معلومة

10.2: تصور وتمييز الحمض النووي - علم الأحياء

10.2: تصور وتمييز الحمض النووي - علم الأحياء



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

مهارات التطوير

  • اشرح استخدام مجسات الحمض النووي لتصور تسلسلات معينة من الحمض النووي
  • اشرح استخدام الرحلان الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي
  • شرح مبدأ تقييد طول القطعة وتحليل تعدد الأشكال واستخداماتها
  • قارن وقابل التباين بين البقع الجنوبية والشمالية
  • شرح مبادئ واستخدامات تحليل ميكروأري
  • وصف الطرق المستخدمة لفصل وتصور متغيرات البروتين
  • شرح طريقة واستخدامات تفاعل البلمرة المتسلسل وتسلسل الحمض النووي

يمكن أن يساعدنا تسلسل جزيء الحمض النووي في تحديد الكائن الحي عند مقارنته بالتسلسلات المعروفة الموجودة في قاعدة البيانات. يمكن للتسلسل أن يخبرنا أيضًا بشيء عن وظيفة جزء معين من الحمض النووي ، مثل ما إذا كان يشفر بروتينًا معينًا. تعد مقارنة تواقيع البروتين - مستويات التعبير عن صفائف محددة من البروتينات - بين العينات طريقة مهمة لتقييم الاستجابات الخلوية للعديد من العوامل والضغوط البيئية. يمكن أن يكشف تحليل بصمات البروتين عن هوية الكائن الحي أو كيفية استجابة الخلية أثناء المرض.

الحمض النووي والبروتينات ذات الأهمية مجهرية ومختلطة عادةً مع العديد من الجزيئات الأخرى بما في ذلك الحمض النووي أو البروتينات التي لا علاقة لها باهتماماتنا. تم تطوير العديد من التقنيات لعزل ووصف الجزيئات ذات الأهمية. تم تطوير هذه الأساليب في الأصل لأغراض البحث ، ولكن في كثير من الحالات تم تبسيطها لدرجة أن الاستخدام السريري الروتيني ممكن. على سبيل المثال ، العديد من مسببات الأمراض ، مثل البكتيريا هيليكوباكتر بيلوري، الذي يسبب قرحة في المعدة ، يمكن اكتشافه باستخدام الاختبارات المعتمدة على البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لعدد متزايد من فحوصات تحديد الهوية المعتمدة على تضخيم الحمض النووي عالية الدقة والدقة اكتشاف مسببات الأمراض مثل البكتيريا المعوية المقاومة للمضادات الحيوية ، وفيروس الهربس البسيط ، وفيروس الحماق النطاقي ، وغيرها الكثير.

التحليل الجزيئي للحمض النووي

في هذا القسم الفرعي ، سنلخص بعض الطرق الأساسية المستخدمة لفصل وتصور أجزاء معينة من الحمض النووي التي تهم العالم. لا تتطلب بعض هذه الطرق معرفة التسلسل الكامل لجزيء الحمض النووي. قبل ظهور تسلسل الحمض النووي السريع ، كانت هذه الطرق هي الوحيدة المتاحة للعمل مع الحمض النووي ، لكنها لا تزال تشكل ترسانة أساسية من الأدوات التي يستخدمها علماء الوراثة الجزيئية لدراسة استجابات الجسم للأمراض الميكروبية وغيرها.

فحص الحمض النووي

جزيئات الحمض النووي صغيرة ، والمعلومات الواردة في تسلسلها غير مرئية. كيف يقوم الباحث بعزل جزء معين من الحمض النووي ، أو بعد عزله ، وتحديد الكائن الحي منه ، أو ما هو تسلسله ، أو ما هي وظيفته؟ تستخدم إحدى الطرق لتحديد وجود تسلسل DNA معين قطعًا مصطنعة من الحمض النووي تسمى المسابير. يمكن استخدام المجسات لتحديد الأنواع البكتيرية المختلفة في البيئة والعديد من تحقيقات الحمض النووي متاحة الآن للكشف عن مسببات الأمراض سريريًا. على سبيل المثال ، تُستخدم مجسات الحمض النووي للكشف عن مسببات الأمراض المهبلية المبيضات البيض, Gardnerella vaginalis، و المشعرات المهبلية.

لفحص مكتبة الجينوم بحثًا عن جين معين أو تسلسل اهتمام ، يجب أن يعرف الباحثون شيئًا عن هذا الجين. إذا كان لدى الباحثين جزءًا من تسلسل الحمض النووي للجين المعني ، فيمكنهم تصميم مسبار الحمض النووي ، وهو جزء من الحمض النووي أحادي السلسلة مكمل لجزء من الجين محل الاهتمام ويختلف عن تسلسلات الحمض النووي الأخرى في العينة. قد يتم تصنيع مسبار الحمض النووي كيميائيًا بواسطة المعامل التجارية ، أو قد يتم إنشاؤه عن طريق الاستنساخ ، والعزل ، وتحريف جزء من الحمض النووي من كائن حي. في كلتا الحالتين ، يجب تمييز مسبار الحمض النووي بعلامة جزيئية أو منارة ، مثل ذرة الفوسفور المشعة (كما هو مستخدم في التصوير الشعاعي الذاتي) أو صبغة الفلورسنت (كما هو مستخدم في الفلورسنت) فى الموقع التهجين ، أو FISH) ، بحيث يمكن رؤية المسبار والحمض النووي الذي يرتبط به (الشكل ( PageIndex {1} )). يجب أيضًا تغيير طبيعة عينة الحمض النووي التي يتم فحصها لجعلها أحادية السلسلة بحيث يمكن لمسبار الحمض النووي أحادي السلسلة أن يصلب إلى عينة الحمض النووي أحادية السلسلة في المواقع التي تكون فيها تسلسلها مكملة. في حين أن هذه التقنيات ذات قيمة للتشخيص ، إلا أن استخدامها المباشر على عينات البلغم والجسم الأخرى قد يكون مشكلة بسبب الطبيعة المعقدة لهذه العينات. غالبًا ما يجب أولاً عزل الحمض النووي من عينات الجسم من خلال طرق الاستخراج الكيميائي قبل استخدام مسبار الحمض النووي لتحديد مسببات الأمراض.

الشكل ( PageIndex {1} ): يمكن استخدام مجسات الحمض النووي لتأكيد وجود العامل الممرض المشتبه به في عينات المرضى. يوضح هذا الرسم البياني كيف يمكن استخدام مسبار الحمض النووي للبحث عن الجين المهم المرتبط بالعامل الممرض المشتبه به.

الجزء 2

يمكن أن تكون الأعراض الخفيفة الشبيهة بالإنفلونزا التي تعاني منها كايلا ناتجة عن أي عدد من العوامل المعدية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من حالات المناعة الذاتية غير المعدية ، مثل التصلب المتعدد والذئبة الحمامية الجهازية (SLE) والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، لها أيضًا أعراض تتفق مع أعراض كايلا المبكرة. ومع ذلك ، على مدار عدة أسابيع ، ساءت أعراض كايلا. بدأت تعاني من آلام المفاصل في ركبتيها ، وخفقان القلب ، وترهل غريب في عضلات وجهها. بالإضافة إلى ذلك ، عانت من تيبس في الرقبة وصداع مؤلم. قررت على مضض أن الوقت قد حان لطلب العناية الطبية.

تمرين ( PageIndex {1} )

  1. هل تقدم أعراض كايلا الجديدة أي أدلة على نوع العدوى أو الحالة الطبية الأخرى التي قد تكون مصابة بها؟
  2. ما الاختبارات أو الأدوات التي قد يستخدمها مقدم الرعاية الصحية لتحديد العامل الممرض الذي يسبب أعراض كايلا؟

الاغاروز الكهربائي للهلام

هناك عدد من المواقف التي قد يرغب فيها الباحث في الفصل المادي بين مجموعة من أجزاء الحمض النووي ذات الأحجام المختلفة. يمكن للباحث أيضًا هضم عينة من الحمض النووي باستخدام إنزيم تقييد لتشكيل شظايا. يمكن أن ينتج عن نمط توزيع الحجم والحجم الناتج غالبًا معلومات مفيدة حول تسلسل قواعد الحمض النووي التي يمكن استخدامها ، مثل مسح الرمز الشريطي ، لتحديد الفرد أو الأنواع التي ينتمي إليها الحمض النووي.

الرحلان الكهربائي للهلام هو أسلوب شائع الاستخدام لفصل الجزيئات البيولوجية بناءً على الحجم والخصائص الكيميائية الحيوية ، مثل الشحن والقطبية. يستخدم الاغاروز الكهربائي على نطاق واسع لفصل الحمض النووي (أو الحمض النووي الريبي) بأحجام مختلفة والتي قد تتولد عن طريق هضم إنزيم التقييد أو بوسائل أخرى ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل ( PageIndex {2} )).

بسبب العمود الفقري المشحون سالبًا ، ينجذب الحمض النووي بشدة إلى القطب الموجب. في الاغاروز الكهربائي للهلام ، يتم توجيه الهلام أفقياً في محلول عازل. يتم تحميل العينات في آبار العينة على جانب الهلام الأقرب إلى القطب السالب ، ثم يتم سحبها من خلال المنخل الجزيئي لمصفوفة الاغاروز باتجاه القطب الموجب. تعيق مصفوفة agarose حركة الجزيئات الأكبر عبر الهلام ، بينما تمر الجزيئات الأصغر بسهولة أكبر. وبالتالي ، فإن مسافة الهجرة ترتبط عكسياً بحجم جزء الحمض النووي ، حيث تنتقل الأجزاء الأصغر لمسافة أطول عبر الهلام. يمكن تقدير أحجام شظايا الحمض النووي داخل العينة من خلال مقارنتها بأجزاء ذات حجم معروف في سلم DNA تعمل أيضًا على نفس الهلام. لفصل شظايا الحمض النووي الكبيرة جدًا ، مثل الكروموسومات أو الجينوم الفيروسي ، يمكن تعديل الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز عن طريق التناوب الدوري لتوجيه المجال الكهربائي أثناء الرحلان الكهربائي للهلام في المجال النبضي (PFGE). في PFGE ، يمكن للشظايا الأصغر أن تعيد توجيه نفسها وتنتقل أسرع قليلاً من الشظايا الأكبر ، وبالتالي يمكن أن تعمل هذه التقنية على فصل الأجزاء الكبيرة جدًا التي يمكن أن تنتقل معًا خلال الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز القياسي. في أي من تقنيات الرحلان الكهربائي هذه ، يمكن الكشف عن مواقع شظايا الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي في الهلام بطرق مختلفة. تتمثل إحدى الطرق الشائعة في إضافة بروميد إيثيديوم ، وهي بقعة تدخل في الأحماض النووية في مواقع غير محددة ويمكن تصورها عند تعرضها للأشعة فوق البنفسجية. تتوفر الآن بقع أخرى أكثر أمانًا من بروميد الإيثيديوم ، وهو مادة مسرطنة محتملة.

الشكل ( PageIndex {2} ): (أ) عملية الاغاروز الكهربائي للهلام. (ب) يقوم الباحث بتحميل العينات في مادة هلامية. (ج) تُظهر هذه الصورة رحلانًا كهربائيًا مكتملًا يعمل على هلام الاغاروز. يقع سلم الحمض النووي في الممر 1 و 9. توجد سبع عينات في الممرات من 2 إلى 8. تم تلطيخ الجل ببروميد الإيثيديوم وتم تصويره تحت الأشعة فوق البنفسجية. (الائتمان أ: تعديل العمل بواسطة Magnus Manske ؛ الائتمان ب: تعديل العمل من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ؛ الائتمان ج: تعديل العمل بواسطة جيمس جاكوب)

تحليل تعدد الأشكال (RFLP)

مواقع التعرف على إنزيمات التقييد قصيرة (فقط عدد قليل من النيوكليوتيدات طويلة) ، متناظرة خاصة بالتسلسل ، ويمكن العثور عليها في جميع أنحاء الجينوم. وبالتالي ، فإن الاختلافات في تسلسل الحمض النووي في جينومات الأفراد ستؤدي إلى اختلافات في توزيع مواقع التعرف على إنزيم التقييد التي يمكن تصورها على أنها أنماط نطاقات متميزة على مادة هلامية بعد الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. يقارن تحليل تعدد الأشكال لطول جزء التقييد (RFLP) أنماط ربط الحمض النووي لعينات مختلفة من الحمض النووي بعد هضم التقييد (الشكل ( PageIndex {3} )).

