معلومة

مشاكل الواجبات المنزلية - وحدة تعلم الأدب: عامل النسخ Ikaros يقمع بروتين فوسفاتيز 2A (PP2A): مفتاح - علم الأحياء

مشاكل الواجبات المنزلية - وحدة تعلم الأدب: عامل النسخ Ikaros يقمع بروتين فوسفاتيز 2A (PP2A): مفتاح - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

يقوم عامل النسخ Ikaros بقمع تعبير البروتين فوسفاتيز 2A (PP2A) من خلال موقع ربط Intronic. مجلة الكيمياء البيولوجية ، 289 ، 13751-13757 (2014).

الخلفية والمراجعة

الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) هي مرض مناعي ذاتي متعدد العوامل يصيب النساء بشكل أساسي في سنوات الإنجاب. تعد عدم انتظام الجهاز المناعي ، وخاصة في الخلايا التائية ، أحد العوامل المساهمة في أمراض هذا المرض. في الخلايا التائية المعزولة من مرضى SLE ، تؤدي الإشارات الشاذة إلى خصائص غير نمطية ، مثل الفسفرة التيروزينية المحسنة.

أحد المكونات الرئيسية التي تساهم في عيوب الإشارة في التسبب في مرض الذئبة الحمراء هو سيرين / ثريونين بروتين فوسفاتيز 2A (PP2A). PP2A عبارة عن فوسفاتيز سيرين / ثريونين شديد الحفظ معبر عنه في كل مكان ويلعب دورًا رئيسيًا في عدد من العمليات الخلوية مثل انقسام الخلايا ، والحركة ، وديناميات الهيكل الخلوي ، إلخ. تشكيل الإنزيم الأساسي وواحدة من العديد من الوحدات الفرعية التنظيمية المرتبطة بالإنزيم الأساسي لتشكيل holoenzyme وظيفية. يتم زيادة مستويات البروتين PP2A و mRNA وكذلك النشاط الأنزيمي للوحدة الفرعية التحفيزية في الخلايا التائية من مرضى SLE مقارنة بالأفراد الأصحاء.

عنصر استجابة AMP (cAMP) الدوري (CRE) في مروج PP2A ناقص الميثيل في خلايا SLE T. بالإضافة إلى ارتباط بروتين ربط عنصر استجابة cAMP لعامل النسخ (CREBP) يساهم في مستويات التعبير عن PP2A. يزداد cAMP في الخلية استجابة للإشارة الخارجية التي ترتبط بمستقبل مقترن بالبروتين G (GPCR) مما يؤدي إلى تنشيط إنزيم adenylate cyclase ، مما يؤدي إلى تكوين cAMP. ثم يرتبط cAMP وينشط بروتين Kinase A الذي يفسفر البروتينات الأخرى ، بما في ذلك بروتين CREB الموجود في الغالب في السيتوبلازم. ينتقل الروتين CREB المفسفر إلى النواة مما يؤدي إلى انتقال الجين.

أ. ارسم رسما كاريكاتوريا يوضح كيف تؤدي الزيادة في cAMP إلى نسخ الجينات المنشطة لـ CREB.

ب. Hypomethylation للمروج يعزز النسخ. ما هو تأثير فرط الميثيل من محفزات الجينات الكابتة للورم على الخلايا السرطانية؟ ما هو التأثير الذي يمكن أن يحدثه نقص الميثيل على الجينات المشاركة في الخلايا المناعية في أمراض المناعة الذاتية مثل مرض الذئبة الحمراء؟

الإجابة: إن فرط ميثيل الحمض النووي في منطقة المروج في الجينات الكابتة للورم سيؤدي إلى إسكاتها ، مما يؤدي إلى إهمال الخلية وتعزيز النمو. في المقابل ، يمكن أن يؤدي نقص ميثيل الحمض النووي إلى تنشيط جينات الخلايا المناعية التي قد تقلب توازن نسخ الجينات نحو النمط الظاهري الذي يتميز بالتهاب مزمن وأمراض المناعة الذاتية.

