معلومة

هل سيتم التعبير عن تسلسل الحمض النووي المستنتج من تسلسل البروتين من البلازميد؟

هل سيتم التعبير عن تسلسل الحمض النووي المستنتج من تسلسل البروتين من البلازميد؟



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

لدي ملف fasta يحتوي على تسلسل الأحماض الأمينية للجليكوجينين 1: https://www.rcsb.org/fasta/entry/6EQJ

أريد صنع بلازميد ينتج الجليكوجينين 1.

هل من الممكن استخدام تسلسل الأحماض الأمينية الجليكوجينين 1 لإنتاج البلازميد المذكور؟ أم هل يحتاج المرء إلى تسلسل الحمض النووي للقيام بذلك؟


أفتقر إلى المعرفة للإجابة الكاملة على سؤالك ولكن يمكنني تقديم بعض المعلومات المفيدة المحتملة:

  • من الناحية النظرية ، يمكنك بسهولة عكس في silico ترجمة تسلسل الببتيد إلى تسلسل نوكليوتيد لا لبس فيه باستخدام استخدام الكودون المحسن للكائنات المعدلة وراثيًا. يمكنني مشاركة نص Python لذلك.

  • كما يمكنك بسهولة البحث عن تسلسل النوكليوتيدات "الحقيقي" في قواعد البيانات. على سبيل المثال ، استخدم "Blast" للعثور على جين تسلسل الببتيد الخاص بك.

  • لكن الانتباه! هناك حالات معروفة من التسلسلات المحسّنة للشفرات التي تسبب طي البروتين السيئ أو حتى (المفارقة) مستويات تعبير أسوأ من التسلسل الأصلي.

  • هناك برنامج يساعد في تصميم البلازميدات ، أيضًا في ضوء استخدام مشاهد التقييد الفريدة ، مما يساعد على تحديد إنزيمات التقييد الخاصة بك القابلة للتطبيق.


تسلسل كامل لبروتين تشفير الجينات العنقودية أ. تطور الجين من خلال مضاعفات متعددة.

تم عزل الترميز الجيني للبروتين A من Staphylococcus aureus عن طريق الاستنساخ الجزيئي ، وتم العثور على استنساخ فرعي يحتوي على إدراج 1.8 كيلو بايت لإعطاء البروتين الوظيفي A في Escherichia coli. تم تحديد التسلسل الكامل للنيوكليوتيدات للإدخال ، بما في ذلك الجين الهيكلي والتسلسلات المرافقة 5 'و 3'. بدءًا من كودون البادئ TTG ، يعطي إطار القراءة المفتوح الذي يشتمل على 1527 نيوكليوتيدات بروتينًا أوليًا مكونًا من 509 من الأحماض الأمينية والسيد المتوقع = 58703. يُحاط الجين الهيكلي على كلا الجانبين بهياكل متناظرة متبوعة بامتداد من بقايا T ، مما يشير إلى إشارات إنهاء النسخ. وهكذا ، يبدو أن البروتين A يُترجم من mRNA أحادي. يكشف التسلسل عن تماثلات داخلية واسعة النطاق تتضمن وحدة حمض أميني 58 ، مسؤولة عن ربط IgG ، متكررة 5 مرات ووحدة 8 أحماض أمينية ، ربما تكون مسؤولة عن الارتباط بجدار خلية S. aureus ، تكررت 12 مرة. تظهر المقارنات بين المناطق المتكررة تفضيلًا ملحوظًا للطفرات الصامتة ، مما يشير إلى وجود ضغط تطوري للحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية. تشير بنية الجين أيضًا إلى كيفية تطور الجين.


مكتبات

& quotLibrary & quot هي آلية تخزين ملائمة للمعلومات الجينية.

  • عادة ما تكون إما & quotgenomic & quot أو & quotcDNA & quot (أي mRNA في شكل DNA) معلومات وراثية.
  • يمكن استخدام التسلسلات الجينية المستخرجة من معلومات البولي ببتيد المقابلة لتحديد معلومات وراثية محددة داخل المكتبة.

بناء مكتبة (كدنا)

الإنزيم المسؤول عن هذا هو بوليميريز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي ويسمى النسخ العكسي.

  • تقليديا تم عزل النسخ العكسية من الفيروسات الذي يكون جينومه في الواقع في شكل RNA ويجب تحويله إلى DNA مزدوج.
  • عادة ما تحمل هذه الفيروسات نسخة عكسية وظيفية مع مكونها الجيني mRNA عندما تصيب الخلايا.
  • أحد أكثر النسخ العكسية المتاحة تجاريًا شيوعًا هو فيروس مولوني مورين اللوكيميا (MMLV).
  • هذه بوليميراز الحمض النووي المعتمد على الحمض النووي الريبي (كما هو الحال مع جميع البوليمرات) تضيف نيوكليوتيدات إلى عديد النوكليوتيد المجاور في اتجاه 5 'إلى 3' باستخدام RNA كـ نموذج . لا يحتوي على أي نشاط نوكلياز خارجي 3 '- & gt5' (تصحيح التجارب المطبعية).

سيستخدم MMLV mRNA كقالب ، لكنه يتطلب ملف التمهيدي (يمكن أن تمدّد أساس DNA ولكن لا يمكنها أن تصنع واحدًا).

  • أحد الأشياء الرائعة حقًا حول الرنا المرسال حقيقية النواة هو وجود 3 مسارات بولي أ.

لاحظ أننا أنتجنا الحمض النووي التكميلي (أو كدنا) إلى حبلا مرنا الأصلي.

إذا تمكنا من إدخال & quotnicks & quot في نصف RNA من ازدواج DNA / RNA هذا ، فسيكون الوضع مشابهًا جدًا لتلك التي لوحظت في & quot؛ تخليق & quot تركيب الحمض النووي الجيني بدائية النواة.

  • يمكن إدخال النكات في نصف جزيء RNA من خلال عمل إنزيم RNAse H.
  • يعرض هذا الإنزيم انقسامًا داخليًا للنووية في جزء RNA من هجين RNA / DNA ، بالإضافة إلى نشاط 5 '- & gt3' و 3 '- & gt5' exoribonuclease.
  • بمعنى آخر ، سوف يكسر الحمض النووي الريبي (RNA) ثم يشرع في الهضم مرة أخرى في كلا الاتجاهين:
  • يمكن أن تعمل شظايا الحمض النووي الريبي الآن كبادئات لتخليق الحمض النووي بواسطة بكتريا قولونية سوف يترجم هذا الإنزيم أيضًا & quotnicks & quot لإزالة البادئات RNA بشكل فعال:

الشكل 3.6.3:تخليق الحمض النووي

لاحظ أنه من المحتمل أن يكون لدينا منطقة غطاء RNA متبقية 5 '، أو فجوة في نهاية 5' من حبلا mRNA الأصلي.

إدخال [كدنا] في البلازميد.

لإكمال بنائنا لمكتبة cDNA مفيدة نحتاج إلى طريقة صيانته ونشره لدينا [كدنا].

  • يمكننا تحقيق ذلك عن طريق إدخال cDNA في ملف بلازميد.
  • هناك طريقتان تقليديتان لإنجاز هذا العمل الفذ:
  1. المخلفات المتجانسة
  2. إضافة رابط

المخلفات المتجانسة

محطة ترانسفيراز هو بوليميراز DNA غير عادي يوجد فقط في نوع من الخلايا حقيقية النواة يسمى a prelymphocyte.

  • بحضور أ الكاتيون ثنائي التكافؤ الإنزيم يحفز إضافة dNTP's إلى 3'- هيدروكسيل ترميني من الحمض النووي.
  • عندما يكون النيوكليوتيدات المراد إضافته عبارة عن بورين ، فإن Mg 2+ هو الكاتيون المستخدم.
  • عندما يكون النوكليوتيدات المراد إضافته عبارة عن بيريميدين ، يتم استخدام Co 2+.
  • اعتمادًا على ظروف التفاعل ، ستتم إضافة من ثلاثة إلى عدة آلاف من القواعد.

الشكل 3.6.4:نشاط ترانسفيراز الطرفي

  • إذا قطعنا البلازميد الخاص بنا وعاملناه أيضًا مع ترانسفيراز طرفي ، ماعدا الآن نضيف قاعدة تكميلية إلى الذي أضفناه إلى (كدنا) لدينا ، يمكننا أن نصلب وربط (كدنا) بالبلازميد.