يحتوي تحليل RFLP على العديد من التطبيقات العملية في كل من الطب وعلوم الطب الشرعي. على سبيل المثال ، يستخدم علماء الأوبئة تحليل RFLP لتتبع وتحديد مصدر الكائنات الدقيقة المحددة المتورطة في تفشي التسمم الغذائي أو بعض الأمراض المعدية. يمكن أيضًا استخدام تحليل RFLP على الحمض النووي البشري لتحديد أنماط وراثة الكروموسومات ذات الجينات المتغيرة ، بما في ذلك تلك المرتبطة بأمراض وراثية أو لإثبات الأبوة.

يستخدم علماء الطب الشرعي تحليل RFLP كشكل من أشكال بصمات الحمض النووي ، وهو مفيد لتحليل الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من مسرح الجريمة والمشتبه بهم والضحايا. يتم جمع عينات الحمض النووي ، ويتم زيادة عدد نسخ عينات جزيئات الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ومن ثم إخضاعها لعملية هضم إنزيم مقيد ورحلان هلام الاغاروز الكهربائي لتوليد أنماط نطاقات محددة. من خلال مقارنة أنماط ربط العينات التي تم جمعها من مسرح الجريمة بتلك التي تم جمعها من المشتبه بهم أو الضحايا ، يمكن للمحققين تحديد ما إذا كانت أدلة الحمض النووي التي تم جمعها في مكان الحادث قد تركها المشتبه بهم أو الضحايا.

الشكل ( PageIndex {3} ): يمكن استخدام تحليل RFLP للتمييز بين تسلسل الحمض النووي. في هذا المثال ، يتم هضم الكروموسوم الطبيعي إلى جزأين ، بينما ينتج عن هضم الكروموسوم المتحور جزءًا واحدًا فقط. تظهر الأسهم الحمراء الصغيرة التي تشير إلى مقطعي كروموسوم مختلفين مواقع مواقع التعرف على إنزيم التقييد. بعد الهضم والرحلان الكهربي لهلام الاغاروز ، تعكس أنماط النطاقات التغيير من خلال إظهار فقدان شريطين أقصر واكتساب نطاق أطول. (الائتمان: تعديل العمل من قبل المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية)

البقع والتعديلات الجنوبية

تستفيد العديد من التقنيات الجزيئية من تكامل التسلسل والتهجين بين الأحماض النووية لعينة ومسبار الحمض النووي. عادةً ما يكون فحص عينات الحمض النووي داخل الهلام غير ناجح لأنه عندما يتغلغل مسبار الحمض النووي في مادة هلامية ، تنتشر عينة الأحماض النووية داخل الهلام. وبالتالي ، تُستخدم تقنيات النشاف بشكل شائع لنقل الأحماض النووية إلى غشاء رقيق موجب الشحنة مصنوع من النيتروسليلوز أو النايلون. في تقنية النشاف الجنوبية ، التي طورها السير إدوين ساذرن في عام 1975 ، يتم فصل أجزاء الحمض النووي الموجودة في العينة أولاً عن طريق الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز ثم يتم نقلها إلى غشاء من خلال العمل الشعري (الشكل ( فهرس الصفحة {4} )). يتم بعد ذلك تعريض شظايا الحمض النووي التي ترتبط بسطح الغشاء إلى مسبار الحمض النووي أحادي الجديلة المسمى بمنارة جزيئية مشعة أو فلورية للمساعدة في الكشف. يمكن استخدام اللطخات الجنوبية للكشف عن وجود تسلسلات معينة من الحمض النووي في عينة معينة من الحمض النووي. بمجرد تصور الحمض النووي المستهدف داخل الغشاء ، يمكن للباحثين قطع جزء الغشاء الذي يحتوي على الجزء لاستعادة جزء الحمض النووي محل الاهتمام.

الشكل ( PageIndex {4} ): في تقنية اللطخة الجنوبية ، يتم فصل شظايا الحمض النووي أولاً عن طريق الرحلان الكهربي لهلام الاغاروز ، ثم يتم نقلها عن طريق عمل الشعيرات الدموية إلى غشاء من النايلون ، ثم يتم غمرها بمسبار DNA الموسوم بمنارة جزيئية لتسهيل التصور.

لا تتضمن الاختلافات في اللطخة الجنوبية - لطخة النقطة ، وصمة الفتحة ، وبقعة البقعة - رحلانًا كهربائيًا ، ولكنها تركز بدلاً من ذلك الحمض النووي من عينة إلى موقع صغير على الغشاء. بعد التهجين بمسبار الحمض النووي ، يتم قياس شدة الإشارة المكتشفة ، مما يسمح للباحث بتقدير كمية الحمض النووي المستهدف الموجود داخل العينة.

لطخة المستعمرة هي نوع آخر من اللطخة الجنوبية حيث يتم نقل المستعمرات التي تمثل الحيوانات المستنسخة المختلفة في مكتبة الجينوم إلى غشاء عن طريق الضغط على الغشاء على لوحة الثقافة. يتم تحليل الخلايا الموجودة على الغشاء ويمكن بعد ذلك فحص الغشاء لتحديد المستعمرات الموجودة داخل مكتبة الجينوم التي تؤوي الجين المستهدف. نظرًا لأن المستعمرات الموجودة على الصفيحة لا تزال تنمو ، يمكن عزل الخلايا المعنية عن اللوحة.

في اللطخة الشمالية ، هناك نوع آخر من اللطخة الجنوبية ، RNA (وليس DNA) يتم تجميده على الغشاء وفحصه. تُستخدم اللطخات الشمالية عادةً لاكتشاف كمية الرنا المرسال التي يتم إجراؤها من خلال التعبير الجيني داخل عينة الأنسجة أو الكائن الحي.

تحليل ميكروأري

هناك تقنية أخرى تستفيد من التهجين بين متواليات الحمض النووي التكميلي تسمى تحليل المصفوفة الدقيقة. يعد تحليل المصفوفة الدقيقة مفيدًا لمقارنة أنماط التعبير الجيني بين أنواع الخلايا المختلفة - على سبيل المثال ، الخلايا المصابة بفيروس مقابل الخلايا غير المصابة ، أو الخلايا السرطانية مقابل الخلايا السليمة (الشكل ( PageIndex {5} )).

عادةً ما يتم ترسيب الحمض النووي أو (كدنا) من عينة تجريبية على شريحة زجاجية جنبًا إلى جنب مع تسلسلات الحمض النووي المعروفة. يمكن أن تحتوي كل شريحة على أكثر من 30000 نوع مختلف من أجزاء الحمض النووي. يمكن رصد شظايا DNA المميزة (التي تشمل مكتبة الجينوم الكاملة للكائن الحي) أو شظايا cDNA (المقابلة لتكملة الكائن الحي الكاملة للجينات المعبر عنها) بشكل فردي على شريحة زجاجية.

بمجرد إيداعه على الشريحة ، يمكن عزل الحمض النووي الجيني أو الرنا المرسال من العينتين للمقارنة. إذا تم عزل mRNA ، يتم نسخه إلى cDNA باستخدام النسخ العكسي. ثم يتم تمييز عينتين من الحمض النووي الجيني أو (كدنا) بأصباغ فلورية مختلفة (عادة حمراء وخضراء). يتم بعد ذلك دمج عينات الحمض النووي الجينومي بكميات متساوية ، وإضافتها إلى شريحة ميكروأري ، والسماح لها بالتهجن إلى بقع مكملة على المصفوفة الدقيقة.

يمكن مراقبة تهجين جزيئات الحمض النووي الجينومي عن طريق قياس شدة التألق في نقاط معينة على المصفوفة الدقيقة. يمكن ملاحظة الفروق في كمية التهجين بين العينات بسهولة. إذا تم تهجين الأحماض النووية لعينة واحدة فقط في بقعة معينة على المصفوفة الدقيقة ، فستظهر تلك البقعة إما باللون الأخضر أو ​​الأحمر. ومع ذلك ، إذا تهجنت الأحماض النووية في كلتا العينتين ، فستظهر البقعة باللون الأصفر بسبب مزيج الأصباغ الحمراء والخضراء.

على الرغم من أن تقنية ميكروأري تسمح بإجراء مقارنة شاملة بين عينتين في وقت قصير ، إلا أنها تتطلب معدات كشف معقدة (ومكلفة) وبرامج تحليل. بسبب التكلفة ، تقتصر هذه التقنية عادةً على إعدادات البحث. استخدم الباحثون تحليل المصفوفات الدقيقة لدراسة كيفية تأثر التعبير الجيني في الكائنات الحية المصابة بالبكتيريا أو الفيروسات أو الخاضعة لمعالجات كيميائية معينة.

الشكل ( PageIndex {5} ): (أ) يتم توضيح الخطوات في تحليل ميكروأري. هنا ، تتم مقارنة أنماط التعبير الجيني بين الخلايا السرطانية والخلايا السليمة. (ب) يمكن التعبير عن معلومات Microarray كخريطة حرارة. تظهر الجينات على الجانب الأيسر ؛ يتم عرض عينات مختلفة عبر الجزء السفلي. تظهر الجينات المعبر عنها فقط في الخلايا السرطانية بدرجات متفاوتة من اللون الأحمر. تظهر الجينات المعبر عنها فقط في الخلايا الطبيعية بدرجات متفاوتة من اللون الأخضر. تظهر الجينات التي يتم التعبير عنها في كل من الخلايا السرطانية والعادية باللون الأصفر.

استكشف تقنية الرقائق الدقيقة في هذا الموقع التفاعلي.

تمرين ( PageIndex {2} )

  1. ماذا يتكون مسبار الحمض النووي؟
  2. لماذا يتم استخدام لطخة جنوبية بعد الرحلان الكهربائي للهلام لهضم الحمض النووي؟

التحليل الجزيئي للبروتينات

في كثير من الحالات ، قد لا يكون من المرغوب أو من الممكن دراسة الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي مباشرة. يمكن أن توفر البروتينات معلومات خاصة بالأنواع لتحديد الهوية بالإضافة إلى معلومات مهمة حول كيفية وما إذا كانت الخلية أو الأنسجة تستجيب لوجود الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض. تتطلب البروتينات المختلفة طرقًا مختلفة للعزل والتوصيف.

بولي أكريلاميد جل الكهربائي

يشيع استخدام نوع مختلف من الرحلان الكهربائي للهلام ، يسمى بولي أكريلاميد هلام الكهربي (PAGE) ، لفصل البروتينات. في PAGE ، تكون مصفوفة الهلام أدق وتتكون من بولي أكريلاميد بدلاً من الاغاروز. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنفيذ PAGE عادةً باستخدام جهاز جل عمودي (الشكل ( PageIndex {6} )). بسبب الشحنات المتفاوتة المرتبطة بالسلاسل الجانبية للأحماض الأمينية ، يمكن استخدام PAGE لفصل البروتينات السليمة بناءً على شحناتها الصافية. بدلاً من ذلك ، يمكن تغيير طبيعة البروتينات وتغليفها بمنظف سالب الشحنة يسمى كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، لإخفاء الشحنات الأصلية والسماح بالفصل بناءً على الحجم فقط. يمكن تعديل PAGE بشكل إضافي لفصل البروتينات بناءً على خاصيتين ، مثل شحناتها عند مختلف الأس الهيدروجيني بالإضافة إلى حجمها ، من خلال استخدام PAGE ثنائي الأبعاد. في أي من هذه الحالات ، بعد الرحلان الكهربي ، يتم تصور البروتينات من خلال التلوين ، وعادة ما تكون إما باللون الأزرق كوماسي أو الفضة.