آليات إضافية تؤثر على التعبير عن PP2A. حددت دراسة الارتباط الواسع للجينوم (GWAS) تعدد أشكال النوكليوتيدات الفردي (SNP) في الإنترون الأول لـ PPP2CA المرتبط بـ SLE. ارتبط أليل المخاطرة لهذا SNP بأمراض الكلى ، والحمض النووي المضاد مزدوج الشريطة ، والأجسام المضادة المضادة للبروتينوكليوبروتين ، وكلاهما من علامات مرض الذئبة الحمراء. علاوة على ذلك ، كان تعبير PP2A أعلى في المرضى الذين يحملون هذا الأليل ، مما يشير إلى أن SNP هذا قد يلعب دورًا في تنظيم تعبير PP2A. كيف يمكن لطفرة في intron أن تؤثر على نسخ الجينات؟

الإجابة: قد تؤثر الطفرات في الإنترونات على التعبير الجيني (المحدد في النهاية بكمية منتج ترجمة البروتين) عن طريق تغيير التقطيع الذي يمكن أن يؤثر على جميع جوانب إنتاج ومعالجة الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك النسخ ، والبولي أدينيل ، وتصدير الرنا المرسال ، وتوطين الرنا المرسال ، وكفاءة الترجمة والمعدل من اضمحلال الرنا المرسال. قد تكون بمثابة موقع ربط (مروّجات ، محسّنات ، كاتمات للصوت) لعوامل النسخ (البروتينات ، RNA) التي تؤثر على بنية الكروماتين وكفاءة النسخ. يمكن أيضًا نسخها في إطارات قراءة مختلفة لإنتاج منتجات تنظيم الجينات.


أسئلة من المقال

1. استنادًا إلى SNP الموجود في intron 1 من PP2A في مرضى SLE ، افترض الباحثون أن ارتباط عامل النسخ بالنوع البري intron 1 متضمن في لوائح نسخ PP2A.

أ. اذكر طريقتين مختلفتين يمكن أن يؤثر فيها SNP في intron على نسخ PP2A؟

الإجابة: إذا أدى SNP في intron 1 في مرضى SLE إلى زيادة نسخ PP2A ، فمن المرجح أن يؤدي ارتباط عامل النسخ المفترض إلى intron 1 الطبيعي إلى قمع نسخ جين PP2A (أي فقدان الوظيفة). التفسير البديل الأقل احتمالًا هو أن ارتباط عامل النسخ لا يحدث إلا في وجود SNP. هذا من شأنه أن يكتسب طفرة وظيفية من شأنه أن يزيد من تعبير الجين.

يوضح الشكل 1 أ مخططًا للبنية الجينية لـ PP2A (تمت تسميته بشكل خاطئ في الورقة الأصلية). المربعات الخضراء تمثل الإنترونات.

التسلسل الذي يحتوي على الموقع المتغير مُصوَّر باللون الأحمر والسهم.

ب. اكتشف المحققون عامل نسخ محتمل ، Ikaros ، من خلال في السيليكو التجارب التي قد ترتبط بـ Intron 1. لدراسة الارتباط استخدموا مقايسة الكروماتين المناعي (ChIP). عولجت الخلايا الضابطة والتجريبية لفترة وجيزة بالفورمالديهايد لربط بروتينات ربط الحمض النووي تساهميًا بالمواقع المستهدفة على الحمض النووي. يتم أولاً تحليل الخلايا بلطف لإزالة البروتينات السيتوبلازمية. يضاف 1٪ SDS ليحل الخلايا بالكامل. ويتبع ذلك صوتنة لقص الحمض النووي إلى أجزاء صغيرة. يضاف الجسم المضاد للبروتين المستهدف إلى الكروماتين المنفصمة ويتم ترسيب مناعي من خلال حبة متصلة تساهميًا ببروتين (بروتين A أو G) يرتبط بمجال Fc الذي لا يشارك في التعرف على الجسم المضاد للبروتين المستهدف. يمكن عكس الارتباط المتقاطع وتحديد موقع ربط الحمض النووي و / أو البروتين المستهدف. ارسم رسما كاريكاتوريا يظهر التفاعلات ذات الصلة.