الشكل 3.6.5:ربط (كدنا) بالبلازميد

  • فائدة إدراج C-tailed cDNA insert في موقع G-tailed Pst I في المتجه كما يلي:
  1. تسلسل التعرف على Pst I وموقع الانقسام هو
    5 'C T G C A G 3'
    3 'جي أ سي جي تي سي 5'
  2. انقسام هذا الموقع بواسطة Pst I ، متبوعًا بـ G-tailing سينتج
    5 'C T G C A (G)ن G 3 '
    3 'G (G)ن أ سي جي تي سي 5 '

الوصلات

هناك طريقة بديلة لإدراج أجزاء (كدنا) في ناقل مكتبة وهي من خلال إضافة & quotlinkers & quot.

    الوصلات عبارة عن أليغنوكليوتيدات قصيرة (

الخطوات في إضافة الرابط هي كما يلي:

  1. علاج [كدنا] مع نوكلياز S1 (لإزالة 5 'غطاء مرنا الجزء المتبقي في [كدنا] على الوجهين
  2. قم بتحويل النهايات المحتملة والمقتطعة والمقتطفة لتقلل من خلال العلاج باستخدام Pol I (سوف تملأ 5 'نتوءات وتمضغ 3' نتوءات)
  3. الميثيلات (كدنا) في مواقع Eco RI الداخلية المحتملة عن طريق المعالجة بـ Eco RI methylase (بالإضافة إلى S-adenosyl methionine)
  4. اربط الروابط لتقليل cDNA الميثلي باستخدام T4 DNA ligase
  5. قطع الوصلات باستخدام نوكلياز داخلي لتقييد Eco RI
  6. إزالة شظايا رابط من شظايا (كدنا) بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام
  7. اربط (كدنا) إلى جزء الحمض النووي المتجه (تم فتحه بواسطة نوكلياز التقييد Eco RI

تم نشر هذا الكتاب المدرسي في عام 1998. واكتمل مشروع الجينوم البشري في عام 2003.


تقنية الحمض النووي المؤتلف: أفضل 8 تقنيات

تسلط النقاط التالية الضوء على أهم ثماني تقنيات في تقنية الحمض النووي المؤتلف. بعض التقنيات هي: 1. بناء مكتبة الجينات 2. فحص الجينات المحدد من المكتبات 3. المشي الكروموسوم واستنساخ الجينات 4. التحقيق في تعدد أشكال الحمض النووي بواسطة تقنية الحمض النووي المتضخم العشوائي (RAPD) 5. إجراء النشاف الجنوبي وغيرها.

تقنية الحمض النووي المؤتلف: التقنية رقم 1.

بناء مكتبة الجينات:

من الصعب للغاية عزل جين معين عن العدد الهائل من الجينات الموجودة داخل جينوم النبات. من المفيد جدًا إتاحة هذه الجينات في شكل مكتبة جينية من نوعين مختلفين & # 8211 مكتبة DNA الجينومي ومكتبة cDNA.

تمثل مكتبة الحمض النووي الجينومي جينوم المتبرع بأكمله. يمكن إعداد مكتبة الجينوم عن طريق انقسام الجينوم الكلي للكائن الحي بمساعدة نوكليازات التقييد. قد تكون الأجزاء الناتجة من حوالي 15 إلى عدة مئات من kbp ، والتي غالبًا ما تحتوي فقط على أجزاء من الجينات.

ثم يتم إدخال كل جزء في نواقل بلازميد أو عاثية مناسبة ثم يتم تضخيم كل جزء عن طريق الاستنساخ ، عادة في البكتيريا أو الفيروسات أو الخميرة. يتم تحديد تسلسل الحمض النووي المستهدف وتربيته وصيانته كخطوط خلوية ، تُعرف باسم بنك الجينات أو بنك الاستنساخ.

تمثل مكتبة cDNA الجينات المنسوخة فقط ، وهي مناسبة تمامًا للجينات الهيكلية حقيقية النواة. يتم تحضيره بالطريقة التالية.

من نسيج معين ، يتم عزل جزيئات الرنا المرسال ثم نسخها إلى cDNAs المقابلة عن طريق النسخ العكسي. يتم بعد ذلك إدخال cDNAs في ناقل مناسب وتضخيمه عن طريق الاستنساخ. لا يحتوي (كدنا) على إنترونات. بعد التحول يتم التعبير عن cDNAs في بدائيات النوى.

يجب إضافة محفز بدائية النواة إلى (كدنا) للتعبير عنه ، لأنه لا يحتوي على أي محفز. يحتوي mRNA حقيقيات النوى على ذيل بولي (A) في الطرف 3 & # 8242 الذي يسمح بفصل mRNA عن الحمض النووي الريبي الآخر عن طريق كروماتوجرافيا التقارب. تتكون مادة العمود من بولي ديوكسيتيدين أوليغنوكليوتيد (بولي دي تي) جزيئات صلبة مرتبطة بالسليلوز أو مواد أخرى.

عندما يتم شحن إجمالي جزء الحمض النووي الريبي المستخرج من الأنسجة إلى العمود ، ترتبط جزيئات الرنا المرسال بالعمود عن طريق تهجين ذيلها متعدد (A) إلى بولي (dT) من مادة العمود ، ويتم غسل الحمض النووي الريبي الآخر. باستخدام المخزن المؤقت المناسب ، يتم بعد ذلك إزالة الرنا المرسال المرتبط من العمود.

في قالب mRNA المعزول ، يتم إنتاج خيوط (كدنا) بواسطة النسخ العكسي. يتم استخدام جزء بولي (dT) المرتبط بذيل بولي (A) كأساس للإنزيم. ثم يتحلل جزيء mRNA جزئيًا بواسطة RNase H لتشكيل شظايا mRNA التي يمكن أن تكون بمثابة بادئات لتركيب خيط cDNA الثاني بواسطة بوليميراز DNA.

باستخدام بوليميراز الحمض النووي I يتم استبدال شظايا الرنا المرسال على التوالي بشظايا الحمض النووي ، ثم يتم ربطها ببعضها البعض بواسطة DNA ligase.

يبقى جزء RNA قصير في نهايته 5 & # 8242 ، وهو ذو أهمية ثانوية لأن معظم mRNA في نهايته 5 & # 8242 يحتوي على منطقة غير مشفرة. يتم بعد ذلك تضخيم جزيئات cDNA المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي تكونت من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الاستنساخ باستخدام البلازميدات أو العاثيات كنواقل استنساخ.

يمكن حفظ مكتبة الجينات في العاثيات. يمتلك الحمض النووي للعاثية موقع انشقاق للنويدات الداخلية التقييدية EcoRI. يتم ميثلة الحلزون المزدوج (كدنا) أولاً بواسطة ميثيلاز EcoRI في مواقع تقييد EcoRI لحماية موقع التقييد داخل cDNA. ثم يتم ربط قليل النوكليوتيدات المركب كيميائيًا مزدوج الشريطة (يسمى الروابط) إلى طرفي حبلا cDNA المزدوج بواسطة T4 ligase DNA.

يتسبب نوكلياز القيد EcoRI في حدوث قطع متداخلة من خيوط الحمض النووي ، مما يترك أربعة نيوكليوتيدات من خيط واحد غير متزاوج عند كل طرف ناتج. تسمى هذه النهايات غير المقترنة بالنهايات اللاصقة لأنها يمكن أن تشكل زوجًا أساسيًا مع بعضها البعض ، أو بنهايات لزجة مكملة لشظايا الحمض النووي الأخرى.

لذلك ، يشق EcoRI الرابط وكذلك DNA phage لتشكيل نهايات لزجة تؤدي إلى اقتران القواعد التكميلية لنهايات cDNA و DNA phage. أخيرًا ، يتم ربط خيوط الحمض النووي بواسطة T.4 ligase DNA. وهكذا ، يتم إدخال (كدنا) في المتجه.

يمكن أيضًا حفظ مكتبة الجينات في البلازميدات. لهذا الغرض يتم إدخال (كدنا) في البلازميدات بشكل أو بآخر بنفس الطريقة كما في الإدخال في DNA فج. ثم يتم نقل البلازميدات المؤتلفة إلى خلايا الإشريكية القولونية عن طريق معالجة الخلايا باستخدام CaCl2 لجعل غشاءهم أكثر نفاذاً للبلازميد وبصدمة حرارية قصيرة.

تحتوي نواقل البلازميد على جين مقاوم للمضادات الحيوية ، مما يجعل البكتيريا مقاومة للأمبيسيلين أو التتراسيكلين. عند إضافة مثل هذا المضاد الحيوي إلى وسط الاستزراع ، تبقى الخلايا المحولة فقط على قيد الحياة ، بعد الطلاء على مستنبت أجار متوسط ​​البقع المستعمرة البكتيرية.