الشكل ( PageIndex {6} ): (أ) SDS عبارة عن منظف يفسد طبيعة البروتينات ويخفي شحناتها الأصلية ، مما يجعلها سالبة الشحنة بشكل موحد. (ب) يتم توضيح عملية SDS-PAGE في هذه الخطوات. (ج) تُظهر صورة هلام SDS-PAGE نطاقات Coomassie الملطخة حيث هاجرت البروتينات ذات الأحجام المختلفة على طول الجل استجابةً للجهد المطبق. يمكن رؤية ممر قياسي بالحجم على الجانب الأيمن من الجل. (الائتمان ب: تعديل العمل من قبل “GeneEd” / يوتيوب)

تمرين ( PageIndex {3} )

على أي أساس يتم فصل البروتينات في SDS-PAGE؟

الجزء 3

عندما وصفت كايلا أعراضها ، اشتبه طبيبها في البداية في التهاب السحايا الجرثومي ، وهو ما يتوافق مع صداعها وتيبس الرقبة.ومع ذلك ، سرعان ما استبعدت هذا كاحتمال لأن التهاب السحايا يتطور عادة بسرعة أكبر مما كانت تعاني منه كايلا. لا تزال العديد من أعراضها موازية لأعراض التصلب الجانبي الضموري (ALS) والذئبة الحمامية الجهازية (SLE) ، واعتبر الطبيب أيضًا أن مرض لايم هو احتمال بالنظر إلى مقدار الوقت الذي تقضيه كايلا في الغابة. لم تتذكر كايلا أي لدغات قراد حديثة (الوسيلة النموذجية لانتقال مرض لايم) ولم يكن لديها طفح جلدي نموذجي مرتبط بمرض لايم (الشكل ( فهرس الصفحة {7} )). ومع ذلك ، فإن 20-30 ٪ من مرضى داء لايم لا يصابون بهذا الطفح الجلدي ، لذلك لم يرغب الطبيب في استبعاده.

أمر طبيب كايلا بإجراء تصوير بالرنين المغناطيسي لدماغها ، وإجراء تعداد الدم الكامل لاختبار فقر الدم ، واختبارات الدم لتقييم وظائف الكبد والكلى ، واختبارات إضافية لتأكيد أو استبعاد مرض الذئبة الحمراء أو مرض لايم. كانت نتائج اختبارها غير متوافقة مع كل من SLE و ALS ، وكانت نتيجة الاختبار الذي يبحث عن الأجسام المضادة لمرض لايم "ملتبسة" ، أي غير حاسمة. بعد استبعاد مرض التصلب الجانبي الضموري والذئبة الحمراء ، قرر طبيب كايلا إجراء اختبارات إضافية لمرض لايم.

تمرين ( PageIndex {4} )

  1. لماذا لا يزال طبيب كايلا يشتبه في مرض لايم حتى لو لم تكشف نتائج الاختبار عن الأجسام المضادة لايم في الدم؟
  2. ما نوع الاختبار الجزيئي الذي يمكن استخدامه للكشف عن الأجسام المضادة في الدم لمرض لايم؟
إجابة

أضف نص إجابة هنا وسيختفي تلقائيًا إذا كان لديك نموذج "رقم تلقائي" نشط على الصفحة.

الشكل ( PageIndex {7} ): الطفح الجلدي هو أحد الأعراض الشائعة لأمراض لايم ، ولكن ما يصل إلى 30 ٪ من الأفراد المصابين لا يصابون بطفح جلدي. (الائتمان: مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها)

طرق تحليل الحمض النووي القائمة على التضخيم

يمكن استخدام طرق مختلفة للحصول على تسلسل الحمض النووي ، وهي مفيدة لدراسة الكائنات الحية المسببة للأمراض. مع ظهور تقنية التسلسل السريع ، نمت قاعدة معرفتنا للجينومات الكاملة للكائنات المسببة للأمراض بشكل هائل. نبدأ بوصف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهو ليس طريقة تسلسل ولكنه سمح للباحثين والأطباء بالحصول على كميات كبيرة من الحمض النووي اللازمة للتسلسل والدراسات الأخرى. يلغي تفاعل البوليميراز المتسلسل الاعتماد الذي كان لدينا في السابق على الخلايا لعمل نسخ متعددة من الحمض النووي ، وتحقيق نفس النتيجة من خلال تفاعلات بسيطة نسبيًا خارج الخلية.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

تتطلب معظم طرق تحليل الحمض النووي ، مثل هضم إنزيم التقييد والرحلان الكهربي لهلام الاغاروز ، أو تسلسل الحمض النووي كميات كبيرة من جزء معين من الحمض النووي. في الماضي ، تم إنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي عن طريق تنمية الخلايا المضيفة لمكتبة الجينوم. ومع ذلك ، تستغرق المكتبات وقتًا وجهدًا للتحضير وغالبًا ما تأتي عينات الحمض النووي ذات الأهمية بكميات صغيرة. يسمح تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) بالتضخيم السريع في عدد نسخ متواليات DNA المحددة لمزيد من التحليل (الشكل ( PageIndex {8} )). واحدة من أقوى التقنيات في البيولوجيا الجزيئية ، تم تطوير PCR في 1983 بواسطة Kary Mullis أثناء وجوده في Cetus Corporation. يحتوي تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على تطبيقات محددة في المختبرات البحثية والطب الشرعي والسريري ، بما في ذلك:

  • تحديد تسلسل النيوكليوتيدات في منطقة معينة من الحمض النووي
  • تضخيم منطقة مستهدفة من الحمض النووي للاستنساخ في ناقل بلازميد
  • تحديد مصدر عينة الحمض النووي المتروكة في مسرح الجريمة
  • تحليل العينات لتحديد الأبوة
  • مقارنة عينات من الحمض النووي القديم مع الكائنات الحية الحديثة
  • تحديد وجود كائنات دقيقة يصعب استزراعها ، أو غير قابلة للزراعة ، في البشر أو العينات البيئية

PCR هو ملف في المختبر تقنية مخبرية تستفيد من العملية الطبيعية لتكرار الحمض النووي. تُشتق إنزيمات بوليميراز الحمض النووي المستقرة الحرارة المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل من بدائيات النوى شديدة الحرارة. طق DNA بوليميراز، شائع الاستخدام في PCR ، مشتق من ثيرموس أكواتيكوس بكتيريا معزولة من ينبوع ساخن في حديقة يلوستون الوطنية. يتطلب تكرار الحمض النووي استخدام البادئات لبدء النسخ المتماثل للحصول على مجموعات 3ʹ-hydroxyl متاحة لإضافة النيوكليوتيدات بواسطة بوليميريز DNA. ومع ذلك ، في حين أن البادئات المكونة من الحمض النووي الريبي تستخدم عادة في الخلايا ، فإن بادئات الحمض النووي تستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل. يُفضل استخدام بادئات الحمض النووي نظرًا لاستقرارها ، ويمكن تصنيع بادئات الحمض النووي ذات التسلسلات المعروفة التي تستهدف منطقة معينة من الحمض النووي تجاريًا. تشبه هذه البادئات وظيفيًا تحقيقات الحمض النووي المستخدمة لتقنيات التهجين المختلفة الموصوفة سابقًا ، والتي ترتبط بأهداف محددة بسبب التكامل بين تسلسل الحمض النووي المستهدف والتمهيدي.

يحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل عبر دورات متعددة ، كل منها يحتوي على ثلاث خطوات: تمسخ ، تلدين ، وتمديد. تستخدم آلات تسمى cyclers الحرارية في PCR ؛ يمكن برمجة هذه الآلات للدوران تلقائيًا عبر درجات الحرارة المطلوبة في كل خطوة ([رابط]). أولاً ، يتم تغيير طبيعة الحمض النووي للقالب المزدوج الذي تقطعت به السبل والذي يحتوي على التسلسل المستهدف عند 95 درجة مئوية تقريبًا. إن درجة الحرارة العالية المطلوبة لفصل خيوط الحمض النووي ماديًا (وليس إنزيميًا) هي السبب وراء الحاجة إلى بوليميراز الحمض النووي المستقر للحرارة. بعد ذلك ، تنخفض درجة الحرارة إلى حوالي 50 درجة مئوية. هذا يسمح لبادئات الحمض النووي التكميلية لنهايات التسلسل المستهدف أن تصلب (تلتصق) بخيوط القالب ، مع مادة أولية تلدين لكل حبلا. أخيرًا ، يتم رفع درجة الحرارة إلى 72 درجة مئوية ، وهي درجة الحرارة المثلى لنشاط بوليميراز الحمض النووي المستقر للحرارة ، مما يسمح بإضافة النيوكليوتيدات إلى التمهيدي باستخدام الهدف أحادي الجديلة كقالب. تضاعف كل دورة عدد نسخ الحمض النووي المستهدفة مزدوجة الشريطة. عادةً ما تتضمن بروتوكولات PCR 25-40 دورة ، مما يسمح بتضخيم تسلسل هدف واحد بعشرات الملايين إلى أكثر من تريليون.

تم تصميم النسخ المتماثل الطبيعي للحمض النووي لنسخ الجينوم بأكمله ، ويبدأ في واحد أو أكثر من مواقع المنشأ. تُصنع البادئات أثناء النسخ المتماثل ، وليس قبل ذلك ، ولا تتكون من عدد قليل من المتواليات المحددة. يستهدف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مناطق معينة من عينة الحمض النووي باستخدام مواد أولية خاصة بالتسلسل. في السنوات الأخيرة ، تم تطوير مجموعة متنوعة من طرق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المتساوي الحرارة والتي تتجنب الحاجة إلى التدوير الحراري ، مع الاستفادة من البروتينات الإضافية التي تساعد في عملية تكرار الحمض النووي. مع استمرار تطوير هذه الأساليب وانتشار استخدامها على نطاق واسع في المعامل البحثية والطب الشرعي والسريري ، قد تصبح الدراجين الحراريين عفا عليها الزمن.

الشكل ( PageIndex {8} ): يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لإنتاج نسخ عديدة من تسلسل معين من الحمض النووي.

تعميق فهمك لتفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال مشاهدة هذه الرسوم المتحركة والعمل من خلال تمرين تفاعلي.

الاختلافات في PCR

عدة تعديلات لاحقة على PCR تزيد من فائدة هذه التقنية. يستخدم PCR النسخ العكسي (RT-PCR) للحصول على نسخ DNA لجزيء mRNA معين. يبدأ RT-PCR باستخدام إنزيم النسخ العكسي لتحويل جزيئات mRNA إلى cDNA. ثم يتم استخدام هذا (كدنا) كقالب لتضخيم PCR التقليدي. يمكن لـ RT-PCR اكتشاف ما إذا كان قد تم التعبير عن جين معين في عينة. تطبيق آخر حديث لـ PCR هو PCR في الوقت الفعلي ، والمعروف أيضًا باسم PCR الكمي (qPCR). البروتوكولات المعيارية PCR و RT-PCR ليست كمية لأن أيًا من الكواشف قد يصبح مقيدًا قبل اكتمال جميع الدورات داخل البروتوكول ، ويتم تحليل العينات فقط في النهاية. نظرًا لأنه لا يمكن تحديد الوقت الذي يصبح فيه كاشف معين مقيدًا في بروتوكول PCR أو RT-PCR ، فلا يمكن معرفة عدد الدورات التي تم إكمالها قبل هذه النقطة ، وبالتالي لا يمكن تحديد عدد الدورات الأصلية كانت جزيئات القالب موجودة في العينة في بداية PCR. ومع ذلك ، في qPCR ، يسمح استخدام الفلورة للمرء بمراقبة الزيادة في قالب مزدوج تقطعت به السبل أثناء تفاعل PCR عند حدوثه. يمكن بعد ذلك استخدام بيانات الخواص الحركية لتحديد مقدار التسلسل الهدف الأصلي. أدى استخدام qPCR في السنوات الأخيرة إلى توسيع قدرات PCR ، مما يسمح للباحثين بتحديد عدد نسخ الحمض النووي ، وأحيانًا الكائنات الحية الموجودة في العينة. في الإعدادات السريرية ، يتم استخدام qRT-PCR لتحديد الحمل الفيروسي في المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية لتقييم فعالية علاجهم.