إجابة:

قام المحققون بعمل قليل من مادة البيوتين التي تمثل المنطقة ذات الصلة من intron الطبيعي 1 وقلة تحكم عشوائية. أضافوا خلاصات الجوركات الخلوية النووية. تم سحب المعقد لأسفل (ترسبات مناعية) بحبيبات تحتوي على مادة أفيدين التي تربط البيوتين بإحكام. تم تشغيل الواتس على هلام SDS PAGE متبوعًا بطبقة غربية حيث يتم نقل البروتينات المنفصلة إلى غشاء النيتروسليلوز. تم فحص الأغشية بجسم مضاد لـ Ikaros. يتم عرض نتائج اللطخة المناعية (IB) في الشكل 1B. تفسير النتائج؟ إذا كانت فرضية المؤلفين صحيحة ، فكيف ستبدو البقعة إذا استخدموا قلة تحتوي على SNP الموجود في SLE؟

الإجابة: يمثل النطاق القوي للقلة النوعية عند حوالي 62 كيلو بايت عامل نسخ إيكاروس المرتبط بالقليل. أدت خطوة التحكم في هطول الأمطار المناعي إلى انخفاض القليل من Ikaros ، مما يشير إلى أن ارتباط Ikaros بهذا الموقع محدد. يجب على المرء أن يكون حذرًا للغاية في تفسير هذه النتائج ، لكننا نفترض أن البقع المناعية كمية. إذا استخدموا oligo مع SNP ، فسيتم تقليل ارتباط IKZF1 بشكل ملحوظ ، مما يؤدي إلى ظهور شريط باهت على البقعة الغربية.

2. قام الباحثون ببناء منشئات مراسلة لوسيفيراز حيث ربطوا المحفز لـ PP2A متبوعًا بـ Intron 1 حيث تم استنساخه قبل الجين الخاص بالبروتين luciferase ، وهو بروتين بيولوجي يمكن استخدامه للكشف عن تعبير البروتين. ارسم رسما كاريكاتوريا لهذا البناء.

إجابة:

في الشكل 2B ، تم نقل 2 مليون خلية 293T إما بالبلازميد المراسل أعلاه بحد ذاته (250 نانوغرام) أو بالاشتراك مع كميات مختلفة من ناقل تعبير Ikaros (يحتوي على 50 أو 100 أو 200 نانوغرام من المتجه مع الجين لـ Ikaros ، IKZF1) باستخدام Lipofectamine 2000. بعد أربع وعشرين ساعة من تعداء الخلايا ، تم جمع الخلايا وحلها ، وتم تحديد نشاط luciferase باستخدام نظام الفحص الثنائي Luciferase.

في الشكل 2C ، أجريت تجارب مماثلة في اختبار تعبير عابر مع بناء مراسل متحولة (mut) حيث تم حذف موقع ربط Ikaros. النتائج تمثل يعني � S.D. من ثلاث ملاحظات. تشير الأوتاد إلى زيادة التركيزات. تم أيضًا استخدام ناقل تحكم لا يحتوي على مروج PP2A- إدراج Intron 1.

ب. اشرح النتائج الموضحة في 2 ب.

الإجابة: إن التعايش مع الكميات المتزايدة من جين IKZF1 لـ Ikarus يثبط التعبير من محفز PP2A بطريقة تعتمد على الجرعة ، مما يشير إلى أن Ikarus قد يرتبط بـ Intron 1 ويمنع نسخ PP2A.

ج. اشرح النتائج الموضحة في 2C.

يوضح الشكل 2C أنه بالمقارنة مع المراسل من النوع البري ، فإن المراسل المتحولة قد عزز نشاط المراسل. (على سبيل المثال ، كان المتحور غير قادر على الارتباط بـ Intron 1 وقمع تعبير المراسل). علاوة على ذلك ، على عكس البناء من النوع البري ، لم يتأثر نشاط المراسل الطافر بالتعبير عن Ikaros (مقارنة العمود 3 و 5) =. يشير هذا إلى أن ارتباط Ikaros بالموقع المحدد في الإنترون الأول لـ PP2A يؤدي إلى تقليل نشاط مراسل PP2A