يتم إنشاء نواقل البلازميد حيث يظل موقع الانقسام المقيد داخل جين β-gaIactosidase. يقوم إنزيم galactosidase بتحليل X-Gal عديم اللون (5-برومو-4-كلورو -3-إندوليل -β-D-galactopyranoside) إلى منتج أزرق غير قابل للذوبان.

لا تمتلك البلازميدات المؤتلفة مع إدراج الحمض النووي β-galactosidasegene سليمة ولا يمكنها إنتاج الإنزيم الوظيفي. لذلك ، على وسط زراعة لوحة أجار التي تحتوي على X-Gal ، يتم إنتاج مستعمرات زرقاء وبيضاء. يتم اختيار المستعمرات عديمة اللون كخلايا تحتوي على بلازميدات مع إدراج الحمض النووي.

تقنية الحمض النووي المؤتلف: تقنية # 2.

فحص الجينات المحدد من المكتبات:

لفحص المستعمرات البكتيرية من لويحات الملتهمة التي تحتوي على الجين المطلوب ، يتم استخدام تحقيقات محددة. يتم وضع غشاء نايلون أو نيتروسليلوز على المستعمرات البكتيرية أو لويحات الملتهمة التي تنمو على سطح أجار. ترتبط بعض البكتيريا أو العاثيات بغشاء النشاف.

لفحص الحيوانات المستنسخة البكتيرية أو العاثية المرتبطة بغشاء النشاف ، يتم استخدام نوعين من المجسات ، مثل:

(1) أجسام مضادة محددة لتحديد البروتين المنتج كمنتج جيني للنسخة المرغوبة

(2) تحقيقات DNA المشعة المحددة لتسمية cDNA للنسخة المرغوبة عن طريق التهجين.

(أ) تقنية فحص الأجسام المضادة:

في هذه التقنية ، يتم تنقية كمية كافية من البروتين المشفر بواسطة الجين المعني مسبقًا ، بحيث يمكن تكوين الأجسام المضادة متعددة النسيلة ضد البروتين عن طريق التحصين في حيوان مناسب.

لفحص الأجسام المضادة:

1. يجب إدراج مكتبة (كدنا) بجانب المحفز الذي يتحكم في بدء نسخ الجين المُدخل. هذا يسمى متجه التعبير. يتم طلاء مستعمرة الخلايا المضيفة على وسط صلب يحتوي على مضادات حيوية.

2. يتم بعد ذلك ترجمة mRNA الناتج إلى البروتين المقابل ، والذي يتعرف عليه الجسم المضاد. عندما تتشكل مستعمرة منفصلة على الصفيحة ، يتم نقلها بعد ذلك إلى غشاء النيتروسليلوز. يتم الحفاظ على الموضع الدقيق لمستعمرة الخلية على اللوحة في المصفوفة.

يتم تحديد اتجاه غشاء النشاف بحيث تتوافق البقع المرئية على الغشاء مع مواقع المستعمرات البكتيرية المحددة للوحة الملتهمة التي تحتوي على إدراج الحمض النووي الذي يمكن التقاطه لاحقًا من اللوحة.

3. يتمزق البكتيريا المرتبطة بالمرشح ويتم تثبيت البروتينات البكتيرية المنبعثة في الغشاء ، بينما تتلاشى العاثيات نفسها وبالتالي تحرر بروتينات الخلية ، والتي يتم تثبيتها بعد ذلك في المرشح. ثم يتم تصوير البروتين على الغشاء باستخدام إجراء النشاف الغربي.

4. في هذا الإجراء يتم إضافة الأجسام المضادة للارتباط المحدد مع البروتين المقابل ولكن يتم غسلها من جميع الأجزاء الأخرى من الغشاء.

5. يتم استخدام الجسم المضاد الثاني سواء كان يحمل علامة الراديو أو الفلوريسنت أو مترافق مع الإنزيم ، للكشف عن أول جسم مضاد مرتبط. ثم يتم غسل غشاء النشاف وتجفيفه وتعريضه لفيلم الأشعة السينية.

6. يمكن التعرف على المستعمرة الموجبة على أنها بقعة مظلمة على جهاز التصوير الشعاعي الذاتي (الشكل 17.14). يتم التقاط المستعمرة الموجبة مخففة ومطلية على لوحة أجار أخرى وتتكرر العملية من خلال الفرز للحصول على نسخة نقية واحدة. يتم أيضًا إعادة نمو لويحات الملتهمة الموجبة في البكتيريا وطليها مرة أخرى للحصول على استنساخ نقي.

(ب) الفحص من خلال مسبار الحمض النووي المحدد:

تتضمن تقنية الفحص هذه بشكل أساسي التهجين بين مسبار الحمض النووي المسمى وتسلسل الحمض النووي المستهدف. في طريقة البكتيريا أو العاثيات الموجودة على الغشاء تتحلل وتتم إزالة البروتينات.

ثم يتم إذابة الحمض النووي المرتبط بإحكام في خيوط مفردة. يتم بعد ذلك استخدام تسلسل deoxynucleotide المسمى 32P المكمّل لشريط DNA المرتبط بالغشاء كمجسات. ترتبط هذه عن طريق التهجين مع (كدنا) المطلوب الموجود على غشاء النشاف. يتم تحديد المستنسخات الإيجابية عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي.

اعتمادًا على تقنيات الفحص من خلال مجسات الحمض النووي ، هناك الأنواع التالية:

أنا. فحص قليل النوكليوتيد:

في تقنية الفرز هذه ، يتم استخدام مسبار قليل النوكليوتيد المركب كيميائياً لعزل الحيوانات المستنسخة (كدنا). مسبار قليل النوكليوتيد عبارة عن قطعة قصيرة من الحمض النووي عادة ما يكون بطول 10-50 نيوكليوتيد طويل ومُسمى إشعاعيًا عند 5 & # 8242 نهاية بواسطة 32 فوسفات. يتم استخدام هذه التقنية فقط عندما يكون المنتج الجيني متوفرًا بكميات قليلة جدًا ، وهي غير كافية لرفع الجسم المضاد.

عن طريق التسلسل الدقيق ، يتم تحديد تسلسل الأحماض الأمينية N-terminal لهذا البروتين. من هذه المعلومات يتم استنتاج تسلسل الحمض النووي المقابل لإنتاج مجسات قليلة النوكليوتيد عن طريق التوليف الكيميائي باستخدام المركب الآلي.

يتم إنتاج قليل النوكليوتيدات المتحللة التي تحتوي على جميع التسلسلات الممكنة لتشفير تسلسل الحمض الأميني المعطى. هذه المجسات قليلة النوكليوتيد التي تحمل علامات إشعاعية تتهجين مع (كدنا) المطلوب الموجود على غشاء النشاف. يتم تحديد الحيوانات المستنسخة الإيجابية عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي.

ثانيا. فحص مسبار غير متجانسة:

المجسات غير المتجانسة هي مستنسخات (كدنا) تم الحصول عليها سابقًا من أنواع أخرى. هذه تستخدم لفحص مكتبة معينة (كدنا) مصنوعة من مرنا لأنواع أخرى. يصبح ناجحًا إذا كان هناك تجانس تسلسل كافٍ للجينات بين النوعين.

ثالثا. ترانسبوسون وضع العلامات:

الينقولات عبارة عن تسلسلات DNA منفصلة يمكن أن تقفز داخل جينوم النبات ، مما يؤدي أحيانًا إلى تعطيل عمل الجين الوظيفي بسبب اضطراب تسلسله الصحيح. يتم قطع الينقولات ، بمساعدة إنزيم منقولات ، من موضع واحد في الجينوم وإعادة ربطها في موضع آخر في الجينوم.

يُطلق على تسمية الجين باستخدام الينقولات المُدخلة تسمية الجينات المنقولة. يتم استخدام مسبار الحمض النووي المشع على أساس تسلسل الترانسبوزون المعروف لتحديد منطقة الجينوم التي تم فيها تمييز الينقولات بواسطة تهجين الحمض النووي. سيحتوي مثل هذا الاستنساخ البكتيري المحدد على الجين المعني.

رابعا. الفحص التفاضلي:

يتم استخدام إجراء الفرز التفاضلي أو (±) لتتبع عملية فسيولوجية ذات أهمية. يتم استخدام التعبير التفاضلي للجينات ، قبل وبعد الحث ، في هذا الإجراء. على سبيل المثال ، يتم إلغاء قمع العديد من الجينات المستحثة بالأوكسين لإنتاج الرنا المرسال بعد العلاج بالأوكسين. يمكن تحضير مكتبة (كدنا) من الرنا المرسال الذي تم إنتاجه بعد العلاج بالأوكسين.