تسلسل الحمض النووي

تقنية التسلسل الأساسية هي طريقة إنهاء السلسلة ، والمعروفة أيضًا باسم طريقة dideoxy أو طريقة Sanger DNA المتسلسلة ، التي طورها فريدريك سانجر في عام 1972. تتضمن طريقة إنهاء السلسلة تكرار الحمض النووي لقالب واحد تقطعت به السبل باستخدام تمهيدي DNA لبدء تخليق خيط تكميلي ، بوليميريز الحمض النووي ، مزيج من أربعة مونومرات ديوكسينوكليوتيد (dNTP) ، ونسبة صغيرة من ديديوكسينيوكليوتيدات (ddNTPs) ، كل منها مُسمى بمنارة جزيئية. إن ddNTPs هي مونومرات تفتقد إلى مجموعة هيدروكسيل (–OH) في الموقع الذي يرتبط فيه نوكليوتيد آخر عادةً لتشكيل سلسلة (الشكل ( فهرس الصفحة {9} )). في كل مرة يتم فيها دمج ddNTP بشكل عشوائي في الخيط التكميلي المتنامي ، فإنه ينهي عملية تكرار الحمض النووي لهذا الشريط المعين. ينتج عن هذا خيوط قصيرة متعددة من الحمض النووي المنسوخ والتي يتم إنهاء كل منها عند نقطة مختلفة أثناء النسخ المتماثل. عندما يتعرض خليط التفاعل إلى الرحلان الكهربائي للهلام ، فإن خيوط الدنا المتعددة التي تم نسخها حديثًا تشكل سلمًا بأحجام مختلفة. نظرًا لأنه يتم تمييز ddNTPs ، فإن كل شريط على الجل يعكس حجم حبلا DNA عندما أنهى ddNTP التفاعل.

في أيام سانجر ، تم إعداد أربعة تفاعلات لكل جزيء DNA يتم تسلسله ، كل تفاعل يحتوي على واحد فقط من أربعة ddNTPs الممكنة. تم تصنيف كل ddNTP بجزيء الفوسفور المشع. تم بعد ذلك تشغيل نواتج التفاعلات الأربعة في ممرات منفصلة جنبًا إلى جنب على مواد هلامية طويلة وضيقة ، وتم الكشف عن نطاقات ذات أطوال متفاوتة بواسطة التصوير الشعاعي الذاتي. اليوم ، تم تبسيط هذه العملية باستخدام ddNTPs ، كل منها مُسمى بصبغة فلورية ملونة مختلفة أو فلوروكروم (الشكل ( PageIndex {10} )) ، في تفاعل تسلسلي واحد يحتوي على جميع ddNTPs الأربعة الممكنة لكل جزيء DNA يجري متسلسل (الشكل ( PageIndex {11} )). يتم الكشف عن هذه الفلوركرومات بواسطة التحليل الطيفي الفلوري. يؤدي تحديد لون الفلورة لكل نطاق أثناء مروره بواسطة الكاشف إلى إنتاج تسلسل النوكليوتيدات لشريط القالب.

الشكل ( PageIndex {9} ): يشبه ديديوكسينوكليوتيد في هيكله ديوكسينوكليوتيد ، لكنه يفتقد مجموعة 3ʹ هيدروكسيل (المشار إليها بواسطة الصندوق المظلل). عندما يتم دمج ديديوكسينوكليوتيد في خيط DNA ، يتوقف تخليق الحمض النووي.

الشكل ( PageIndex {10} ): تم توضيح طريقة إنهاء سلسلة dideoxy لفريدريك سانجر ، باستخدام ddNTPs الموسومة بالكرومات الفلورية. باستخدام ddNTPs ، يمكن تكوين مزيج من أجزاء الحمض النووي من كل حجم ممكن ، والتي تختلف في الطول بواسطة نيوكليوتيد واحد فقط. يتم فصل الحمض النووي على أساس الحجم ويمكن اكتشاف كل نطاق باستخدام كاشف التألق.

الشكل ( PageIndex {11} ): يلخص هذا الرسم البياني طريقة التسلسل Sanger باستخدام ddNTPs المسمى بالفلوروكروم والهلام الكهربائي للهلام الشعري.

منذ عام 2005 ، تندرج تقنيات التسلسل الآلي التي تستخدمها المختبرات تحت مظلة الجيل التالي من التسلسل ، وهو عبارة عن مجموعة من التقنيات الآلية المستخدمة لتسلسل الحمض النووي السريع. أحدثت هذه الطرق ثورة في مجال علم الوراثة الجزيئية لأن المتسلسلات منخفضة التكلفة يمكن أن تولد تسلسلات من مئات الآلاف أو ملايين الأجزاء القصيرة (25 إلى 600 زوج أساسي) في يوم واحد فقط. على الرغم من أن العديد من المتغيرات لتقنيات التسلسل من الجيل التالي تصنعها شركات مختلفة (على سبيل المثال ، 454 Life Sciences وتقنية Solexa من Illumina) ، فإنها جميعًا تسمح بتسلسل ملايين القواعد بسرعة ، مما يجعل تسلسل الجينوم بأكمله سهلًا نسبيًا وغير مكلف ، ومألوف. في التسلسل 454 (التسلسل الحراري) ، على سبيل المثال ، يتم تجزئة عينة الحمض النووي إلى شظايا أحادية الخيط 400-600 زوج قاعدي ، مع تعديلها بإضافة محولات DNA إلى طرفي كل جزء. يتم بعد ذلك تجميد كل جزء من الحمض النووي على حبة ويتم تضخيمه بواسطة PCR ، باستخدام مواد أولية مصممة لتصلب المحولات ، مما ينتج عنه حبة تحتوي على العديد من نسخ جزء الحمض النووي هذا. ثم يتم وضع كل حبة في بئر منفصل يحتوي على إنزيمات التسلسل. إلى البئر ، يضاف كل من النيوكليوتيدات الأربعة واحدًا تلو الآخر ؛ عندما يتم دمج كل منها ، يتم إطلاق البيروفوسفات كمنتج ثانوي للبلمرة ، مما ينبعث منه وميض صغير من الضوء يتم تسجيله بواسطة جهاز الكشف. يوفر هذا ترتيب النيوكليوتيدات المدمجة كسلسلة جديدة من الحمض النووي وهي مثال على تسلسل التوليف. تستخدم أجهزة التسلسل من الجيل التالي برامج متطورة لتجاوز العملية المرهقة المتمثلة في ترتيب جميع الأجزاء. بشكل عام ، تستمر هذه التقنيات في التقدم بسرعة ، مما يقلل من تكلفة التسلسل ويزيد من توافر بيانات التسلسل من مجموعة متنوعة من الكائنات الحية بسرعة.

يضم المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية قاعدة بيانات تسلسل جيني مستخدمة على نطاق واسع تسمى GenBankwhere يقوم الباحثون بإيداع المعلومات الجينية للاستخدام العام. عند نشر بيانات التسلسل ، يقوم الباحثون بتحميلها على GenBank ، مما يتيح للباحثين الآخرين الوصول إلى المعلومات. يتيح التعاون للباحثين مقارنة معلومات تسلسل العينة المكتشفة حديثًا أو غير المعروفة مع مجموعة واسعة من بيانات التسلسل الموجودة بالفعل.

شاهد رسمًا متحركًا حول 454 تسلسلًا لتعميق فهمك لهذه الطريقة.

استخدام NAAT لتشخيص أ جيم عدوى

عاد خافيير ، وهو مريض يبلغ من العمر 80 عامًا ولديه تاريخ من أمراض القلب ، إلى المنزل مؤخرًا من المستشفى بعد خضوعه لعملية رأب الوعاء لإدخال دعامة في الشريان القلبي. لتقليل احتمالية الإصابة بالعدوى ، تم إعطاء خافيير مضادات حيوية واسعة الطيف عن طريق الوريد أثناء وبعد إجراءه بفترة وجيزة. تم إطلاق سراحه بعد أربعة أيام من العملية ، ولكن بعد أسبوع ، بدأ يعاني من تقلصات خفيفة في البطن وإسهال مائي عدة مرات في اليوم. فقد شهيته ، وأصيب بجفاف شديد وأصيب بحمى. كما لاحظ وجود دم في البراز. اتصلت زوجة خافيير بالطبيب الذي أمرها بأخذه إلى غرفة الطوارئ على الفور.

أجرى طاقم المستشفى عدة فحوصات ووجدوا أن مستويات الكرياتينين في الكلى لخافيير كانت مرتفعة مقارنة بالمستويات الموجودة في دمه ، مما يشير إلى أن كليتيه لا تعملان بشكل جيد. تشير أعراض جافير إلى احتمال وجود عدوى به المطثية العسيرة، وهي بكتيريا تقاوم العديد من المضادات الحيوية. قام المستشفى بجمع عينة من البراز وزرعها للبحث عن إنتاج السموم A و B C. صعبلكن النتائج جاءت سلبية. ومع ذلك ، فإن النتائج السلبية لم تكن كافية لاستبعاد أ C. صعب العدوى بسبب استزراع C. صعب قد يكون من الصعب اكتشاف سمومها المميزة ، خاصة في بعض أنواع العينات. لكي يكونوا آمنين ، شرعوا في اختبار تضخيم الحمض النووي التشخيصي (NAAT). تُعد NAATs حاليًا المعيار الذهبي للتشخيص السريري للكشف عن المادة الجينية لمسببات الأمراض. في حالة Javier ، تم استخدام qPCR للبحث عن ترميز الجينات C. صعب السم ب (tcdB). عندما جاء تحليل qPCR إيجابيًا ، خلص الطبيب المعالج إلى أن خافيير كان يعاني بالفعل من مرض C. صعب وتوصف على الفور المضاد الحيوي فانكومايسين ، ليتم إعطاؤه عن طريق الوريد. تخلص المضاد الحيوي من العدوى وتعافى خافيير تمامًا.

لأن الالتهابات C. صعب أصبحت منتشرة على نطاق واسع في مجتمع خافيير ، تم تحليل عينته بشكل أكبر لمعرفة ما إذا كانت سلالة معينة من C. صعب يمكن التعرف عليها. خضعت عينة براز جافير للنمذجة الريبية وتحليل PCR (rep-PCR) القائم على التسلسل المتكرر. في التنميط الريبي ، يتم تضخيم تسلسل قصير من الحمض النووي بين جينات 16S rRNA و 23S rRNA وتعريضه لتقييد الهضم (الشكل ( PageIndex {12} )). هذا التسلسل يختلف بين سلالات C. صعب، لذلك ستقطع إنزيمات التقييد في أماكن مختلفة. في rep-PCR ، تم تصميم بادئات الحمض النووي للربط مع التسلسلات القصيرة التي يشيع تكرارها داخل C. صعب تم استخدام الجينوم لـ PCR. بعد هضم التقييد ، تم إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز في كلا النوعين من التحليل لفحص أنماط النطاقات الناتجة عن كل إجراء (الشكل ( فهرس الصفحة {13} )). يمكن استخدام Rep-PCR لمزيد من الأنواع الفرعية للأنماط الريبية المختلفة ، وزيادة الدقة لاكتشاف الاختلافات بين السلالات. تم العثور على النمط الريبي للسلالة التي تصيب خافيير على أنها نوع ريبوتايب 27 ، وهي سلالة معروفة بضراوتها المتزايدة ومقاومتها للمضادات الحيوية وانتشارها المتزايد في الولايات المتحدة وكندا واليابان وأوروبا.1

تمرين ( PageIndex {5} )

  1. كيف تختلف أنماط النطاقات بين سلالات C. صعب?
  2. لماذا تعتقد أن الاختبارات المعملية غير قادرة على الكشف عن إنتاج السموم مباشرة؟

الشكل ( PageIndex {12} ): هلام يظهر منتجات PCR لمختلف سلالات المطثية العسيرة. تظهر عينة جافير في الأسفل ؛ لاحظ أنه يطابق ribotype 27 في مجموعة المراجع. (الائتمان: تعديل العمل من قبل الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة)

الشكل ( PageIndex {13} ): يمكن التعرف على سلالات البكتيريا المعدية ، مثل المطثية العسيرة ، عن طريق التحليل الجزيئي. يستخدم PCR ribotyping بشكل شائع لتحديد سلالات معينة من المطثية العسيرة. Rep-PCR هي تقنية جزيئية بديلة تُستخدم أيضًا لتحديد C. (الائتمان ب: تعديل العمل من قبل الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة)

