27 و S10A / G9R-p27 [* S10A] و S12A / G9R-p27 [* S12A]. تم تحضير المستخلصات الخلوية وتحليلها بواسطة 2D / WB. بعد النشاف ، تم تحليل المرشحات بواسطة mAb anti-p27. تتوافق الإشارات 0 و 1 و 2 مع البروتين غير المعدل ، 1Pi و 2Pi ، على التوالي. (ج) على اليسار. تحليل 2D / WB لمستخلصات الخلايا من خلايا K562 المنقولة بواسطة بلازميدات pcDNA3.0 التي تشفر G9R-p27 و S12A / G9R-p27 [* S12A]. بعد النشاف ، تم تحليل المرشحات بواسطة mAb anti-p27. تتوافق الإشارات 0 و 1 و 2 مع البروتين غير المعدل ، 1Pi و 2Pi ، على التوالي. على اليمين. تحليل 2D / WB لمستخلصات الخلايا من خلايا SH-SY5Y المنقولة بواسطة بلازميدات pcDNA3.0 التي تشفر G9R-p27. بعد النشاف ، تم تحليل المرشحات بواسطة mAb anti-p27. تتوافق الإشارات 0 و 1 و 2 مع البروتين غير المعدل ، 1Pi و 2Pi ، على التوالي. (د) على اليسار. تحليل 2D / WB لمستخلصات الخلايا من خلايا K562 المنقولة بواسطة بلازميدات pcDNA3.0 التي تشفر بروتين p27 ومشتقاته S12A / p27 [* S12A] و S12D / p27 [* S12D]. على اليمين. تشير الرسوم البيانية إلى النسبة المئوية لشدة كل إشارة (غير معدلة ، 1Pi-isoforms) بالنسبة لإجمالي p27 والبروتينات الطافرة المشتقة. تم تقييم شدة الإشارات المحددة باستخدام برنامج تحليل صورة هلام TotalLab CLIQS. البيانات المعروضة هي نتائج ثلاث تجارب مستقلة. تمثل القضبان الانحراف المعياري. تم تحليل البيانات من قبل الطالب ر اختبار. **ص & لتر 0.01.
mol212881-sup-0006-FigS6.jpg صورة JPEG ، 1.3 ميجا بايت الشكل S6. تأثير CDK2 على التوطين النووي والخلوي لـ G9R-p27. (أ) تم فحص مجموعة مختلفة من خلايا MEF لتأكيد عدم وجود بروتين CDK2 و CDK4. تمت تربية MEFs من النوع البري الخالد ، و MEFs التي تفتقر إلى CDK4 ، أو CDK2 أو كليهما CDK4 و CDK2 كما هو الحال في المواد والطرق. بعد ذلك ، تم تحضير المقصورات النووية والعصارة الخلوية وتحليلها من أجل CDK2 و CDK4 بواسطة WB والأجسام المضادة المحددة. تم تحليل المرشحات أيضًا لمحتوى HDAC و PKM2 بواسطة أجسام مضادة محددة من أجل تأكيد التحميل المتساوي وفصل المقصورة. (ب) الشكل العلوي. تم نقل ترميز البلازميد pcDNA3.0 G9R-p27 في مجموعات مختلفة من MEF ، وهي خلايا MEF الخالدة ، و CDK4 - / - MEFs ، و CDK2 - / - و CDK4 - / - CDK2 - / - الخلايا. بعد 24 ساعة ، تم تحضير المقصورات النووية والخلوية وتحليلها بواسطة WB باستخدام mAb anti-p27. تم فحص HDAC1 لتقييم كمية التحميل والنقاء النووي. الرقم السفلي. تم إجراء ثلاث تجارب مماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها في الأعلى. تم تقييم النسبة المئوية للبروتين النووي والخلوي بواسطة برنامج imagej. على أساس البيانات المحددة ، تم إنشاء الرسوم البيانية المعروضة. Error bars represent the standard error of the mean of the experiments. (C) pcDNA3.0 plasmids encoding p27 and G9R-p27 were transfected in parental and CDK2 −/ CDK4 − MEFs. After 24 h, nuclear and cytosol extracts were prepared and analyzed by 2D/WB with mAb anti-p27. For the nuclear extracts, images at different film exposition times are reported. (D) S10/S12/T187A/G9R-p27 protein was prepared from PC-3 transfected cells. The partially purified protein was incubated with recombinant CDK2 for 40 min. The assay mixtures at time 0 and after 40 min were analyzed by 2D/WB.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.


المواد والأساليب

Cell cultures

Vero monkey kidney, epithelial HEK293T or LLCPK1 cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium. Jurkat T lymphoid cells were maintained in RPMI 1640 medium (Bio Whittaker Europe, Verviers, Belgium). Media were supplemented with 10% fetal calf serum and cells were grown at 37°C in 5% CO2.