3. سأل المحققون عما إذا كان بإمكان Ikaros تنظيم التعبير عن PP2A. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بإفراط في التعبير عن Ikaros في خلايا CD3 + T (الخلايا المناعية) المعزولة من الأفراد الأصحاء ، وليس في فحوصات المراسل. بعد 36 ساعة في المزرعة ، تم جمع الخلايا ومعالجتها من أجل التكتل المناعي. بالنسبة للشكل 3 أ (أدناه) ، تم نقل الخلايا التائية المعزولة من الأفراد الأصحاء بالناقل الفارغ أو 0.5 أو 1 أو 2 ميكروغرام من التعبير Ikaros بلازميد / مليون خلية. تم استخدام خمسة ملايين خلية لكل حالة. 36 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، تم حصاد الخلايا للمضي قدما إما مع PCR في الوقت الحقيقي (الذي يراقب mRNA في الوقت الحقيقي ، اللوحة اليسرى) أو تحليل البروتين باستخدام النشاف الغربي (اللوحة المركزية). بالنسبة لـ PCR في الوقت الفعلي ، تم استخدام جين التدبير المنزلي β-actin للتطبيع. في حالة تحليلات اللطخة الغربية ، تم فحص الغشاء بمضاد Ikaros ، وتم تجريده من البروتينات ، وإعادة فحصه بمضاد PP2A. تم استخدام β-actin كعنصر تحكم في التحميل. تم قياس كثافة النطاق لـ IKZF1 و PP2A باستخدام برنامج Quantity One وتم تطبيعها إلى β-actin. قضبان مفتوحة ، IKZF1 ؛ أشرطة سوداء ، PP2A. IB ، immunoblot.

اشرح النتائج. لماذا قام المؤلفون بعمل لطخة مناعية للأكتين؟

الجواب: أدى التعبير القسري عن Ikaros إلى انخفاض كبير في مستويات البروتين لـ PP2A (الشكل 3A ، اللوحة اليمنى). علاوة على ذلك ، كان هذا الانخفاض يعتمد على الجرعة. أدت زيادة كمية Ikaros المنقولة في الخلايا إلى انخفاض أكبر في تعبير PP2A. لتحديد ما إذا كان Ikaros يقمع تعبير PP2A على مستوى النسخ ، قمنا بتقييم مستويات mRNA لـ PP2A في الخلايا التي تعبر عن Ikaros. تم تخفيض مستويات PP2A mRNA بالمثل استجابةً لفرط التعبير Ikaros (الشكل 3 أ ، اللوحة اليسرى). يعمل الأكتين كعنصر تحكم حيث لا يُتوقع أن يتغير تركيز الجين المنزلي.

في الشكل 3 ب ، تم نقل الخلايا التائية باستخدام سيرنا مخلوط أو سيرنا محدد IKZF (تركيز نهائي 5 أو 10 نانومتر) باستخدام AMAXA. 72 ساعة بعد تعداء الخلايا ، تم حصاد الخلايا وتعريضها إما لتحليل PCR في الوقت الحقيقي أو تحليل البروتين باستخدام النشاف الغربي. في حالة تحليلات اللطخة الغربية ، تم فحص الغشاء بمضاد Ikaros ، وتم تجريده من البروتينات ، وتم استنشاقه بمضاد PP2A. اشرح النتائج.

الإجابة: لتحديد ما إذا كان Ikaros يقمع تعبير PP2A على مستوى النسخ ، قمنا بتقييم مستويات mRNA لـ PP2A في الخلايا التي تعبر عن Ikaros. تم تخفيض مستويات PP2A mRNA بالمثل استجابةً لفرط التعبير Ikaros كبروتين (في 3A). قمنا بعد ذلك بالتحقيق في تأثير إسكات Ikaros على تعبير PP2A. أدى إسكات Ikaros الممكّن من siRNA إلى زيادة مستويات رسالة PP2A وكذلك البروتين (الشكل 3B ، الألواح اليسرى واليمنى ، على التوالي). وبالتالي ، يعمل Ikaros كقمع لتعبير PP2A.