يتم تحضير تحقيقات (كدنا) التي تحمل علامات إشعاعية من الرنا المرسال من الأنسجة المستحثة وغير المستحثة. إجراء الفرز هو نفسه الموصوف لاستخدام أليغنوكليوتيدات. سيتم تهجين أي مستعمرة بكتيرية تحتوي على إدخال يمثل الجين المستحث فقط مع تحقيقات (كدنا) المصنوعة من mRNA المستحث. تم تأكيده في البقع الشمالية.

v. عزل الجينات بالتكملة:

يمكن عزل الجينات المشفرة لبروتينات غير معروفة عن طريق استكمال طفرات نقص البكتيريا أو الخميرة بعد التحول بالبلازميدات من مكتبة cDNA. لا يُعرف البروتين إلا من خلال وظيفته. تم تحديد جينات بروتينات السكروز العابرة لتحديد المواقع المشاركة في تحميل اللحاء عن طريق التكميل. تم استخدام طفرة نقص الخميرة لهذا الغرض.

لقد فقد المتحول القدرة على تناول السكروز بسبب خلل في جين السكروز العابر لتحديد المواقع ، وبالتالي ، لم يعد بإمكانه استخدام السكروز كمصدر للكربون. تم تحويل هذا المسخ بالبلازميدات من مكتبة نباتية (كدنا) ، والتي تم التعبير عنها تحت سيطرة مروج الخميرة.

بعد الطلاء ، وجد أن استنساخ الخميرة ينمو على الوسط المحتوي على السكروز مما يشير إلى توليد بروتين محدد موقع السكروز النباتي داخل خلايا الخميرة المحولة. تم تضخيم استنساخ الخميرة الإيجابية ، وعزل البلازميد (كدنا) وتسلسله. من تسلسل (كدنا) تم تحديد تسلسل الأحماض الأمينية لبروتين محدد موقع السكروز.

تقنية الحمض النووي المؤتلف: تقنية # 3.

المشي الكروموسوم واستنساخ الجينات:

تعتمد خصائص الكائن الحي على تسلسل قاعدة الحمض النووي لجينومه. يختلف التسلسل الأساسي هذا ليس فقط بين الأنواع المختلفة ولكن أيضًا بين الأفراد من نفس النوع. يتم إعداد الخرائط الجينية على أساس ترددات إعادة التركيب للصفات المظهرية للكائن الحي.

تُظهر الخريطة المسافة النسبية بين جينين على الكروموسوم. يمكن استخدام تعدد أشكال طول جزء التقييد (RFLP) للحمض النووي للكشف عن الاختلافات في الجينات داخل الأنواع دون مقارنة تسلسل مفصلة. يمكن استخدام RFLP للحمض النووي كواسمات وراثية.

يعتمد هذا على استخدام نوكليازات تقييد البكتيريا التي تشق الحمض النووي في تسلسل التعرف المتناوب المحدد المعروف باسم موقع التقييد مما يؤدي إلى تعدد الأشكال لطول جزء التقييد.

لغرض المشي على الكروموسوم ، يتم إنشاء مكتبة الجينوم للنبات ذي الأهمية أولاً. يتم تقطيع الحمض النووي إلى أجزاء ذات حجم يمكن التحكم فيه بمساعدة إنزيم التقييد المناسب. يتم إدخال الشظايا في البكتيريا باستخدام نواقل مناسبة للتكاثر لتوليد مجموعة من النواقل الكيميرية.

لتحديد أجزاء من أجزاء معينة من الجينوم ، يتم تحضير تحقيقات الحمض النووي المسمى. لهذا الغرض ، تم العثور على قسم معين من الحمض النووي للكروموسوم يقع بالقرب من الجين المعني.

يتم إدخال قسم الحمض النووي هذا في E. coli من خلال ناقل البلازميد ثم يتم نشره. ثم يتم عزل البلازميدات ويتم قطع أقسام الحمض النووي المضاعفة مرة أخرى ، وعزلها ووضع العلامات الإشعاعية عليها. تسمى هذه المجسات علامات RFLP.

يتم تحليل شظايا تقييد الحمض النووي باستخدام المجسات المسمى من خلال طريقة اللطخة الجنوبية. نظرًا لأنه من الممكن استنساخ وتحديد آلاف الأجزاء المقيدة من جينوم كائن حي معين ، يمكن الحصول على العلامات الجينية التي تغطي الجينوم بأكمله باستخدام RFLPs. وبالتالي ، يمكن استخدام الخرائط الجينية القائمة على علامات RFLP لاستنساخ الجينات التي يمكن ربطها بـ RFLP معين.

يتم ذلك عن طريق السير من موقع RFLP المعروف نحو الموقع الدقيق للجين محل الاهتمام. يتم فحص مكتبة الجينوم بجزء تقييد مستنسخ معاد اتحاده مع الجين المعني. يتم هضم إدخالات الحمض النووي من هذه الحيوانات المستنسخة باستخدام إنزيمات تقييدية ، ويتم إنشاء خريطة لترتيب مقاطع الحمض النووي.

يتم عزل شظايا الحمض النووي التي تمثل نهايات الإدخالات واستخدامها كمجسات تهجين لفحص الحيوانات المستنسخة الإضافية من المكتبة.

سيحتوي كل استنساخ جديد على إدخالات الحمض النووي التي هي تسلسلات مستمرة من الإدخال السابق. تتكرر دورة المشي هذه عدة مرات حتى الوصول إلى الوضع المطلوب. إن المشي الكروموسومي عملية شاقة وتستغرق وقتًا طويلاً.

علامات RFLP موروثة وفقًا لمبادئ Mendelian. هذه تستخدم لوصف صنف معين. يتم استخدام العديد من المجسات في القياسات المتوازية وفي النظاميات النباتية لإنشاء أشجار النشوء والتطور. يمكن استخدام شظايا التقييد المحددة كمجسات معنونة من أجل توطين جينات معينة على الكروموسوم.

باستخدام هذه التقنية ، تم إنشاء خرائط كروموسوم للأرابيدوبسيس والبطاطا والطماطم والذرة.

تقنية الحمض النووي المؤتلف: التقنية رقم 4.

التحقيق في تعدد أشكال الحمض النووي بواسطة تقنية الحمض النووي المتضخم العشوائي (RAPD):

من خلال تضخيم شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها عشوائيًا ، من الممكن تحليل الاختلافات بين تسلسل الحمض النووي للفرد أو أنواع الأنواع. إن تقنية الحمض النووي المضخم العشوائي (RAPD) أسهل بكثير في العمل ويتم تطبيقها على نطاق واسع في وقت قصير جدًا.

مبدأ هذه التقنية هو تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، الذي اخترعه كاري موليس في عام 1984. يمكن تضخيم أجزاء مختارة من الحمض النووي بطول يصل إلى 2-3 كيلو بايت بواسطة بوليميراز الحمض النووي في هذه الطريقة. الاشعال قليل النوكليوتيد ضروري لهذا التضخيم. يتم تصنيع اثنين من قليل النيوكليوتيدات كل مكمل لتسلسل قصير في خيط واحد من قطعة الحمض النووي المرغوبة.

يتم وضع البادئات خلف نهاية التسلسل ليتم تضخيمها. في الخطوة الأولى ، يتم تسخين الحمض النووي المعزول الذي يحتوي على القطعة المراد استنساخها لفترة وجيزة إلى حوالي 95 درجة مئوية لإفسادها ، في وجود فائض من بادئات الأوليغنوكليوتيد الاصطناعية المبردة.

في الخطوة التالية ، تم عزل بوليميراز الحمض النووي المستقر للحرارة يسمى Taq I من Thermus aquaticus الذي يعيش في الآبار الساخنة ، ثم تتم إضافة مادة ديوكسينوكليوزيد ثلاثي الفوسفات.

ثم يتم نسخ جزء الحمض النووي معدة بشكل انتقائي. ثم يتم تكرار الخطوات خلال 25 أو 30 دورة من هذا القبيل في غضون ساعات قليلة. يمكن عزل مقاطع الحمض النووي المتضخمة واستنساخها بسهولة. نظرًا لأنه في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم مضاعفة عدد جزيئات الحمض النووي المتكونة أضعافا مضاعفة بعدد الدورات ، يمكن مضاعفة عينة DNA الصغيرة جدًا.