Antibodies and reagents

Polyclonal rabbit IgGs against L-plastin have been previously characterised (Lapillonne et al., 2000). Mouse monoclonal anti-vinculin antibody was a kind gift of M. Glukhova (Institut Curie, Paris, France) anti-cortactin antibody was purchased from Upstate (TE Huissen, The Netherlands) and anti-vimentin antibody from Santa Cruz Biotechnology (Tebu-Bio, Boechout, Belgium). Polyclonal anti-Ser5-ص antibody against L-plastin phosphorylated at Ser5 was raised against a peptide encoding L-plastin residues 2-17 in which Ser5 was phosphorylated (ARGS(ص)VSDEEMMELREA). Rabbit antiserum was purified by negative affinity on non-phosphorylated peptide followed by positive affinity on the phosphorylated peptide. The monoclonal VII-E-7 antibody against the 13 C-terminal residues of the Sendai virus L protein (sv-tag) was a kind gift of J. Neubert (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Germany). The rabbit polyclonal antibody against the same sequence was described previously (Arpin et al., 1994). The anti-rabbit IgG antibody coupled to horseradish peroxidase was purchased from Amersham Biosciences (Roosendaal, The Netherlands). Cy2-conjugated goat anti-rabbit IgG was purchased from Jackson Immuno-Research Laboratories (De Pinte, Belgium). Alexa Fluor 350- or 594-coupled phalloidin and secondary antibodies were purchased from Molecular Probes (Invitrogen, Merelbeke, Belgium). β-G-actin was purchased from Cytoskeleton (Boechout, Belgium). PKA catalytic subunit, PKA activator 8-Bromo-cAMP, PKA inhibitors H89 and KT5720 and PKC inhibitor GF109 and Gö6796 were purchased from Calbiochem (Leuven, Belgium). Forskolin was obtained from Sigma (Bornem, Belgium). Lipofectin reagent was purchased from Invitrogen.

Site-directed mutagenesis of cDNAs

To mutate Ser5 into Ala or a Glu by a PCR-based approach, Mut5A (5′-AAAAATGGCCAGAGGA GCA GTGTCC-3′), Mut5E (5′-AAAAATGGCCAGAGGA GAA GTGTCC-3′) sense primers corresponding to L-plastin nucleotides 4-21 were used. Underlined sequences indicate mutated amino acids. The common reverse primer (3′-CTTCCCCTCCTTCAGGTCCTCAGC-5′) was complementary to bases 802-780 of L-plastin cDNA and flanked at its 5′-end by an NcoI site. The PCR fragment containing the mutation was used to replace the corresponding fragment of the L-plastin cDNA inserted in the pCB6 expression vector, downstream of the cytomegalovirus promoter. The Ser5Glu and Ser5Ala cDNAs were also cloned into the BamHأنا-EcoRI sites of the pGEX-2T expression vector. Mutated DNAs were verified by sequencing.

Recombinant proteins

Wild-type human L-plastin, as well as the Ser5Glu and Ser5Ala variants of L-plastin were produced in بكتريا قولونية from the pGEX-2T expression vector and purified as described previously (Arpin et al., 1994). The concentration of thrombin-cleaved proteins was determined according to the Bradford method (BioRad, Nazareth, Belgium) and by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using a BSA protein standard curve.

Transient expression of cDNAs in cells

Five or 10 μg of cDNA encoding wild-type human L-plastin or L-plastin variants was transfected respectively into HEK239T cells using calcium phosphate procedure (Chen and Okayama, 1988) or into 5×10 6 Vero cells by electroporation at 240 volt and 950 μF (Toneguzzo et al., 1986). LLCPK1 cells were transfected by Lipofectin.

Treatment of cells with pharmacological agents

Cells were washed with PBS and resuspended in HBSS ++ (1× Hanks' buffered salt solution) containing 20 mM Hepes, 0.5 mM Mg 2+ and 1.0 mM Ca 2+ . Jurkat T lymphoid cells or HEK293T cells were treated with PKA or PKC activators or inhibitors as indicated in the figure legends and described (Wang and Brown, 1999). After treatment, cells were lysed and processed for immunoblotting analysis.

Analysis of L-plastin or L-plastin variants by immunoblotting

Cells were lysed for 30 minutes in ice-cold RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 1% NP40 and 1% Na-deoxycholate) containing a cocktail of protease and phosphatase inhibitors. Lysates were cleared by centrifugation in a microfuge at 16,000 ز for 10 minutes at 4°C, and the protein concentration was determined using a modified Lowry method or Bradford assay (BioRad).

Total cell lysates (20 μg of protein) were separated by PAGE under reducing conditions and transferred onto nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell) using a semi-dry transblot apparatus. Primary antibodies indicated in figure legends were revealed by using secondary antibodies coupled to horseradish peroxidase and enhanced chemiluminescence (ECL). In some experiments, the membrane was stripped as previously described (Janji et al., 1999).