4. استخدم المؤلفون اختبارات ChIP لتأكيد تجنيد Ikaros لهذا الموقع المعين في بيئة خلوية. استخدموا 293T خلية منقولة باستخدام بنية مراسل PP2A-intron (الموصوف أعلاه) بالاقتران مع ناقل فارغ (pCMV) أو ناقل تعبير Ikaros. تم صنع الرواسب المناعية باستخدام جسم مضاد Ikaros أو IgG تحكم. تمت تنقية الحمض النووي المناعي ، وتم قياس وجود الحمض النووي intronic المحدد باستخدام تحليل PCR في الوقت الحقيقي.

أ. يظهر أدناه رسم تخطيطي لمراسلين متحولين (موت) مستخدمين في هذه التجارب.

ب. في الشكل 4B أدناه ، مراسل ChIP في 293T خلايا. تم نقل خلايا 293T من النوع البري فقط (اللوحة اليسرى) أو مراسل متحولة (اللوحة اليمنى) أو المراسل بالاشتراك مع بلازميد تعبير Ikaros باستخدام Lipofectamine 2000. بعد أربع وعشرين ساعة من تعداء الخلايا ، تم جمع الخلايا ، وتم إجراء اختبار ChIP. تم تضخيم المنطقة التي تغطي موقع intron المحدد بواسطة PCR الكمي وتطبيعها مع القيم التي تم الحصول عليها من إدخال DNA. ال رسم بياني يظهر يعني � S.D. السيطرة، مراقبة؛ أب، الجسم المضاد ر، أرنب. .

فسر واشرح النتيجة.

الإجابة: الإجابة: لقد لاحظنا زيادة كبيرة في توظيف Ikaros في intron لـ PP2A في عينات Ikaros المنقولة مقارنة بالخلايا المنقولة بـ pCMV ، مما يشير إلى توظيف Ikaros في هذا الموقع في intron الأول لـ PP2A (الشكل 4B ، يسار لوجة). قمنا أيضًا بتحور المراسل من النوع البري لإنشاء ثلاثة مسوخ (كما هو موضح في الشكل 4 أ) لاختبار خصوصية هذا الموقع. كان اثنان من هذه المسوخات عبارة عن طفرات حذف حيث تم حذف إما موقع ربط Ikaros الأساسي (Del-2) أو عدد قليل من القواعد بالإضافة إلى الموقع الأساسي (Del-1) ، وتم تغيير بعض القواعد المتحولة الثالثة ، وترك موقع ربط Ikaros سليم جزئيًا. لاحظنا أن كلا طفرات الحذف لم تكن قادرة على تجنيد Ikaros ، مما يشير إلى أن غياب هذا الموقع يحول دون ربط Ikaros (الشكل 4 ب ، اللوحة اليمنى). مع المتحولة حيث تم تغيير بعض القواعد ، وترك موقع Ikaros ملزمًا جزئيًا ، يمكننا أن نرى انخفاضًا في التوظيف مقارنة بالمراسل من النوع البري ولكن ليس إلغاءًا كاملاً. يشير هذا إلى أن موقع ربط Ikaros السليم ضروري لتوظيف Ikaros في intron PP2A.

4 ج. لإجراء اختبار أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية ، درس المؤلفون الذاتية PPP2CA الجين في الخلايا التائية بواسطة فحوصات ChIP في الخلايا التائية الأولية وأجرى الترسيب المناعي لبروتين Ikaros الداخلي باستخدام جسم مضاد خاص بـ Ikaros. تم استخدام 5 ملايين من الخلايا التائية الأولية المعزولة حديثًا لكل جسم / عينة. لم يكن هناك تعداء ، واستخدمت البروتينات الداخلية للترسيب المناعي للكروماتين. يظهر الرسم البياني يعني � S.D. فسر واشرح النتيجة.

الإجابة: لاحظ المؤلفون تحسين التوظيف في هذا الموقع في حالة الجسم المضاد الخاص بـ Ikaros مقارنةً بالتحكم IgG ، مما يؤكد أن Ikaros يتم تجنيده في intron الخاص بجين PPP2CA الداخلي.