في الخطوة الأولى ، لا يتم تقييد طول الحمض النووي المكون حديثًا من طرف واحد. عندما يرتبط التمهيدي بالتسلسل الأساسي التكميلي لخيط DNA المكون حديثًا ، يتم تكوين منتج في الدورة التالية ، والتي يتم تقييد طولها بواسطة كلا البادئين.

يمكن فصل الكميات الكبيرة من المنتجات المضخمة لجزء الحمض النووي الفردي عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام وتلطيخها ببروميد الإيثيديوم. يمكن الكشف عن الشظايا كعصابات فلورية تحت كروماتولايت الأشعة فوق البنفسجية. يمكن أن يؤدي تغيير تسلسل التمهيدي إلى إنتاج أجزاء مختلفة من الحمض النووي. تتوفر مجموعة متنوعة من البادئات الأوليغنوكليوتيد الاصطناعية تجارياً.

تعتبر تقنية RAPD حساسة بدرجة كافية لاكتشاف جزيء DNA واحد في أي نوع من العينات تقريبًا. هذه التقنية سريعة جدًا ولا تتطلب تحضير المجسات ولا الإجراء الذي يستغرق وقتًا طويلاً لطخة جنوبية.

تم استخدامه لاستنساخ شظايا الحمض النووي من المومياوات وبقايا الحيوانات المنقرضة. كما أنها أداة جديدة فعالة في الطب الشرعي. كما يتم استخدامه في التشخيص السابق للولادة للأمراض الوراثية. نظرًا لأن تقنية RAPD تسمح بالتمييز بين أنواع الأنواع ، فقد أصبحت أداة مهمة في التكاثر.

تقنية الحمض النووي المؤتلف: تقنية # 5.

إجراء النشاف الجنوبي:

النشاف الجنوبي هو تقنية تهجين الحمض النووي حيث يتم الكشف عن جزء واحد أو أكثر من شظايا الحمض النووي في عدد كبير من السكان عن طريق التهجين إلى مسبار الحمض النووي التكميلي المسمى. تم تطوير هذه الطريقة من قبل إدوارد ساذرن في عام 1975. يتم أولاً تجزئة شظايا التقييد بالطول بواسطة الرحلان الكهربائي في هلام الاغاروز. يكون تنقل أصغر جزء أكبر.

بعد تغيير طبيعة الشظايا المنفصلة في الهلام يتم نقلها إلى غشاء نيتروسليلوز أو نايلون عن طريق وضع الغشاء على الجل. تدفق من المخزن المؤقت المناسب من خلال هلام يزيل شظايا الحمض النووي وصمة عار لهم على الغشاء. الغشاء مغطى بكومة من المناديل الورقية.

يتم فصل أجزاء الحمض النووي المرتبطة بواسطة المخزن المؤقت إلى خيوط مفردة. بعد النشاف ، يتم تسخين الغشاء لمدة 1-2 ساعة عند 80 درجة مئوية أو تعرضه لضوء الأشعة فوق البنفسجية لتثبيت جزيئات الحمض النووي في الغشاء. يتم تهجين مسبار DNA المسمى الذي يمثل تسلسلًا محددًا للجين محل الاهتمام عند إضافته إلى خيط DNA المرتبط بالغشاء.

بعد إزالة المجسات غير المقيدة عن طريق الغسيل ، يتم تحديد الحمض النووي المهجن بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي. ثم يرتبط موضع النطاق على البقعة بهجرتها وبالتالي حجمها (الشكل 17.19).

تقنية الحمض النووي المؤتلف: التقنية رقم 6.

إجراء النشاف الغربي:

النشاف الغربي هو طريقة مناعية تستخدم لتحديد تعبير الجين على مستوى البروتين. باستخدام معلومات تسلسل النيوكليوتيدات ، يمكن تصنيع الببتيد عن طريق توصيل الأحماض الأمينية كيميائيًا في تسلسل محدد. يمكن استخدام هذا الببتيد الاصطناعي لرفع الأجسام المضادة.

يمكن استخدام الجسم المضاد للكشف عن البروتينات المشفرة بواسطة الجين. يتم إجراء القياس الكمي الحساس لبروتين معين عن طريق النشاف الغربي. يتم استخراج البروتينات الكلية من الأنسجة في مخزن مؤقت مناسب ويتم فصلها عن طريق الرحلان الكهربي على المواد الهلامية بولي أكريلاميد.

يتم بعد ذلك نقل البروتينات المنفصلة كهربيًا إلى غشاء النيتروسليلوز ، والذي يتم بعد ذلك فحصه باستخدام أجسام مضادة ذات علامات إشعاعية أو أجسام مضادة مرتبطة بالإنزيم. يتم الكشف عن النشاط الإشعاعي في الفيلم الفوتوغرافي وتنتج الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم لونًا على الغشاء ، والذي يمكن قياسه عن طريق مسح قياس الكثافة. تم تطوير هذه الطريقة بواسطة Burnette في عام 1981.

تقنية الحمض النووي المؤتلف: التقنية رقم 7.

النشاف الشمالي:

من خلال إجراءات النشاف الشمالية ، يتم القياس الكمي للتعبير عن الجين على مستوى RNA من خلال تهجين RNA-DNA. تم تطوير هذه التقنية من قبل توماس في عام 1980. في هذه الطريقة يتم عزل إما مجموع RNAs أو poly (A) mRNAs من الأنسجة. يتم فصل الحمض النووي الريبي على أساس الحجم من خلال الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز في وجود الفورمالديهايد أو ميثيل الزئبق كعامل مذيب للتشبع.

مثل النشاف الجنوبي ، يتم وضع غشاء النيتروسليلوز على الهلام ويتم التخلص من جزيئات الحمض النووي الريبي من الجل ويتم مسحها على الغشاء حيث يُسمح للمخزن المناسب بالتدفق عبر الهلام. يمكن أيضًا نقل الحمض النووي الريبي المنفصل إلى الغشاء عن طريق الرحلان الكهربي.

يتم تثبيت RNAs المنقولة على الغشاء إما عن طريق الخبز عند 60 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة أو عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية. يُسمح بعد ذلك لمسبار الحمض النووي المسمى إشعاعيًا المكمل للجين المعني بالتهجين مع الحمض النووي الريبي على المرشح لفحص أنواع الرنا المرسال التكميلية ، والتي يتم بعد ذلك تحديدها بأية طريقة قياسية مناسبة.

تقنية الحمض النووي المؤتلف: التقنية رقم 8.

تحليل الفتحة:

تحليل الفتحة هو تعديل لإجراء النشاف الشمالي. يستخدم هذا للتحديد السريع لمستويات الأنواع المختارة من الرنا المرسال. في هذه الطريقة ، يتم مسح إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) أو بولي (A) RNAs ، بدلاً من الفصل على هلام الاغاروز مباشرة على مرشح النيتروسليلوز بواسطة جهاز لطخة الفتحة. المعالجة اللاحقة هي نفسها كما هو موضح أعلاه.


(كدنا) واستنتاج تسلسل الأحماض الأمينية لإنزيم إصلاح الحمض النووي للفأر (نوكلياز APEX) مع تشابه كبير مع الإشريكية القولونية الخارجية للنوكلياز الثالث

قمنا بتنقية إنزيم إصلاح الحمض النووي للفأر الذي يحتوي على نوكلياز أبوريني / أبيريميدين داخلي ، و DNA 3'-phosphatase ، و 3'-5'-exonuclease و DNA 3 'أنشطة diesterase إصلاح ، وخصصنا الإنزيم على أنه نوكلياز APEX. تم عزل استنساخ (كدنا) للإنزيم من مكتبة (كدنا) في طحال الفأر باستخدام تحقيقات من النكليوتيدات المنحلة المستخلصة من تسلسل الحمض الأميني N-terminal للإنزيم. تم تحديد تسلسل النوكليوتيدات الكامل لـ (كدنا) (1.3 كيلو قاعدة). أظهر التهجين الشمالي باستخدام cDNA هذا أن حجم mRNA الخاص به يبلغ حوالي 1.5 كيلو قاعدة. يشير تسلسل الحمض الأميني الكامل للإنزيم المتوقع من تسلسل النوكليوتيدات لـ cDNA (APEX nuclease cDNA) إلى أن الإنزيم يتكون من 316 من الأحماض الأمينية بوزن جزيئي محسوب يبلغ 35400. يحتوي التسلسل المتوقع على متواليات الأحماض الأمينية الجزئية التي يحددها منظم البروتين من الإنزيم المنقى. تم استنساخ تسلسل تشفير نوكلياز APEX في مواقع pUC18 SmaI و HindIII في إطار التحكم لمروج lacZ. تم إدخال البنية في خلايا سلالة BW2001 (xth-11 ، nfo-2) من Escherichia coli. أعربت الخلايا المحولة عن عديد ببتيد 36.4 كيلو دالتون (تسلسل حمض أميني 316 من نوكلياز APEX برئاسة ديكاببتيد N- طرفي من بيتا جالاكتوزيداز) وكانت أقل حساسية لميثيل ميثان سلفونات من الخلايا الأم. أظهر منتج الاندماج نشاطًا أوليًا لبوليميراز الحمض النووي على الحمض النووي التالف بالبليوميسين والحمض النووي المنقى من الحمض. يُظهر تسلسل الأحماض الأمينية المستخلصة من نوكلياز APEX تماثلًا كبيرًا لتلك الموجودة في نوكلياز خارجي III من E.coli وبروتين ExoA من Streptococcus pneumoniae وتماثل مكثف مع نظير نوكلياز AP ​​البقري 1.