التألق المناعي غير المباشر

Transfected cells were fixed with 3% paraformaldehyde and processed for immunofluorecence labelling as described previously (Friederich et al., 1999). Labelled cells were analysed by epifluorescence microscopy (Leica DMRX microscope, HCX PL APO ×63 or ×100) or a Zeiss laser scanning confocal microscope (LSM-510 Meta). Images were acquired with a linear CCD camera (micromax, Princeton Instruments) and analysed with Metaview or Metamorph software (Universal Imaging Cooperation)

Detergent extraction of cells

Transfected Vero cells were plated onto glass coverslips. After 48 hours, coverslips were cut in halves. One half was directly processed for indirect immunofluorescence, while the other was detergent-extracted with 0.5% Triton X-100 for 16 seconds at 20°C, as previously described (Arpin et al., 1994 Friederich et al., 1992) and then processed for immunofluorescence labelling. For quantification, number of cells with detectable sv-tag labelling per 100 cells were determined for each half coverslip, yielding quantitative information on the transfection efficiency and on the resistance of transfected proteins to detergent extraction.

Phosphorylation of L-plastin in vitro

L-plastin protein was phosphorylated using PKA catalytic subunit (specific activity ⩾750 units/μg of protein) at 30°C in a reaction mixture containing 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 100 μM ATP. To monitor phosphorylation, aliquots were removed, the reaction was stopped by addition of boiling SDS-sample buffer and proteins were analysed by immunoblotting following the ECL detection method (Amersham Bioscience). To analyse F-actin binding capacity of L-plastin, aliquots from the reaction were added to G-actin and processed as described below.

Actin binding and bundling assays

G-actin was polymerised overnight at 4°C or for 4 hours at room temperature in the presence of L-plastin variants in polymerisation buffer (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 0.5 mM EGTA, 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0) as indicated in figure legends. Sedimentation of actin filaments and L-plastin was achieved by high-speed centrifugation at 200,000 ز for 30 minutes. To sediment actin bundles, samples were centrifuged for 15 minutes at 12,000 ز (Glenney, Jr et al., 1981). Proteins in pellets and supernatants were separated by SDS-PAGE. Coomassie-stained protein bands were scanned and densities were quantified using BioCapt and Bio-PROFIL Bio 1D software (Windows applications) or LabImage software 2.7.2 (Kapelan Bio-Imaging Solution).

المجهر الإلكتروني للإرسال

Samples prepared for the above-described bundling assay were analysed by transmission electron microscopy. Aliquots were removed from the mixture before centrifugation and immediately negatively stained with 1% uranyl acetate. Electron micrographs were obtained using a Philips CM 120 microscope at a magnification of 28,000× or 45,000×.

Collagen invasion assays

Gels were prepared in a six-well plate from a collagen-type-I solution (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY). Cells (1×10 5 ) were incubated on top of the gels for 24 hours at 37°C. HEK293T cells inside the gel were scored with a phase contrast microscope controlled by a computer program (Bracke et al., 2001 De Corte et al., 2002). Invasive and superficial cells were counted in 12 fields of 0.157 mm 2 . The invasion index is the percentage of cells invading the gel over the total number of cells counted. DHD-FIB rat colon myofibroblasts were used as a positive control. Experiments were performed in triplicate. Mean values and standard deviations were calculated.

Fast aggregation assay

Cell-cell adhesion was numerically evaluated in an aggregation assay as described earlier (Boterberg et al., 2001). Briefly, single-cell suspensions of HEK293T cells were prepared according to an N-cadherin-saving procedure and allowed to aggregate on a Gyrotory shaker at 80 rpm for 30 minutes in aggregation buffer (1.25 mM Ca 2+ , 0.1 mg DNase /ml, 10 mM Hepes and 0.1% BSA) and equilibrated at physiological pH and osmolarity. Cell aggregation was measured with an LS particle size analyzer (LS 200, Coulter Electronics) after 0 and 30 minutes of aggregation. The relative volume in function of the particle size was used as an index of aggregation. Semi-quantitative evaluation of Fast Aggregation (FA) was determined as follow. Less than 20 μm, no aggregates I between 20 and 100 μm, no aggregates II between 100 and 1000 μm, aggregates III more than 1000 μm, aggregates IV.

Wound healing assay

HEK293T cells (8×10 5 ) were seeded into six-well cell culture plates and 18 hours after seeding, cells were transfected with cDNA constructs. After 48 hours, a wound was made by scratching a line in a confluent monolayer. Cell debris was removed by washing the cells with serum-free medium. Migration of cells into the wound was then observed at different time points. Cells were followed for 24 hours.


شاهد الفيديو: ESSE E FORRÓ PERFEITO CRISTAL E A MORENA COR DE JANBO (أغسطس 2022).