5. Ikaros هو عامل نسخ إصبع الزنك الذي يحتوي أيضًا على مجال ثنائي الأبعاد في محطة الكربوكسيل الخاصة به والتي يمكن من خلالها تجنيد العديد من البروتينات المختلفة ومنظمات النسخ ، بما في ذلك المجمعات المعدلة للكروماتين مثل Sin3A و Sin3B و Histone deacetylase 1 أو HDAC1.

- إذا ارتبط HDAC بـ Ikaros كما تم توقعه أعلاه ، فما هو التأثير المحتمل لنزع الهستونات على نسخ PP2A؟

الجواب: إذا تم الربط ، فإن نزع السلاسل الجانبية ليسين له سيؤدي إلى شحنة موجبة محتملة على السلسلة الجانبية الأمينية إبسيلون من Lys ، مما يزيد من تفاعلها مع الحمض النووي سالب الشحنة ، وإعادة تكوين النوكليوزومات حول المحفز ، مما يمنع النسخ.

أ. تم إجراء عمليات انتقالية عابرة في خلايا HEK 293T ، متبوعة بمقايسات الترسيب المناعي. باستخدام oligos biotinylated ، نظهر أيضًا أن HDAC1 يرتبط بموقع معين في الإنترون الأول لـ PP2A (الشكل 5 ب). في كل من ChIP الخاص بالمراسل وكذلك ChIP الذاتية في الخلايا التائية الأولية ، يمكننا أن نرى زيادة توظيف HDAC1 في الموقع intronic مقارنةً بالتحكم IgG (الشكل 5C ، الألواح اليمنى واليسرى ، على التوالي) ، مما يؤكد أن HDAC1 لا يرتبط بهذا الموقع في PP2A intron 1.

يوضح الشكل 5 أ نتائج اختبار الترسيب المناعي (IP) الذي يُظهر ارتباط Ikaros بـ HDAC1. تم نقل خلايا 293T مع توليفات مختلفة من البلازميدات باستخدام Lipofectamine 2000. بعد أربع وعشرين ساعة من تعداء الخلايا ، تم تحلل الخلايا ، وتم تحضين المواد الطافية بجسم Ikaros المضاد لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية. بعد الحضانة المسبقة مع الجسم المضاد ، تمت إضافة حبات agarose A / G إلى كل عينة واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. تم بعد ذلك تشغيل المرسبات المناعية على هلام ، ونقلها إلى غشاء PVDF ، وتم مسحها للبروتينات المشار إليها. تم أيضًا تشغيل المدخلات المحفوظة على الجل لتأكيد التعبير المتساوي للبروتينات في جميع العينات. IB ، لطخة مناعية.

فسر النتائج:

الإجابة: كما هو مبين في الشكل 5 أ ، يمكن أن يكون HDAC1 متسربًا مع Ikaros ، مما يشير إلى أن Ikaros و HDAC1 يتفاعلان فعليًا بالفعل.

ب. يوضح الشكل 5 ب نتائج اختبار oligo المرتبط بالبيوتين ، النوعي الداخلي (sp. oligo) أو مقايسات oligo المنسدلة ذات التحكم العشوائي باستخدام المستخلصات النووية لخلية Jurkat. تم تشغيل الوصلات على هلام وتم فحصها باستخدام الجسم المضاد لـ HDAC1.

اشرح النتائج.

الإجابة: باستخدام oligos biotinylated ، نظهر أيضًا أن HDAC1 يرتبط بموقع معين في الإنترون الأول لـ PP2A (الشكل 5 ب)

ج. في الشكل 5C النتائج من مراسل ChIP (اللوحة اليسرى) و ChIP (اللوحة اليمنى) في 293T والخلايا التائية الأولية ، على التوالي ، تظهر. تم نقل خلايا 293T (اللوحة اليسرى) مع المراسل بالاشتراك مع بلازميدات التعبير Ikaros و HDAC1 باستخدام Lipofectamine 2000. بعد أربع وعشرين ساعة من تعداء الخلايا ، تم جمع الخلايا ، وتم إجراء اختبار ChIP باستخدام مجموعة MAGnify ChIP. بالنسبة إلى ChIP مع البروتين الداخلي في الخلايا التائية الأولية (اللوحة اليمنى) ، تم استخدام 5 ملايين من الخلايا التائية الأولية المعزولة حديثًا لكل جسم مضاد (ab) / عينة. السيطرة ، السيطرة ؛ أرنب السيدة ، الماوس. اشرح النتيجة.