شكر وتقدير

نشكر السيد Witoon Tirasophon والدكتورة Betty Jo Brown على الاقتراحات القيمة أثناء عملية استنساخ الجينات. نشكر السيدة Mariliz Ortiz-Maldonado على توفير PHBH المستخدم لمعيار تحديد البروتين ، والدكتور Brian Guenther للحصول على اقتراحات حول البحث في قاعدة بيانات البروتين. تم دعم هذا العمل من قبل خدمة الصحة العامة الأمريكية ، Grants GM 20877 (D.P.B.) و GM 11106 (V.M.) ، ومشروع تطوير المواهب العلمية والتكنولوجية وتعزيزها ، تايلاند (P.C.).


هل سيتم التعبير عن تسلسل الحمض النووي المستنتج من تسلسل البروتين من البلازميد؟ - مادة الاحياء

النيتروجين "الكلاسيكي" للبكتيريا المعوية عبارة عن بروتينات فلافوبروتينات تحفز اختزال مجموعة متنوعة من المركبات النيترو أروماتية إلى نواتج أيضية شديدة السمية أو مسببة للطفرات أو مسرطنة. لقد تم الآن استنساخ الجين الخاص بالنيترودوكتاز Enterobacter cloacae باستخدام جسم مضاد خاص بهذا البروتين. The nucleotide sequence of the structural gene and flanking regions are reported. Sequence analysis indicates that this gene belongs to a gene family of flavoproteins which have not been previously described. Analysis of the 5'-untranslated region reveals the presence of putative regulatory elements which may be involved in the modulation of the expression of this enzyme. The cloned gene was placed under the control of a T7 promoter for overexpression of the protein in Escherichia coli. The expressed recombinant protein was purified to homogeneity and exhibited physical, spectral, and catalytic properties identical to the protein isolated from E. cloacae.

This paper is dedicated to the memory of Marlene A. DeLuca who passed away November 18,1987. Her presence in our lives as teacher, scientist, mentor, and friend will be deeply missed.

The nucleotide sequence(s) reported in this paper has been submitted to the GenBank TM /EMBL Data Bank with accession number(s) M37085.


Transformation and plasmid isolation

Once cloning is completed, plasmids are taken up into competent cells (chemically competent or electrocompetent بكتريا قولونية) for propagation and storage, by a process called transformation. Chemically competent cells are cells treated with salts to open up the pores in the membrane and cell wall. Plasmid DNA is then added to the cells and a mild heat shock opens pores in the بكتريا قولونية cells, allowing for entry of the plasmid. In contrast, DNA is introduced into electrocompetent cells through transient pores that are formed in the بكتريا قولونية membrane and cell wall when short electrical pulses are delivered to the cell and plasmid DNA mixture. When choosing a competent cell strain to work with, it is important to consider the following factors:

  • الطراز العرقى—the list of genetic mutations (deletions, changes, or insertions) in the strain that distinguish it from wild-type بكتريا قولونية
  • Transformation efficiency—measurement of amount of supercoiled plasmid (such as pUC19) successfully transformed into a volume of cells defined as colony forming units per microgram of DNA delivered (cfu/μg) we manufacture competent cells that have efficiencies ranging from >1 x 10 6 to >3 x 10 10 cfu/μg
  • تطبيق—experiment type for which the competent cells are well suited applications include routine cloning, protein expression, library production, cloning unstable DNA, ssDNA propagation, bacmid creation, and Cre-Lox recombination
  • Kit format—formats include high-throughput (96 well), single-use Invitrogen One Shot vials, standard kits, or bulk format

After taking advantage of the بكتريا قولونية’s molecular machinery to replicate the plasmid DNA, a plasmid purification kit can be used to purify the plasmid.

DNA (containing your gene of interest). We offer two main technologies for plasmid purification:

For purification of a cloned plasmid that will be used to transfect into a cell line for protein expression, we recommend anion exchange purification for its higher purity and lower endotoxin levels. Silica-based purification is appropriate for cloning related workflows, but not optimal for plasmids used for transfection as there are higher levels of endotoxins and impurities. Anion exchange columns also produce better results with large plasmids. The Invitrogen PureLink HiPure Expi Plasmid Kits have been developed to give higher yields from large-scale plasmid isolation, in less than half the time of typical plasmid DNA isolation methods.


محتويات

Prior to the 1970s, the understanding of genetics and molecular biology was severely hampered by an inability to isolate and study individual genes from complex organisms. This changed dramatically with the advent of molecular cloning methods. Microbiologists, seeking to understand the molecular mechanisms through which bacteria restricted the growth of bacteriophage, isolated restriction endonucleases, enzymes that could cleave DNA molecules only when specific DNA sequences were encountered. [6] They showed that restriction enzymes cleaved chromosome-length DNA molecules at specific locations, and that specific sections of the larger molecule could be purified by size fractionation. Using a second enzyme, DNA ligase, fragments generated by restriction enzymes could be joined in new combinations, termed recombinant DNA. By recombining DNA segments of interest with vector DNA, such as bacteriophage or plasmids, which naturally replicate inside bacteria, large quantities of purified recombinant DNA molecules could be produced in bacterial cultures. The first recombinant DNA molecules were generated and studied in 1972. [7] [8]

Molecular cloning takes advantage of the fact that the chemical structure of DNA is fundamentally the same in all living organisms. Therefore, if any segment of DNA from any organism is inserted into a DNA segment containing the molecular sequences required for DNA replication, and the resulting recombinant DNA is introduced into the organism from which the replication sequences were obtained, then the foreign DNA will be replicated along with the host cell's DNA in the transgenic organism.

Molecular cloning is similar to polymerase chain reaction (PCR) in that it permits the replication of DNA sequence. The fundamental difference between the two methods is that molecular cloning involves replication of the DNA in a living microorganism, while PCR replicates DNA in an في المختبر solution, free of living cells.

In standard molecular cloning experiments, the cloning of any DNA fragment essentially involves seven steps: (1) Choice of host organism and cloning vector, (2) Preparation of vector DNA, (3) Preparation of DNA to be cloned, (4) Creation of recombinant DNA, (5) Introduction of recombinant DNA into host organism, (6) Selection of organisms containing recombinant DNA, (7) Screening for clones with desired DNA inserts and biological properties.

Although the detailed planning of the cloning can be done in any text editor, together with online utilities for e.g. PCR primer design, dedicated software exist for the purpose. Software for the purpose include for example ApE [1] (open source), DNAStrider [2] (open source), Serial Cloner [3] (gratis) and Collagene [4] (open source).

Notably, the growing capacity and fidelity of DNA synthesis platforms allows for increasingly intricate designs in molecular engineering. These projects may include very long strands of novel DNA sequence and/or test entire libraries simultaneously, as opposed to of individual sequences. These shifts introduce complexity that require design to move away from the flat nucleotide-based representation and towards a higher level of abstraction. Examples of such tools are GenoCAD, Teselagen [5] (free for academia) or GeneticConstructor [6] (free for academics).

Choice of host organism and cloning vector Edit

Although a very large number of host organisms and molecular cloning vectors are in use, the great majority of molecular cloning experiments begin with a laboratory strain of the bacterium بكتريا قولونية (الإشريكية القولونية) and a plasmid cloning vector. بكتريا قولونية and plasmid vectors are in common use because they are technically sophisticated, versatile, widely available, and offer rapid growth of recombinant organisms with minimal equipment. [3] If the DNA to be cloned is exceptionally large (hundreds of thousands to millions of base pairs), then a bacterial artificial chromosome [10] or yeast artificial chromosome vector is often chosen.