المفاهيم الأساسية والملخص

  • يتطلب العثور على جين مثير للاهتمام داخل عينة استخدام الجين الذي تقطعت به السبل مسبار الحمض النووي مُصنَّف بمنارة جزيئية (نشاط إشعاعي أو مضان عادةً) يمكنه التهجين بحمض نووي أحادي السلسلة مكمل في العينة.
  • الاغاروز الكهربائي للهلام يسمح بفصل جزيئات الحمض النووي على أساس الحجم.
  • تقييد طول القطعة تعدد الأشكال (RFLP) يسمح التحليل بالتخيل بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز لمتغيرات متميزة لتسلسل الحمض النووي الناجم عن الاختلافات في مواقع التقييد.
  • لطخة جنوبية يسمح التحليل للباحثين بالعثور على تسلسل DNA معين داخل عينة بينما لطخة الشمالية يسمح التحليل للباحثين باكتشاف تسلسل mRNA معين معبرًا عنه في عينة.
  • تقنية ميكروأري هي تقنية تهجين الحمض النووي التي تسمح بفحص عدة آلاف من الجينات في وقت واحد للعثور على الاختلافات في الجينات أو أنماط التعبير الجيني بين عينتين من الحمض النووي الجيني أو cDNA ،
  • بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (PAGE) يسمح بفصل البروتينات حسب الحجم ، خاصةً إذا تم إخفاء شحنات البروتين الأصلي من خلال المعالجة المسبقة بـ SDS.
  • تفاعل البلمرة المتسلسل يسمح بالتضخيم السريع لتسلسل DNA معين. يمكن استخدام الاختلافات في PCR للكشف عن تعبير mRNA (النسخ العكسي PCR) أو لتحديد تسلسل معين في العينة الأصلية (في الوقت الحقيقي PCR).
  • على الرغم من أن تطوير تسلسل سانجر الحمض النووي كان ثوريًا ، والتقدم في تسلسل الجيل القادم تسمح بالتسلسل السريع وغير المكلف لجينومات العديد من الكائنات الحية ، مما يؤدي إلى تسريع حجم بيانات التسلسل الجديد.

متعدد الخيارات

ما هي التقنية المستخدمة لفصل أجزاء البروتين بناءً على الحجم؟

A. بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام
لطخة جنوبية
جيم الاغاروز الكهربائي للهلام
D. تفاعل البلمرة المتسلسل

أ

ما هي التقنية التي تستخدم هضم إنزيم التقييد متبوعًا بالرحلان الكهربي لجيل الاغاروز لتوليد نمط ربط للمقارنة بعينة أخرى تمت معالجتها بنفس الطريقة؟

أ. qPCR
ب- RT-PCR
ج. RFLP
454 تسلسل

ج

تتضمن جميع التقنيات التالية التهجين بين جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة إلا:

أ. تحليل لطخة الجنوب
ب. تحليل RFLP
تحليل اللطخة الشمالية
تحليل ميكروأري

ب

املاء الفراغ

تُستخدم تقنية __________ لطخة للعثور على جزء من الحمض النووي الريبي داخل عينة مكملة لمسبار الحمض النووي.

شمالي

تسمى خطوة PCR التي يصبح خلالها جزيء القالب مزدوج السلسلة أحادي السلسلة _____________.

تمسخ

تسمى طريقة التسلسل التي تتضمن دمج ddNTPs __________.

التسلسل Sanger ، طريقة dideoxy ، أو طريقة إنهاء السلسلة

خطأ صحيح

في الاغاروز الكهربائي للهلام ، سوف ينجذب الحمض النووي إلى القطب السالب.

خاطئة

اجابة قصيرة

لماذا من المهم أن يتم تمييز مسبار الحمض النووي بمنارة جزيئية؟

عند فصل البروتينات بدقة حسب الحجم ، لماذا يلزم أولاً التعرض لـ SDS؟

لماذا يجب أن يكون بوليميريز الحمض النووي المستخدم أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل مستقرًا للحرارة؟

التفكير النقدي

لنفترض أنك تعمل في مختبر بيولوجيا جزيئية وتواجه صعوبة في أداء اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل بنجاح. قررت التحقق مرة أخرى من بروتوكول PCR المبرمج في جهاز التدوير الحراري واكتشاف أن درجة حرارة التلدين تمت برمجتها لتكون 65 درجة مئوية بدلاً من 50 درجة مئوية ، كما كنت تنوي. ما هي آثار هذا الخطأ على تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل؟ الرجوع إلى الشكل.

ما هي ميزة تحليل ميكروأري على تحليل لطخة شمالية في مراقبة التغيرات في التعبير الجيني؟

ما هو الفرق بين PCR (RT-PCR) و PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR)؟

الحواشي

  1. 1 باتريسيا سبيجاليا ، فابريزيو باربانتي ، آنا ماريا ديونيسي ، وباولا ماسترانتونيو. "المطثية العسيرة عزلات مقاومة للفلوروكينولونات في إيطاليا: ظهور النمط الريبي PCR 018. " مجلة علم الأحياء الدقيقة السريرية 48 لا. 8 (2010): 2892 - 2896.

مساهم

  • نينا باركر (جامعة شيناندواه) ومارك شنيغورت (جامعة ولاية ويتشيتا) وآنه-هيو ثي تو (جامعة ولاية جورجيا الجنوبية الغربية) وفيليب ليستر (كلية وسط نيو مكسيكو المجتمعية) وبريان إم فورستر (جامعة سانت جوزيف) مع العديد المؤلفين المساهمين. المحتوى الأصلي عبر Openstax (CC BY 4.0 ؛ الوصول مجانًا على https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


10.2: تصور وتمييز الحمض النووي - علم الأحياء

تتيح لنا التطورات المنهجية الحديثة دراسة هياكل G-quadruplex بدقة أعلى وإنتاجية.

تم تمييز طرق استخدام هياكل G-quadruplex كأدوات جزيئية.

تتم مراجعة الطرق الحسابية والتجريبية لدراسات G-quadruplex.

تقدم الأعمال التي تمت مراجعتها هنا رؤى فريدة لاستكشاف الأدوار البيولوجية واستخدامات G-quadruplexes في البحث الأساسي والتطبيقي.

يمكن أن تتجمع المتواليات الغنية بجوانين (G) في الأحماض النووية في هياكل G-quadruplex التي تتضمن G-quartets المرتبطة بالنيوكليوتيدات الحلقية. اجتذب التنوع الهيكلي والطوبولوجي في G-quadruplexes اهتمامًا كبيرًا لعقود. أدت التطورات المنهجية الحديثة إلى تقدم في تحديد وتوصيف G-quadruplexes في الجسم الحي إلى جانب في المختبر، وبدقة وإنتاجية أعلى بكثير ، مما وسع بشكل كبير فهمنا الحالي لبنية G-quadruplex ووظيفتها. ساعد تراكم المعرفة حول الخصائص الهيكلية لـ G-quadruplexes في تصميم وتطوير مجموعة من الأدوات الجزيئية والكيميائية للتطبيقات البيولوجية. تسلط هذه المراجعة الضوء على كيف فتحت هذه الأساليب والنتائج المثيرة أبوابًا جديدة للتحقيق في الوظائف والتطبيقات المحتملة لـ G-quadruplexes في العلوم الحيوية الأساسية والتطبيقية.


تميز الأوراق التي تم الاستشهاد بها بكثرة في قياس الكتلة الخلوية من خلال كلاسيكيات H

أجرى المؤلفون هنا تحليلات bibiloimetric على منشورات قياس الكتلة الخلوية من عام 2010 إلى عام 2019. يعد قياس الكتلة الخلوية حقًا تقنية مهمة للتنميط الظاهري العميق لجهاز المناعة وقد وصفت المخطوطة هذه الأهمية جيدًا.

لا يمكنني التعليق على الأساليب المستخدمة في هذه المخطوطة لأنني لست على دراية بأساليب التحليل الببليومتري. المخطوطة مكتوبة بشكل جيد ، والأساس المنطقي واضح. أعتقد أن هذه المخطوطة ستكون موضع اهتمام قراء علم الأحياء.

نشكر المراجع على التعليقات الإيجابية والمشجعة للغاية على عملنا. تم إجراء تعديلات طفيفة على المخطوطة لتلائم توصيات المحرر والمراجعين الآخرين.

تم تحميل البيانات من WOS ومعالجتها في R. يجب توفير البيانات ورمز R الذي تم تطويره لهذا التحليل مع ارتباط إلى مستودع ثابت (أي DOI الذي توفره المؤسسة ، Zenodo ، إلخ). هذا سيفيد بشكل كبير المقال والمجتمع العلمي.

الشكل 1 ، يجب على المؤلفين التفكير في زيادة حجم الخط لتسهيل قراءة النص.

يوضح نص وصف الشكل 2 والشكل 2 متوسط ​​الاستشهادات سنويًا لمراكز الرعاية الصحية في مجال قياس الكتلة الخلوية ، مما يشير إلى الوصول إلى أعلى ذروة في عام 2019 مع 208 استشهادات ، بعد اتجاه صاعد & rdquo قد يقرأ بشكل أفضل & ldquo يوضح الشكل 2 متوسط ​​الاستشهادات سنويًا من HCPs في مجال قياس الكتلة الخلوية ، ظلت ثابتة إلى حد ما بين عامي 2010 و 2018 ، قبل أن تشهد زيادة حادة إلى 208 في عام 2019. & rdquo

إذا تم استخدام مؤشر H لترتيب المؤلفين في الجدول 3 ، فيجب أن يحتل المؤلف الذي يحتوي على 5 مقالات ومؤشر H المرتبة رقم 8. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أيضًا تصنيف البيانات الواردة في الجدول 3 باستخدام المساهمين الأساسيين (على سبيل المثال من الأعلى إلى الأقل للمؤلفين الذين لديهم نفس مؤشر H).

يجب على المؤلفين التفكير في إضافة وسيلة إيضاح إلى الشكل 3 لحجم الدوائر وترميزها اللوني.

النص & ldquo لتحليل تكرار الكلمات الرئيسية المرتبطة & rdquo يجب قراءة & ldquo لتحليل تكرار الكلمات الرئيسية المرتبطة & rdquo

يتداخل النص في الشكل 4 والشكل 5. يجب أن يشير المؤلفون أيضًا إلى كيفية إنشاء هذه الأرقام. هناك طريقة بديلة لإنشاء مثل هذه الأرقام باستخدام Gephi (المصدر المفتوح) المتوافق مع تصدير البيانات من R.

نشكر المراجع على النظر في مخطوطتنا وتقديم ملاحظات بناءة. لقد تناولنا كل التعليقات التي أثيرت نقطة تلو الأخرى وقمنا بإنشاء نسخة منقحة من مخطوطتنا بعنوان "تمييز الأوراق التي تم الاستشهاد بها بشدة في قياس الكتلة الخلوية من خلال H-Classics" ، مع إبراز الأقسام المعدلة باستخدام وظيفة & ldquoTrack Changes "في Microsoft Word. نعتقد أن ساهمت التعليقات في تحسين جودة مخطوطاتنا.

  1. تم تحميل البيانات من WOS ومعالجتها في R. يجب توفير البيانات ورمز R الذي تم تطويره لهذا التحليل مع ارتباط إلى مستودع ثابت (أي DOI الذي توفره المؤسسة ، Zenodo ، إلخ). هذا سيفيد بشكل كبير المقال والمجتمع العلمي.

إجابة: شكرا لك على تعليقك. لم يتم تضمين رمز R لأنه لم يتم تطوير رمز محدد أو الوصول إليه يدويًا لهذا العمل. استخدم المؤلفون واجهة Biblioshiny الرسومية لتمثيل المعلومات التي تم الحصول عليها باستخدام bibliometrix. تم توضيح هذه المعلومات في قسم المواد والأساليب (2.3. Bibliometrix. Science Mapping Analysis ، صفحة 4). لقد قمنا أيضًا بتضمين وصف معلمات الشبكة والمعلمات الرسومية الممثلة في الشكلين 4 و 5 (الصفحات 13-16) لهياكل المعرفة (الفكرية والمفاهيمية) ، بحيث يمكن استنساخها بسهولة بواسطة باحثين آخرين.