الإجابة: في كل من ChIP الخاص بالمراسل وكذلك ChIP الذاتية في الخلايا التائية الأولية ، يمكننا أن نرى زيادة توظيف HDAC1 في موقع intronic مقارنةً بالتحكم IgG (الشكل 5C ، الألواح اليسرى واليمنى ، على التوالي) ،

د. في الشكل 5 د ، تم نقل الخلايا التائية باستخدام سيرنا التحكم أو سيرنا الخاص بـ HDAC1 10 نانومتر مع أو بدون انتقال العدوى لبلازميد إيكاروس. 72 ساعة بعد تعداء الخلايا ، تم حصاد الخلايا وإخضاعها لتحليل PCR في الوقت الحقيقي. تم استخدام جين التدبير المنزلي β-actin للتطبيع. اشرح النتائج.

الإجابة: بعد إثبات أن HDAC1 يتفاعل مع Ikaros ويتم تجنيده في هذا الموقع ، أردنا إثبات أن قمع تعبير PP2A الذي نراه يرجع إلى HDAC1. لهذا الغرض ، استخدمنا طريقتين مختلفتين. باستخدام siRNA ، قمنا بإسكات HDAC1 في الخلايا التي تفرط في التعبير عن Ikaros وقمنا بتقييم مستويات mRNA لـ PP2Ac. كما هو متوقع ، أدى الإفراط في التعبير عن Ikaros إلى انخفاض مستويات PP2A mRNA. ومع ذلك ، فإن إسكات HDAC1 بوساطة siRNA في هذه الخلايا أعاد مستويات PP2A إلى حوالي 50 ٪ من الأصل ، مما يشير إلى أنه في حالة عدم وجود HDAC1 ، فإن قمع PP2A بوساطة Ikaros ليس مؤهلاً (الشكل 5D).

الشكل 5E. E ، تم نقل الخلايا التائية الأولية باستخدام بلازميد Ikaros باستخدام AMAXA. بعد أربع وعشرين ساعة من تعداء الخلايا ، عولجت الخلايا بـ 100 نانوغرام / مل من trichostatin A (TSA) لمدة 12 ساعة. تم استخدام نفس الحجم من ثنائي ميثيل سلفوكسيد كما هو الحال في التحكم في المركبات. تم حصاد الخلايا ، وتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي. اشرح النتيجة.

الإجابة: ثانيًا ، استخدمنا مثبط HDAC1 ، trichostatin A لتأكيد ذلك. تم نقل الخلايا التائية باستخدام Ikaros ، متبوعًا بعلاج لمدة 12 ساعة مع trichostatin A. أدى علاج الخلايا باستخدام trichostatin A إلى الاستعادة الكاملة لتعبير PP2A (الشكل 5E). وبالتالي ، فإن قمع تعبير PP2A الذي شوهد على Ikaros overexpression يرجع جزئيًا على الأقل إلى تجنيد HDAC1 في نفس الموقع. قد يؤثر تجنيد HDAC1 في هذا الموقع على إمكانية الوصول إلى عوامل النسخ للمروج ، مما يؤثر على التعبير الجيني لـ PP2A

6. اكتب فقرة تلخص الاستنتاجات الرئيسية لهذه الورقة:

Ikaros هو معدل تعبير PP2A. يرتبط بموقع في الإنترون الأول لـ PPP2CA ويقلل من مستويات التعبير لـ PP2A. تعتمد القدرة القمعية لـ Ikaros ، جزئيًا على الأقل ، على توظيف هيستون ديستيلاز HDAC1 ، مما يؤثر على إمكانية الوصول إلى الكروماتين. قد تساعد هذه الآلية الجديدة لعامل النسخ الكلاسيكي في تفسير خلل تنظيم نشاط PP2A في الذئبة الحمامية الجهازية.


شاهد الفيديو: دورة تدريبية لشرح النظام المدرسي - المدرسة الرقمية الاليكترونية ج3 (أغسطس 2022).