Specialized applications may call for specialized host-vector systems. For example, if the experimentalists wish to harvest a particular protein from the recombinant organism, then an expression vector is chosen that contains appropriate signals for transcription and translation in the desired host organism. Alternatively, if replication of the DNA in different species is desired (for example, transfer of DNA from bacteria to plants), then a multiple host range vector (also termed shuttle vector) may be selected. In practice, however, specialized molecular cloning experiments usually begin with cloning into a bacterial plasmid, followed by subcloning into a specialized vector.

Whatever combination of host and vector are used, the vector almost always contains four DNA segments that are critically important to its function and experimental utility: [3]

  • الحمض النووي replication origin is necessary for the vector (and its linked recombinant sequences) to replicate inside the host organism
  • one or more unique restriction endonuclease recognition sites to serves as sites where foreign DNA may be introduced
  • أ selectable genetic marker gene that can be used to enable the survival of cells that have taken up vector sequences
  • أ tag gene that can be used to screen for cells containing the foreign DNA

Preparation of vector DNA Edit

The cloning vector is treated with a restriction endonuclease to cleave the DNA at the site where foreign DNA will be inserted. The restriction enzyme is chosen to generate a configuration at the cleavage site that is compatible with the ends of the foreign DNA (see DNA end). Typically, this is done by cleaving the vector DNA and foreign DNA with the same restriction enzyme, for example EcoRI. Most modern vectors contain a variety of convenient cleavage sites that are unique within the vector molecule (so that the vector can only be cleaved at a single site) and are located within a gene (frequently beta-galactosidase) whose inactivation can be used to distinguish recombinant from non-recombinant organisms at a later step in the process. To improve the ratio of recombinant to non-recombinant organisms, the cleaved vector may be treated with an enzyme (alkaline phosphatase) that dephosphorylates the vector ends. Vector molecules with dephosphorylated ends are unable to replicate, and replication can only be restored if foreign DNA is integrated into the cleavage site. [11]

Preparation of DNA to be cloned Edit

For cloning of genomic DNA, the DNA to be cloned is extracted from the organism of interest. Virtually any tissue source can be used (even tissues from extinct animals), [12] as long as the DNA is not extensively degraded. The DNA is then purified using simple methods to remove contaminating proteins (extraction with phenol), RNA (ribonuclease) and smaller molecules (precipitation and/or chromatography). Polymerase chain reaction (PCR) methods are often used for amplification of specific DNA or RNA (RT-PCR) sequences prior to molecular cloning.

DNA for cloning experiments may also be obtained from RNA using reverse transcriptase (complementary DNA or cDNA cloning), or in the form of synthetic DNA (artificial gene synthesis). cDNA cloning is usually used to obtain clones representative of the mRNA population of the cells of interest, while synthetic DNA is used to obtain any precise sequence defined by the designer. Such a designed sequence may be required when moving genes across genetic codes (for example, from the mitochrondria to the nucleus) [13] or simply for increasing expression via codon optimization. [14]

The purified DNA is then treated with a restriction enzyme to generate fragments with ends capable of being linked to those of the vector. If necessary, short double-stranded segments of DNA (linkers) containing desired restriction sites may be added to create end structures that are compatible with the vector. [3] [11]

Creation of recombinant DNA with DNA ligase Edit

The creation of recombinant DNA is in many ways the simplest step of the molecular cloning process. DNA prepared from the vector and foreign source are simply mixed together at appropriate concentrations and exposed to an enzyme (DNA ligase) that covalently links the ends together. This joining reaction is often termed ligation. The resulting DNA mixture containing randomly joined ends is then ready for introduction into the host organism.

DNA ligase only recognizes and acts on the ends of linear DNA molecules, usually resulting in a complex mixture of DNA molecules with randomly joined ends. The desired products (vector DNA covalently linked to foreign DNA) will be present, but other sequences (e.g. foreign DNA linked to itself, vector DNA linked to itself and higher-order combinations of vector and foreign DNA) are also usually present. This complex mixture is sorted out in subsequent steps of the cloning process, after the DNA mixture is introduced into cells. [3] [11]

Introduction of recombinant DNA into host organism Edit

The DNA mixture, previously manipulated in vitro, is moved back into a living cell, referred to as the host organism. The methods used to get DNA into cells are varied, and the name applied to this step in the molecular cloning process will often depend upon the experimental method that is chosen (e.g. transformation, transduction, transfection, electroporation). [3] [11]

When microorganisms are able to take up and replicate DNA from their local environment, the process is termed transformation, and cells that are in a physiological state such that they can take up DNA are said to be competent. [15] In mammalian cell culture, the analogous process of introducing DNA into cells is commonly termed transfection. Both transformation and transfection usually require preparation of the cells through a special growth regime and chemical treatment process that will vary with the specific species and cell types that are used.

Electroporation uses high voltage electrical pulses to translocate DNA across the cell membrane (and cell wall, if present). [16] In contrast, transduction involves the packaging of DNA into virus-derived particles, and using these virus-like particles to introduce the encapsulated DNA into the cell through a process resembling viral infection. Although electroporation and transduction are highly specialized methods, they may be the most efficient methods to move DNA into cells.

Selection of organisms containing vector sequences Edit

Whichever method is used, the introduction of recombinant DNA into the chosen host organism is usually a low efficiency process that is, only a small fraction of the cells will actually take up DNA. Experimental scientists deal with this issue through a step of artificial genetic selection, in which cells that have not taken up DNA are selectively killed, and only those cells that can actively replicate DNA containing the selectable marker gene encoded by the vector are able to survive. [3] [11]

When bacterial cells are used as host organisms, the selectable marker is usually a gene that confers resistance to an antibiotic that would otherwise kill the cells, typically ampicillin. Cells harboring the plasmid will survive when exposed to the antibiotic, while those that have failed to take up plasmid sequences will die. When mammalian cells (e.g. human or mouse cells) are used, a similar strategy is used, except that the marker gene (in this case typically encoded as part of the kanMX cassette) confers resistance to the antibiotic Geneticin.

Screening for clones with desired DNA inserts and biological properties Edit

Modern bacterial cloning vectors (e.g. pUC19 and later derivatives including the pGEM vectors) use the blue-white screening system to distinguish colonies (clones) of transgenic cells from those that contain the parental vector (i.e. vector DNA with no recombinant sequence inserted). In these vectors, foreign DNA is inserted into a sequence that encodes an essential part of beta-galactosidase, an enzyme whose activity results in formation of a blue-colored colony on the culture medium that is used for this work. Insertion of the foreign DNA into the beta-galactosidase coding sequence disables the function of the enzyme so that colonies containing transformed DNA remain colorless (white). Therefore, experimentalists are easily able to identify and conduct further studies on transgenic bacterial clones, while ignoring those that do not contain recombinant DNA.

The total population of individual clones obtained in a molecular cloning experiment is often termed a DNA library. Libraries may be highly complex (as when cloning complete genomic DNA from an organism) or relatively simple (as when moving a previously cloned DNA fragment into a different plasmid), but it is almost always necessary to examine a number of different clones to be sure that the desired DNA construct is obtained. This may be accomplished through a very wide range of experimental methods, including the use of nucleic acid hybridizations, antibody probes, polymerase chain reaction, restriction fragment analysis and/or DNA sequencing. [3] [11]

Molecular cloning provides scientists with an essentially unlimited quantity of any individual DNA segments derived from any genome. This material can be used for a wide range of purposes, including those in both basic and applied biological science. A few of the more important applications are summarized here.

Genome organization and gene expression Edit

Molecular cloning has led directly to the elucidation of the complete DNA sequence of the genomes of a very large number of species and to an exploration of genetic diversity within individual species, work that has been done mostly by determining the DNA sequence of large numbers of randomly cloned fragments of the genome, and assembling the overlapping sequences.

At the level of individual genes, molecular clones are used to generate probes that are used for examining how genes are expressed, and how that expression is related to other processes in biology, including the metabolic environment, extracellular signals, development, learning, senescence and cell death. Cloned genes can also provide tools to examine the biological function and importance of individual genes, by allowing investigators to inactivate the genes, or make more subtle mutations using regional mutagenesis or site-directed mutagenesis. Genes cloned into expression vectors for functional cloning provide a means to screen for genes on the basis of the expressed protein's function.

Production of recombinant proteins Edit

Obtaining the molecular clone of a gene can lead to the development of organisms that produce the protein product of the cloned genes, termed a recombinant protein. In practice, it is frequently more difficult to develop an organism that produces an active form of the recombinant protein in desirable quantities than it is to clone the gene. This is because the molecular signals for gene expression are complex and variable, and because protein folding, stability and transport can be very challenging.