بعد توصيتك ، قمنا بتضمين مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها من WoS ، ومجموعة البيانات التي تحتوي على كلاسيكيات H وتقرير الاقتباس في مستودع Zenodo ، في حالة ما إذا كان من الضروري للمؤلفين الآخرين إعادة إنتاج التحليل أو توسيعه. تمت الإشارة إلى مستودع Zenodo بما في ذلك DOI الخاص به في & ldquo2.1. قاعدة البيانات الببليوغرافية وتصميم الاستعلام وقسم rdquo (الصفحة 3).

  1. الشكل 1 ، يجب على المؤلفين التفكير في زيادة حجم الخط لتسهيل قراءة النص.

إجابة: شكرا لك على تعليقك. تم تعديل الشكل 1 وفقًا لاقتراحات المراجع المقترحة. تم توسيع حجم النص الأساسي للمحاور ووسيلة الإيضاح والتسميات. من أجل تحسين تصور البيانات ، تم أيضًا تعديل ألوان الخط والتباعد وسمك كل عمود.

  1. يوضح نص وصف الشكل 2 والشكل 2 متوسط ​​الاستشهادات سنويًا لمراكز الرعاية الصحية في مجال قياس الكتلة الخلوية ، مما يشير إلى الوصول إلى أعلى ذروة في عام 2019 مع 208 استشهادات ، بعد اتجاه صاعد & rdquo قد يقرأ بشكل أفضل & ldquo يوضح الشكل 2 متوسط ​​الاستشهادات سنويًا من HCPs في مجال قياس الكتلة الخلوية ، ظلت ثابتة إلى حد ما بين عامي 2010 و 2018 ، قبل أن تشهد زيادة حادة إلى 208 في عام 2019. & rdquo

إجابة: شكرا لك على تعليقك. تم تعديل نص الوصف في الشكل 2 وفقًا لاقتراحات المراجع المقترحة.

  1. إذا تم استخدام مؤشر H لترتيب المؤلفين في الجدول 3 ، فيجب أن يحتل المؤلف الذي يحتوي على 5 مقالات ومؤشر H المرتبة رقم 8. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أيضًا تصنيف البيانات الواردة في الجدول 3 باستخدام المساهمين الأساسيين(على سبيل المثال من الأعلى إلى الأقل للمؤلفين الذين لديهم نفس مؤشر H).

إجابة: شكرا لك على تعليقك. لقد قمنا بتصحيح موقف المؤلف الذي يشغل الآن المرتبة رقم 8 في الجدول 3 ، وبالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتصنيف المؤلفين الذين لديهم نفس مؤشر H وفقًا للمساهمين الأساسيين ، كما هو مقترح.

  1. يجب على المؤلفين التفكير في إضافة وسيلة إيضاح إلى الشكل 3 لحجم الدوائر وترميزها اللوني.

إجابة: شكرا لك على هذا التعليق. أعاد المؤلفون كتابة وسيلة إيضاح الشكل 3 ، موضحين رموز الألوان للدوائر والخطوط.

  1. النص & ldquo لتحليل تكرار الكلمات الرئيسية المرتبطة & rdquo يجب قراءة & ldquo لتحليل تكرار الكلمات الرئيسية المرتبطة & rdquo

إجابة: شكرا لك على هذا التعليق. تم استبدال النص الذي أشار إليه المراجع بالاقتراح.

  1. يتداخل النص في الشكل 4 والشكل 5. يجب أن يشير المؤلفون أيضًا إلى كيفية إنشاء هذه الأرقام. هناك طريقة بديلة لإنشاء مثل هذه الأرقام باستخدام Gephi (المصدر المفتوح) المتوافق مع تصدير البيانات من R.

إجابة: شكرا لك على هذا التعليق. لقد أعدنا تصميم الشكلين 4 و 5 باستخدام واجهة الويب Biblioshiny لتصحيح تداخل المصطلحات والأسماء.

أهنئ مؤلفي الورقة ، أجدها ممتعة للغاية. يعد قياس الكتلة الخلوية تقنية جديدة ومثل هذه الورقة ، لأولئك القراء الذين يرغبون في التعرف على الأوراق البحثية التي يتم الاستشهاد بها في الغالب من هذا المجال. أوصي حقًا بطباعة الورق في نسخته الحالية.

يشكر المؤلفون المراجع على التعليقات الإيجابية والمشجعة على مخطوطتنا. تم إجراء تعديلات طفيفة على المخطوطة لتلائم توصيات المراجعين الآخرين.


توصيف التفاعل بين الحمض النووي وصمة عار الفلوريسنت الأحمر

لقد أجرينا تجارب تمدد جزيء واحد وتشتت ضوء ديناميكي (DLS) لتوصيف التفاعل بين جزيء DNA وصمة عار الفلورسنت GelRed. تظهر النتائج من التمدد أحادي الجزيء أن طول ثبات معقدات DNA-GelRed يزداد كلما زاد تركيز اللجند حتى يصل إلى تركيز حرج ، ثم ينخفض ​​لتركيزات أعلى. من ناحية أخرى ، يزيد طول كفاف المجمعات بشكل رتيب كدالة لتركيز GelRed ، مما يشير إلى أن الإقحام هو آلية الربط الرئيسية. لتوصيف الكيمياء الفيزيائية للتفاعل ، استخدمنا متساوي حرارة ربط McGhee-von Hippel لاستخراج البيانات الفيزيائية والكيميائية للتفاعل من بيانات طول الكنتور. مكننا هذا التحليل من استنتاج أن صبغة GelRed هي في الواقع أداة تقطيع ثنائية. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تجارب DLS لدراسة التغيرات في الحجم الفعال لمجمعات DNA-GelRed ، والتي تم قياسها على أنها نصف القطر الهيدروديناميكي ، كدالة لتركيز الترابط. لاحظنا التوافق النوعي بين النتائج التي تم الحصول عليها من التقنيتين من خلال مقارنة سلوك نصف قطر الديناميكا المائية ونصف قطر الدوران ، لأنه يمكن التعبير عن الكمية الأخيرة كدالة للخصائص الميكانيكية المحددة من تجارب التمدد.

هذه معاينة لمحتوى الاشتراك ، والوصول عبر مؤسستك.


10.2: تصور وتمييز الحمض النووي - علم الأحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يجوز إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


البيانات الموسعة الشكل. 1 مخطط توليف وتوصيفات RSDTPs.

أ، الهياكل وتسلسل قليل النوكليوتيد لـ 17-pN و 45-pN و 56-pN RSDTPs. ب، مخططات كيميائية مفصلة لتوليف RSDTPs. ج، تم تعديل آثار HPLC التمثيلية لخيط الحمض النووي I بصبغة Cy3B (يُشار إليها بإطار مستطيل متقطع.) (د) تحليل منتجات الفحص بنسبة 10٪ تغيير طبيعة الرحلان الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد ، الممر 1: حبلا I-Cy3B lane 2: strand I-Cy3B-c (RGDfK) lane 3: DNA طويل جدًا أحادي الجديلة (elssDNA ، مبرز بواسطة a سهم أسود). لاحظ أن النطاق الأضعف أعلاه عبارة عن معقد يتكون من كمية صغيرة من elssDNA وخيط القالب. تمثل الصورة ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة على الأقل. ه، أطياف كتلة التأين electrospray الممثل من elssDNA.

بيانات موسعة الشكل. 2 مخططات تخطيطية لتكوين مجسات شد دبوس الشعر للمعايرة والطريقة التجريبية لتجارب الملقاط المغناطيسية أحادية الجزيء.

أ، هندسة وتكوين مجسات القوة المستخدمة في المعايرة. تم ربط جميع المجسات ، جنبًا إلى جنب مع حبلا تكميليًا (أزرق) عند نهايتها الثالثة ، بمقبض dsDNA المعدل للبيوتين. بالنسبة للمسبار 56-pN ، يتم استخدام التسلسل المحدد بواسطة مستطيل فقط لتمديد طول المسبار بالكامل دون التأثير بشكل كبير على الخواص الميكانيكية. ب، رسم تخطيطي لتجارب الملقط المغناطيسي أحادي الجزيء. يتم تثبيت المجسات على السطح الزجاجي المطلي بالستربتافيدين من خلال مقابض الحمض النووي الخاصة بهم. لفتح المسبار ، تم تطبيق قوى سحب على حبة مغناطيسية مغلفة بالستربتافيدين بواسطة مغناطيس دائم. ج، قياسات الثبات الميكانيكي لمسبار DNA القص القابل للانعكاس 56 pN. أظهرت النتائج أن المسبار 56-pN لا ينفتح حتى لو تعرض المسبار لمستوى أقل من القوى (30-44 pN) لأكثر من 10 دقائق ، ولا يُلاحظ حدث الانكشاف إلا عند زيادة القوة المطبقة فوق 50 pN و استمرت لأكثر من عشر ثوان.

بيانات موسعة الشكل. 3 توصيف إعداد الأسطح الوظيفية لـ AuNPs و RSDTPs.

أ-ب، صور تمثيلية لـ TEM لـ AuNPs (أ) وملفات تعريف توزيع الحجم المقابل (ب). ج، أطياف UV-VIS من 5 نانومتر AuNPs. د، إجراءات متدرجة لإعداد الأسطح الوظيفية RSDTPs (انظر الطرق عبر الإنترنت). ه، تظهر صورة AFM التمثيلية التوزيع المكاني لـ AuNPs المجمدة على غطاء زجاجي.

البيانات الموسعة الشكل 4 تحديد كثافة مسبار الحمض النووي على سطح الجسيمات النانوية في الاتحاد الأفريقي.

لمعايرة الكثافة السطحية لمستشعر توتر الحمض النووي ، استخدمنا الطريقة التي وصفها Wang و Ha et al. 23 لرسم العلاقة بين وحدات التدرج الرمادي الفلورية للعينة (متوسط ​​الشدة) وكثافة مسبار الحمض النووي. أولاً ، قمنا باحتضان المحاليل المائية التي تحتوي على 25 نانومتر ، و 12.5 نانومتر ، و 6.25 نانومتر Cy3B- مسبار الحمض النووي غير المطوي (مسبار دبوس الشعر مخلوط بالحمض النووي المتصلب مع حبلا تكميليًا ، تم عرض الهيكل في أ) على الأغطية المعدلة لـ AuNPs لمدة 30 دقيقة ، ثم غسل المجسات غير الملزمة وقياس متوسط ​​شدة التألق للزجاج كدالة لحفل الحضانة لمسبار DNA Cy3B غير المطوي (ب). هناك علاقة خطية بين متوسط ​​كثافة التألق للسطح وتركيز حضانة الحمض النووي ضمن نطاق التركيز هذا (ج). من خلال الاستقراء ، يجب أن يتوافق احتضان مسبار DNA غير المطوي Cy3B 0.05 نانومتر على السطح مع متوسط ​​كثافة التألق 14.4. وجدنا أيضًا كثافة جزيئية تبلغ 0.149 جزيء / ميكرومتر 2 على السطح (0.05 نانومتر) باستخدام صورة TIRF أحادية الجزيء (ب). مجتمعة ، فإن 96.6 وحدة في متوسط ​​شدة التألق على سطح مجس الحمض النووي غير المطوي Cy3B يعادل جزيء واحد / ميكرومتر 2. بالنظر إلى أن متوسط ​​QE لمسبار DNA المطوي Cy3B هو 98.3٪ (الشكل 1 في النص الرئيسي) ، فإن 1.6 وحدة تعني شدة التألق على السطح المطلي RSDTP-Cy3B يجب أن تكون مكافئة لجزيء واحد / ميكرومتر 2. يمكننا أيضًا رسم منحنى معايرة بين الكثافة والكثافة الجزيئية للسطح المطلي RSDTP (Cy3B) ، كما هو موضح في د. يتيح لنا منحنى المعايرة هذا تحديد كثافة السطح RSDTP (Cy3B) عن طريق قياس متوسط ​​شدة الغطاء. على سبيل المثال ، قدرت الكثافة الجزيئية للسطح المطلي بـ 45 pN RSDTP بـ 671 جزيء / ميكرومتر 2 (ه).