Many useful proteins are currently available as recombinant products. These include--(1) medically useful proteins whose administration can correct a defective or poorly expressed gene (e.g. recombinant factor VIII, a blood-clotting factor deficient in some forms of hemophilia, [17] and recombinant insulin, used to treat some forms of diabetes [18] ), (2) proteins that can be administered to assist in a life-threatening emergency (e.g. tissue plasminogen activator, used to treat strokes [19] ), (3) recombinant subunit vaccines, in which a purified protein can be used to immunize patients against infectious diseases, without exposing them to the infectious agent itself (e.g. hepatitis B vaccine [20] ), and (4) recombinant proteins as standard material for diagnostic laboratory tests.

Transgenic organisms Edit

Once characterized and manipulated to provide signals for appropriate expression, cloned genes may be inserted into organisms, generating transgenic organisms, also termed genetically modified organisms (GMOs). Although most GMOs are generated for purposes of basic biological research (see for example, transgenic mouse), a number of GMOs have been developed for commercial use, ranging from animals and plants that produce pharmaceuticals or other compounds (pharming), herbicide-resistant crop plants, and fluorescent tropical fish (GloFish) for home entertainment. [1]

Gene therapy Edit

Gene therapy involves supplying a functional gene to cells lacking that function, with the aim of correcting a genetic disorder or acquired disease. Gene therapy can be broadly divided into two categories. The first is alteration of germ cells, that is, sperm or eggs, which results in a permanent genetic change for the whole organism and subsequent generations. This “germ line gene therapy” is considered by many to be unethical in human beings. [21] The second type of gene therapy, “somatic cell gene therapy”, is analogous to an organ transplant. In this case, one or more specific tissues are targeted by direct treatment or by removal of the tissue, addition of the therapeutic gene or genes in the laboratory, and return of the treated cells to the patient. Clinical trials of somatic cell gene therapy began in the late 1990s, mostly for the treatment of cancers and blood, liver, and lung disorders. [22]

Despite a great deal of publicity and promises, the history of human gene therapy has been characterized by relatively limited success. [22] The effect of introducing a gene into cells often promotes only partial and/or transient relief from the symptoms of the disease being treated. Some gene therapy trial patients have suffered adverse consequences of the treatment itself, including deaths. In some cases, the adverse effects result from disruption of essential genes within the patient's genome by insertional inactivation. In others, viral vectors used for gene therapy have been contaminated with infectious virus. Nevertheless, gene therapy is still held to be a promising future area of medicine, and is an area where there is a significant level of research and development activity.


محتويات

RNA serves as a template for cDNA synthesis. [2] In cellular life, cDNA is generated by viruses and retrotransposons for integration of RNA into target genomic DNA. In molecular biology, RNA is purified from source material after genomic DNA, proteins and other cellular components are removed. cDNA is then synthesized through في المختبر reverse transcription. [3]

RNA Purification Edit

RNA is transcribed from genomic DNA in host cells and is extracted by first lysing cells then purifying RNA utilizing widely-used methods such as phenol-chloroform, silica column, and bead-based RNA extraction methods. [4] Extraction methods vary depending on the source material. For example, extracting RNA from plant tissue requires additional reagents, such as polyvinylpyrrolidone (PVP), to remove phenolic compounds, carbohydrates, and other compounds that will otherwise render RNA unusable. [5] To remove DNA and proteins, enzymes such as DNase and Proteinase K are used for degradation. [6] Importantly, RNA integrity is maintained by inactivating RNases with chaotropic agents such as guanidinium isothiocyanate, sodium dodecyl sulphate (SDS), phenol or chloroform. Total RNA is then separated from other cellular components and precipitated with alcohol. Various commercial kits exist for simple and rapid RNA extractions for specific applications. [7] Additional bead-based methods can be used to isolate specific sub-types of RNA (e.g. mRNA and microRNA) based on size or unique RNA regions. [8] [9]

Reverse Transcription Edit

First-strand synthesis Edit

Using a reverse transcriptase enzyme and purified RNA templates, one strand of cDNA is produced (first-strand cDNA synthesis). The M-MLV reverse transcriptase from the Moloney murine leukemia virus is commonly used due to its reduced RNase H activity suited for transcription of longer RNAs. [10] The AMV reverse transcriptase from the avian myeloblastosis virus may also be used for RNA templates with strong secondary structures (i.e. high melting temperature). [11] cDNA is commonly generated from mRNA for gene expression analyses such as RT-qPCR and RNA-seq. [12] mRNA is selectively reverse transcribed using oligo-dT primers that are the reverse complement of the poly-adenylated tail on the 3' end of all mRNA. An optimized mixture of oligo-dT and random hexamer primers increases the chance of obtaining full-length cDNA while reducing 5' or 3' bias. [13] Ribosomal RNA may also be depleted to enrich both mRNA and non-poly-adenylated transcripts such as some non-coding RNA. [14]

Second-strand synthesis Edit

The result of first-strand syntheses, RNA-DNA hybrids, can be processed through multiple second-strand synthesis methods or processed directly in downstream assays. [15] [16] An early method known as hairpin-primed synthesis relied on hairpin formation on the 3' end of the first-strand cDNA to prime second-strand synthesis. However, priming is random and hairpin hydrolysis leads to loss of information. The Gubler and Hoffman Procedure uses E. Coli RNase H to nick mRNA that is replaced with E. Coli DNA Polymerase I and sealed with E. Coli DNA Ligase. An optimization of this procedure relies on low RNase H activity of M-MLV to nick mRNA with remaining RNA later removed by adding RNase H after DNA Polymerase translation of the second-strand cDNA. This prevents lost sequence information at the 5' end of the mRNA.

Complementary DNA is often used in gene cloning or as gene probes or in the creation of a cDNA library. When scientists transfer a gene from one cell into another cell in order to express the new genetic material as a protein in the recipient cell, the cDNA will be added to the recipient (rather than the entire gene), because the DNA for an entire gene may include DNA that does not code for the protein or that interrupts the coding sequence of the protein (e.g., introns). Partial sequences of cDNAs are often obtained as expressed sequence tags.

With amplification of DNA sequences via polymerase chain reaction (PCR) now commonplace, one will typically conduct reverse transcription as an initial step, followed by PCR to obtain an exact sequence of cDNA for intra-cellular expression. This is achieved by designing sequence-specific DNA primers that hybridize to the 5' and 3' ends of a cDNA region coding for a protein. Once amplified, the sequence can be cut at each end with nucleases and inserted into one of many small circular DNA sequences known as expression vectors. Such vectors allow for self-replication, inside the cells, and potentially integration in the host DNA. They typically also contain a strong promoter to drive transcription of the target cDNA into mRNA, which is then translated into protein.

On 13 June 2013, the United States Supreme Court ruled in the case of Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics that while naturally occurring human genes cannot be patented, cDNA is patent eligible because it does not occur naturally. [17]

cDNA is also used to study gene expression via methods such as RNA-seq or RT-qPCR. [18] [19] [20] For sequencing, RNA must be fragmented due to sequencing platform size limitations. Additionally, second-strand synthesized cDNA must be ligated with adapters that allow cDNA fragments to be PCR amplified and bind to sequencing flow cells. Gene-specific analysis methods commonly use microarrays and RT-qPCR to quantify cDNA levels via fluorometric and other methods.

Some viruses also use cDNA to turn their viral RNA into mRNA (viral RNA → cDNA → mRNA). The mRNA is used to make viral proteins to take over the host cell.

An example of this first step from viral DNA to cDNA can be seen in the HIV cycle of infection. Here, the host cell membrane becomes attached to the virus’ lipid envelope which allows the viral capsid with two copies of viral genome RNA to enter the host. The cDNA copy is then made through reverse transcription of the viral RNA, a process facilitated by the chaperone CypA and a viral capsid associated reverse transcriptase. [21]

cDNA is also generated by retrotransposons in eukaryotic genomes. Retrotransposons are mobile genetic elements that move themselves within, and sometimes between, genomes via RNA intermediates. This mechanism is shared with viruses with the exclusion of the generation of infectious particles. [22] [23]

Mark D. Adams et al. “Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project.” Science (American Association for the Advancement of Science) 252.5013 (1991): 1651–1656. الويب.

Philip M. Murphy, and H. Lee Tiffany. “Cloning of Complementary DNA Encoding a Functional Human Interleukin-8 Receptor.” Science (American Association for the Advancement of Science) 253.5025 (1991): 1280–1283. الويب.


شاهد الفيديو: أساسيات الهندسة الوراثية: أدوات الهندسة الوراثية البلازميدات (أغسطس 2022).