البيانات الموسعة الشكل 5 تحديد كفاءة التبريد الفلوري (QE) من RSDTPs على ساترة.

أ، تقدير المسافة بين سطح AuNP وفلوروفورز على RSDTPs تتكشف ميكانيكيًا مع قوى تمزق مختلفة بافتراض طول محيط يبلغ 0.44 نانومتر لكل nt. ب، قطع كفاءة التبريد كدالة للمسافة من الفلوروفور إلى AuNPs بأقطار 5 نانومتر و 10 نانومتر بناءً على نموذج NSET (الملاحظة التكميلية 2). أشارت نتائج محاكاة المسافة بكفاءة التبريد (QE) إلى أن تأثير 5 نانومتر AuNP على فلوروفور Cy3B بعد مسافة 20 نانومتر لا يكاد يذكر. ج ، رسم تخطيطي لقياس كفاءة التبريد بالفلورة لـ RSDTPs على سطح صلب. لتقليد الحالات المطوية وغير المطوية الخاصة بـ RSDTPs المختلفة ، نقوم بتهجين خيوط الحمض النووي التكميلية (المسخنة مسبقًا إلى 95 درجة مئوية) بطول مختلف لمسبار دبوس الشعر المخلوط (التسلسلات الموضحة في ه). يتم حساب قيم التيسير الكمي عن طريق قياس شدة التألق قبل وبعد إضافة السلاسل التكميلية. د، مثال على قياس التيسير الكمي. تم حساب قيمة QE لـ 17-pN RSDTP على أنها 97.3٪ عن طريق قياس ضوضاء القراءة لـ EMCCD ، شدة التألق السطحي قبل وبعد إضافة السلاسل التكميلية. ه، جدول يسرد تسلسل الحمض النووي المستخدم في هذا الاختبار.

البيانات الموسعة الشكل 6 أكدت تجارب التحكم موثوقية وعكس مجسات التوتر.

أ، مقارنة صور مدينة دبي للإنترنت للخلايا المطلية بأجهزة استشعار مع وبدون ببتيد RGD. لم يتم العثور على أي ارتباط بالخلية على السطح المغطى بأجهزة استشعار تفتقر إلى ببتيد RGD ، مما يشير إلى أن إشارة التوتر يتم إنشاؤها بشكل خاص من خلال تفاعلات RGD-expedin. ب، صور تمثيلية لمدينة دبي للإنترنت لخلايا المعاهد الوطنية للصحة 3T3 المصنفة على مجسات التوتر والأغطية المغلفة بالفيبرونيكتين في نقاط زمنية مختلفة. ج، تم استخدام A 45-pN RSDTP الذي يفتقر إلى quencher oligonucleotide لمزيد من التحقق من استقرار وعكس مجسات التوتر. تُظهر الصور أن الخلفية الفلورية للسطح الذي يفتقر إلى إخماد قليل النوكليوتيد أعلى بثلاث مرات من السطح الذي يحتوي على الحمض النووي المهدئ. على الرغم من الخلفية الفلورية العالية لهذه الأسطح ، لا يزال بإمكاننا اكتشاف إشارة توتر أثناء انتشار الخلية على هذه الأسطح ، لأن Au NP يلعب دور إخماد ثاني هنا. بعد معالجة الخلايا بـ Cyto D ، وجدنا أن إشارات التوتر اختفت على الفور ولم تترك أي سمات مظلمة ، والتي غالبًا ما تُستخدم لتحديد استقرار مجسات التوتر على السطح 18. يتم أيضًا عرض ملفات تعريف التألق على طول الخطوط الصفراء في الصور في اللوحة اليمنى.

البيانات الموسعة الشكل 7 مزيد من التأكيد على تدرج القوة داخل FA والعلاقة بين طول عمر FA والنقاط الساخنة ميكانيكيًا.

أ، الممثل 17-pN (Atto647N) ، 56-pN (Cy3B) وصور تراكب التوتر لخلايا NIH / 3T3 واحدة تم اختيارها من 2 مكررات مستقلة تنتشر على ساترة مشفرة باستخدام RSDTPs متعددة الإرسال. ب، صورة توتر تمثيلية 56-pN جنبًا إلى جنب مع GFP-paxillin لخلية 3T3 تم اختيارها من 4 مكررات مستقلة. تمت تغطية محيط GFP-paxillin بإشارة توتر. ج، صور بتقنية الفاصل الزمني مكبرة من المنطقة ذات المربعات الصفراء بتنسيق ب تظهر هياكل التصاق تحمل قوى ضعيفة تخضع لعملية تفكيك سريعة. دوطول عمر التصاقات الضعيفة والقوية. يمثل المربع النسب المئوية الخامسة والعشرون والخامسة والسبعون ، ويشار إلى الوسيط بالخط الأفقي الأوسط مع تسمية متوسط ​​القيمة أعلى كل مربع وتمثل الشعيرات 1.5 ضعف النطاق الربيعي. n = 49 للالتصاقات الضعيفة (الهياكل بدون إشارة 56-pN) و n = 34 للالتصاقات القوية (الهياكل تحتوي على إشارة 56-pN) في الخلية من ب. ذيلان ، طالب ر- تم استخدام الاختبار لقياس الدلالة الإحصائية ص- يتم عرض القيم على الرسم البياني.

البيانات الموسعة الشكل 8 اختبار موثوقية RSDTPs القابلة للتلف ضوئيًا.

أ، RICM التمثيلية وصور التوتر قبل وبعد إضاءة الأشعة فوق البنفسجية (الوقت = 30 ثانية ، يعمل ضوء الأشعة فوق البنفسجية بإضاءة دورية ، كثافة الطاقة = 1.3 × 10 -4 μW / ميكرومتر 2) لبذر الخلايا على أسطح مختلفة مطلية بـ RSDTPs. بعد انقسام حلقة المجسات ، أظهرت الخلية انكماشًا سريعًا على RSDTP 17-pN القابل للكسر الضوئي وتقلصًا بطيئًا على RSDTP 56-pN القابل للكسر الضوئي ، واقترح أن RSDTP قد تم تحويله إلى مسبار يشبه TGT. كانت الصور ممثلة على الأقل 2 مكررات مستقلة. ب، ديناميكيات FA لخلايا GFP-Paxillin التي تعبر عن خلايا 3T3 المصنفة على 56-pN RSDTP و 56-pN TGT و 56-pN سطح مطلي بـ RSDTP القابل للكسر ضوئيًا استجابة لإضاءة الأشعة فوق البنفسجية. نفس حالة الإضاءة كما في أ تم استخدامها هنا. لم يلاحظ أي تأثير معنوي على الخلايا المصنفة على 56 pN RSDTPs والأسطح المطلية بمسبار 56 pN TGT. كانت الصور ممثلة لما لا يقل عن 3 مكررات مستقلة.

بيانات موسعة الشكل. 9 صور لقوة الإنتجرين المستقل عن الميوسين.

أ، صور التوتر لخلايا بليبيستاتين المعالجة مسبقًا تلتصق بـ RSDTPs بقوى تمزق مختلفة. تمت معالجة خلايا NIH 3T3 مسبقًا بـ 10 ميكرومتر من البليبيستاتين لمدة 30 دقيقة ثم تم زرعها على أغطية الأغطية. كانت الصور ممثلة 3 مكررات مستقلة. ب، صور التوتر التمثيلية 45-pN لخلية NIH 3T3 المعالجة مسبقًا Y-27632 المختارة من مكررين مستقلين قبل وبعد إضافة Cytochalasin D. ج، التوطين المشترك لإشارة شد الإنتجرين مع GFP-Paxillin و GFP-Actin في 3T3 الخلايا المعالجة بـ Y27632 على السطح المطلي بـ 45 pN RSDTP. تم عرض صور RICM (رمادي) ، GFP (أخضر) ، التوتر (أحمر) وقنوات التراكب. تُظهر مؤامرة تحليل المسح الخطي للمنطقة المميزة بأسهم بيضاء متقطعة في صور التراكب التوطين المشترك للتوتر مع GFP-paxillin و GFP-actin. كانت الصور ممثلة 3 مكررات مستقلة. د، صور التوتر التمثيلية 33-pN لخلية NIH 3T3 المعالجة مسبقًا Y-27632 المختارة من 3 مكررات بيولوجية مستقلة قبل وبعد إضافة 100 ملي سكروز. تُظهر اللوحة اليمنى تغيير إشارة شد الحافة الرقيقة قبل وبعد العلاج بفرط التوتر ، n = 9 خلايا.

البيانات الموسعة الشكل. 10 عد الوحدات الفرعية أحادية الجزيء للإنتجرينات الحاملة للقوة عند الحواف الرقيقة لخلايا NIH 3T3 المُعالجة مسبقًا Y27632.

أ، يسار ، صورة توتر تمثيلية (45-pN RSDTP) لخلية حية واحدة تمت معالجتها بـ Y27632 تُظهر نقاط الفلورسنت النقطية. على اليمين ، آثار شدة تمثيلية ، في ظل الإثارة المستمرة الكافية للتسبب في تبيض الفلوروفور ، من أربع مجموعات يُشار إليها بالسهام الصفراء في صورة التوتر. أدناه ، الرسم البياني وملاءمة gaussian لشدة الأسفار لخطوات التبييض في الآثار (ن = 39 خطوة من الخلية 1). ب، تم إجراء بيانات إضافية على خليتين ثابتتين ، وتم الحصول على نتائج مماثلة. (n = 38 خطوة للخلية 2 n = 36 خطوة للخلية 3).


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


10.2: تصور وتمييز الحمض النووي - علم الأحياء

يتم توفير جميع المقالات المنشورة بواسطة MDPI على الفور في جميع أنحاء العالم بموجب ترخيص وصول مفتوح. لا يلزم الحصول على إذن خاص لإعادة استخدام كل أو جزء من المقالة المنشورة بواسطة MDPI ، بما في ذلك الأشكال والجداول. بالنسبة للمقالات المنشورة بموجب ترخيص Creative Common CC BY ذي الوصول المفتوح ، يجوز إعادة استخدام أي جزء من المقالة دون إذن بشرط الاستشهاد بالمقال الأصلي بوضوح.

تمثل الأوراق الرئيسية أكثر الأبحاث تقدمًا مع إمكانات كبيرة للتأثير الكبير في هذا المجال. يتم تقديم الأوراق الرئيسية بناءً على دعوة فردية أو توصية من المحررين العلميين وتخضع لمراجعة الأقران قبل النشر.

يمكن أن تكون ورقة الميزات إما مقالة بحثية أصلية ، أو دراسة بحثية جديدة جوهرية غالبًا ما تتضمن العديد من التقنيات أو المناهج ، أو ورقة مراجعة شاملة مع تحديثات موجزة ودقيقة عن آخر التقدم في المجال الذي يراجع بشكل منهجي التطورات الأكثر إثارة في العلم. المؤلفات. يوفر هذا النوع من الأوراق نظرة عامة على الاتجاهات المستقبلية للبحث أو التطبيقات الممكنة.

تستند مقالات اختيار المحرر على توصيات المحررين العلميين لمجلات MDPI من جميع أنحاء العالم. يختار المحررون عددًا صغيرًا من المقالات المنشورة مؤخرًا في المجلة ويعتقدون أنها ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص للمؤلفين أو مهمة في هذا المجال. الهدف هو تقديم لمحة سريعة عن بعض الأعمال الأكثر إثارة المنشورة في مجالات البحث المختلفة بالمجلة.


جاكلين بارلو

يتطلب الانقسام الدقيق للخلية تكرارًا كاملاً للحمض النووي النووي ، مما يوفر للخلية الوليدة نسخة دقيقة من المعلومات الجينومية المشفرة. من أجل التكرار الصادق ، يجب تنسيق مراحل التكرار من البدء والاستطالة والإنهاء لنسخ الحمض النووي مرة واحدة ومرة ​​واحدة فقط لكل دورة خلية. يجب أن يحتفظ النسخ المتماثل المخلص أيضًا بالمكونات اللاجينية عالية المستوى للكروماتين التي تمنح تنظيم النسخ والتنظيم ثلاثي الأبعاد وهوية الخلية.

يمكن أن ينشأ تلف الحمض النووي نتيجة الإجهاد المتكرر ، وهي ظاهرة تشمل مجموعة واسعة من الظروف التي تؤدي إلى توقف شوكة النسخ المتماثل أو انهيارها. يمكن أن تؤدي العيوب في النسخ المتماثل إلى تلف الحمض النووي ويمكن أن يؤدي الإصلاح غير المناسب إلى حدوث طفرات وراثية - بما في ذلك الطفرات النقطية أو أحداث الحذف أو الازدواجية أو عمليات نقل الكروموسومات - وكلها سمات مميزة للسرطان. يبدأ تكاثر الحمض النووي بالارتباط المنسق بين أكثر من 100 بروتين على الحمض النووي في نقاط البداية - تسمى الأصول - في عشرات الآلاف من المواقع الجينومية المتميزة في الثدييات. ينتج عن انهيار شوكة النسخ المتماثل كسر مزدوج (DSB) في الحمض النووي ، والذي يتطلب بروتينات تشارك في إعادة التركيب المتماثل (HR) لإصلاح الآفة وإعادة تشغيل الشوكة اللاحقة. من خلال فحص توظيف بروتين الموارد البشرية باستخدام الترسيب المناعي للكروماتين متبوعًا بالتسلسل عالي الإنتاجية (ChIP-Seq) ، حددنا المواقع الجينية المرتبطة بتكرار الحمض النووي وعوامل الإصلاح استجابةً لتكرار هيدروكسي يوريا السامة (HU) ، ووصفنا هذه المناطق بالتكرار المبكر. المواقع الهشة أو ERFS.

يستخدم مختبر بارلو مزيجًا من البيولوجيا الجزيئية والفحص المجهري وتقنيات التسلسل على مستوى الجينوم للتحقيق في العوامل الجزيئية والوراثية التي تؤهب لتلف الحمض النووي للخلايا المتكاثرة وعدم استقرار الجينوم باستخدام نظام مناعة الفأر كنموذجنا. يمكن أن يكون للخلايا اللمفاوية البائية المنشطة وقت مضاعف يصل إلى 8 ساعات ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا سريعة الانتشار معرضة بشكل خاص للإجهاد التكاثري ، وقد تساهم في تكون اللمفاويات.

الانتماءات مجموعة Grad

  • الكيمياء الحيوية ، علم الأحياء الجزيئي والخلوي والتنموي
  • علم الوراثة التكاملي وعلم الجينوم

التخصصات / التركيز

  • بيولوجيا السرطان
  • بيولوجيا الكروموسوم
  • ديناميات الكروموسوم والوظيفة النووية
  • علم الأحياء الحسابي
  • إصلاح الحمض النووي
  • علم الوراثة
  • علم الوراثة النموذجي للكائن الحي
  • علم الوراثة الجزيئية

الدورات

الأوسمة والجوائز

  • 2008 صمويل دبليو روفر وجائزة لويس روفر لعلم الوراثة والتنمية ، جامعة كولومبيا
  • 2013 جائزة زمالة NIH للتميز البحثي
  • 2014 جائزة المعاهد الوطنية للتطوير المهني الصحي

درجات

  • 2000 بكالوريوس الأحياء جامعة رايس
  • 2008 دكتوراه في علم الوراثة والتنمية جامعة كولومبيا

المنشورات

Waisertreiger I و Popovich K و Block M و Anderson KR و Barlow JH. يكشف تصور التبادل الكروماتيد الشقيق الخاص بالموقع عن أنماط تفاضلية لكسر الموقع الهش الناجم عن الإجهاد الناتج عن الإجهاد. الأورام. 39 (6): 1260-1272. 2020.

Lopes-Contreras ، AJ ، Specks ، J. ، Barlow ، JH ، Ambrogio ، C. ، Desler ، C. ، Vikinsson ، S. ، Rodrigo-Perez ، S. ، Green ، H. ، Rasmussen ، LJ ، Murga ، M. ، Nussenzweig، A.، and Fernandez-Capetillo، O. تقلل جرعة Rrm2 الزائدة من تكسر الموقع الهش وتطيل بقاء الفئران المتحولة لـ ATR. تطوير الجينات. 29 (7): 690-5. 2015.

Barlow، J.H and Nussenzweig، A. بدء النسخ المتماثل وعدم استقرار الجينوم: مفترق طرق لتوليف DNA و RNA. علوم الحياة مول الخلية. 71 (23): 4545-59. 2014.


Adductomics: توصيف التعرض للمركبات الكهربائية التفاعلية

لفهم الأسباب البيئية للمرض ، هناك حاجة إلى طرق غير متحيزة لوصف المجسم البشري ، والذي يمثل جميع المواد السامة التي يتعرض لها الناس من المصادر الخارجية والداخلية. نظرًا لأنها تقوم بتعديل الحمض النووي والبروتينات المهمة بشكل مباشر ، فمن المحتمل أن تكون المواد الكهربية التفاعلية أهم مكونات المعرض. يمكن وصف التعرض للمركبات الكهربائية التفاعلية عن طريق قياس المقاربات من التفاعلات بين المواد الكهربية المنتشرة والمحبون للنيوكليوفيلات في الدم. نحن نعرّف `` adductome '' على أنه مجموع هذه المقاربات مع هدف نووي معين. بسبب وفرتها ومدد إقامتها الأكبر في دم الإنسان ، فإن مقربات الهيموجلوبين (Hb) وألبومين المصل البشري (HSA) مفضلان على تلك الموجودة في الحمض النووي والجلوتاثيون لتوصيف المقاربات. في الواقع ، تقدم النقطة الساخنة المحبة للنواة التي تمثلها مجموعة السلفهيدريل الحرة الوحيدة في HSA (HSA-Cys (34)) مزايا خاصة للتجارب المقربة. على الرغم من أن المقاربات المستهدفة لـ HSA-Cys (34) قد تم رصدها لعقود من الزمن ، لم يتم الإبلاغ عن طريقة غير متحيزة إلا مؤخرًا لتصور HSA-Cys (34) "subadductome". تعتمد الطريقة على تطبيق جديد لقياس الطيف الكتلي ، يُطلق عليه مراقبة التفاعل المختار بخطوة ثابتة (FS-SRM) ، لملف تعريف Cys (34) في خلاصات تجريبية لـ HSA. هنا ، نقوم بمراجعة الأدبيات بشكل انتقائي فيما يتعلق بإمكانية التقريب لتوضيح جزئي للمعرض البشري ، مع إيلاء اهتمام خاص لـ HSA-Cys (34) subadductome.

حقوق النشر © 2011 Elsevier Ireland Ltd. جميع الحقوق محفوظة.

الأرقام

مستويات HSA تضاف لأكسيد البنزين (BO-Alb) و 1.4-benzoquinone (1،4-BQ-Alb) مقابل التعرض ...

يتعرض البشر لرد الفعل ...

يتعرض البشر لمركبات كهربائية تفاعلية ومن المحتمل أن تكون سامة من كل من ...

مخطط التنميط HSA-Cys 34 ...

مخطط لتنميط HSA-Cys 34 adducts (Li et al. ، 2011). راتنجات تقارب ثيول ...

تم اكتشاف HSA-Cys 34 adducts في ...

HSA-Cys 34 adducts المكتشفة في HSA المؤرشفة من موضوعات مرتبة حسب العرق والجنس ...


10.2: تصور وتمييز الحمض النووي - علم الأحياء

دورة الخلية هي العملية التي من خلالها تنمو خلايانا وتنقسم بطريقة منظمة ومسيطر عليها بعناية. دورة الخلية غير المنضبطة هي السمة المميزة الأساسية للسرطان ، حيث يؤدي النمو المفرط للخلايا إلى آثار ضارة على مستوى الأنسجة والأعضاء. يعد نظام Ubiquitin Proteasome System (UPS) مسؤولاً عن تدمير البروتينات غير المرغوب فيها في الخلية ، ولكن تم تحديده أيضًا ليكون له دور تنظيمي في عدد لا يحصى من العمليات الخلوية. هدفت هذه الأطروحة إلى دراسة دورة الخلية ونظام يوبيكويتين البروتياز باستخدام مناهج عالية الإنتاجية وعالية المحتوى.

كان النهج الأول يهدف إلى مراقبة التقلبات الذاتية للـ mRNA والبروتينات والفوسفورات والتجزئة داخل الخلية على مدار دورة الخلية ، وكيف يتم تنظيم هذه الأنظمة وتنسيقها طوال دورة الخلية ، الموضحة في الدراسة الأولى والثانية. بصرف النظر عن توصيف أنماط تذبذب دورة الخلية للنصوص والبروتينات وأحداث الفسفرة وتغييرات التوطين تحت الخلوي ، تم إجراء مزيد من التحقيق في الديناميات بين التنظيم النسخي والبروتيومي من خلال مقارنة أنماط التذبذب لأزواج mRNA والبروتينات المقابلة.

هدفت الطريقة الثانية إلى التحقيق في كيفية تأثير واحدة من أكبر عائلات الإنزيم في البروتين البشري ، UPS ، على دورة الخلية والاستجابات لتلف الحمض النووي الخارجي والداخلي. تم ذلك من خلال توصيف النمط الظاهري بعد إسكات الجينات التي تتألف منها الأسرة في دراسة تصوير عالية المحتوى ، الدراسة الثالثة. كشفت النتائج عن العديد من جينات UPS الجديدة باعتبارها ضرورية للتقدم السليم خلال دورة الخلية والحفاظ على سلامة الحمض النووي. من خلال الجمع بين أنظمة المراسل المتعددة في دراسة واحدة عالية المحتوى ، يمكن إجراء الارتباطات بين دورة الخلية والحيوية والأنماط الظاهرية للاستجابة لأضرار الحمض النووي. كشف هذا عن ميل متزايد لاعتقالات دورة الخلية G1 / S-phase بعد ظهور علامات تلف تلقائي للحمض النووي ، وإثراء اعتقالات دورة الخلية G2 بعد فشل تجنيد 53 نقطة أساس في الانقطاعات المزدوجة.

بصرف النظر عن توفير موارد البيانات ونتائج بيولوجيا النظام فيما يتعلق بالتفاعل بين العمليات الخلوية المختلفة ، حددت الدراسات أيضًا جينات وبروتينات معينة في أدوار جديدة فيما يتعلق بهذه العمليات الخلوية الأساسية. في الدراسة الثانية ، تم اكتشاف بروتين ميثيل ترانسفيراز MAT2A لتغيير التوطين الخلوي بالتزامن مع دورة الخلية ، ومن الممكن توفير مصدر أعلى لمجموعات الميثيل اللازمة خلال المرحلة S و G2-phase. في الدراسة الرابعة ، تم التحقيق في E3 ubiquitin ligases ARIH1 و ARIH2 للتأثيرات على تكاثر ونمو الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال. حددت الدراسة الثالثة عالية المحتوى العديد من جينات UPS الجديدة مع عدد لا يحصى من دورة الخلية والأنماط الظاهرية لتلف الحمض النووي ، من بينها محول E3 ubiquitin BTBD1. تسبب إسكات BTBD1 في ظهور أنماط ظاهرية مثيرة على دورة الخلية واستجابات تلف الحمض النووي ، وتم تمييز BTBD1 وتحديده على أنه ضروري للوظيفة المناسبة لـ DNA topoisomerase TOP1.

خلال هذه المشاريع ، من أجل التحقق من صحة النتائج الجديدة ، تم تطوير طرق للتحكم في مستويات التعبير الجيني المحددة ، باستخدام إسكات shRNA و CRISPR / Cas9 بوساطة وكذلك طريقة مرنة للتعبير المفرط. تم وصف هذه الأنظمة في الدراسة الرابعة.

تجمع الدراسات المقدمة بين مناهج المحتوى العالي والإنتاجية العالية وطرق التحليل والتصور الجديدة لاستخلاص المعلومات من البيانات المعقدة ، لتلخيص التفاعلات بين الرنا المرسال والبروتينات والوظيفة ، ولكن أيضًا لتحديد المنظمين الجدد للعمليات الخلوية القاعدية.


شاهد الفيديو: تعريف المرحلة الجنينية. (أغسطس 2022).